T细胞疫苗诱导异种胰岛移植免疫耐受的实验研究

目的体外制备供体特异性T细胞疫苗（T cell vaccine）,探讨T细胞疫苗免疫（T cell vaccination）诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的作用。方法腹腔注射链脲佐菌素诱导建立Balb／c小鼠Ⅰ型糖尿病模型,用酶消化法和密度梯度离心法无菌分离纯化Wistar大鼠胰岛细胞。制备Balb／c小鼠针对Wistar大鼠的T细胞疫苗：实验随机分为三组,G1：糖尿病小鼠对照组;G2：胰岛细胞移植组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞移植＋1640培养液（对照组）;G3：胰岛细胞移植加T细胞疫苗免疫组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞＋T细胞疫苗（实验组）,于d1,d7,d14,d21实验组Balb／c小鼠接种TCV（1×107／mL）,对照组用1640替代。接种前和每次接种后第5d分别进行混合淋巴细胞反应。胰岛细胞移植：将Wistar大鼠的胰岛按1200。1500IEQ／kg经肝门静脉导入小鼠体内,移植后观测血糖和体重变化。结果异种胰岛细胞移植可以诱导I型糖尿病小鼠血糖降至正常水平且维持一段时间,对照组小鼠移植后（5．12±1．36）d即发生排斥,实验组移植物存活时间达（20．25±3．45）d。结论TCV能够有效延长异种胰岛移植物的存活时间,是一种潜在诱导异种胰岛移植免疫耐受的方法。     

胰岛素泵治疗对初诊2型糖尿病的临床观察

目的 探讨胰岛素泵治疗对初诊2型糖尿病患者血糖控制及改善胰岛β细胞功能的影响.方法 对45例初诊2型糖尿病患者进行两周胰岛素泵治疗,观察治疗前后血糖及胰岛β细胞功能,随访3个月并统计分析.结果 治疗后,血糖和胰岛素抵抗指数较治疗前明显下降,胰岛β细胞功能明显改善.结论 对初诊2型糖尿病患者,胰岛素泵治疗具有快速稳定降糖和显著改善胰岛β细胞功能的作用.     

NKG2D mAb对自发性NOD小鼠同种胰岛移植的作用研究

目的 探讨NKG2D mAb能否单独作为共刺激信号阻断剂延长自发性非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠移植移岛的有功能存活期;NKG2DmAb和CD154mAb是否有协同作用.方法 将分离、纯化的BABL/c小鼠胰岛植入自发糖尿病的NOD小鼠左肾包膜下,移植成功的小鼠分成4组:对照组,NKG2D mAb治疗组,CD154 mAb治疗组和联合治疗组(NKG2D mAb+CD154 mAb).通过小鼠尾静脉血监测血糖,记录胰岛移植物有功能存活期;胰岛移植物所在肾脏行HE染色和CD3、CD4、CD8免疫组织化学染色.结果 NKG2D mAb治疗组移植物有功能存活期无延长(5～11 d,对照组6～11 d,两者差异无统计学意义),CD154 mAb治疗能明显延长移植物有功能存活期[20～64 d,中位期41 d,和NKG2D mAb治疗组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)],联合治疗组较CD154 mAb治疗能延长移植物有功能存活期(23～84 d,中位期51 d,但差异无统计学意义).各组发生排斥时胰岛移植所在肾脏均见淋巴细胞浸润,CD3、CD4、CD8染色结果无明显差异.结论 CD154 mAb能明显延长NOD小鼠胰岛移植物有功能生存期;单独使用NKG2DmAb治疗,不能延长胰岛移植物有功能生存期;联合治疗有效,但仍不能诱导移植物长期存活.     

人类巨细胞病毒感染致1型糖尿病机制的初步探讨

目的通过对1型糖尿病患者的HCMV感染标志物、空腹血糖、空腹C肽、胰岛素自身抗体及抗胰岛细胞抗体的研究,初步探讨HCMV致1型糖尿病的机制。方法检测1型糖尿病患者的HCMV感染标志物（包括HCMV—IgG及其相对含量、HCMV—IgM及HCMV—pp65）、空腹血糖、C肽、抗胰岛素自身抗体及抗胰岛细胞抗体并进行统计学分析。结果HCMV感染与1型糖尿病患者抗胰岛素自身抗体之间无明显相关性,但与1型糖尿病患者空腹血糖、空腹C肽、抗胰岛细胞抗体存在明显的相关性,HCMV—pp65阳性的1型糖尿病患者中其空腹血糖明显高于该指标阴性者;抗HCMV—IgG阳性的1型糖尿病患者空腹血糖水平、抗胰岛细胞抗体均显著高于抗HCMV—IgG阴性者,而空腹C肽水平则明显低于抗HCMV—IgG阴性者,且抗HCMV—IgG抗体指数在4．1以上者,其抗胰岛细胞抗体阳性率显著高于抗HCMV—IgG抗体指数在4．0以下者。结论HCMV感染可能通过直接损伤胰岛免疫病理反应损伤胰岛细胞最终导致1型糖尿病的发生。     

可溶性小鼠CD83-Ig对同种胰岛β细胞在糖尿病模型小鼠体内存活的影响

目的 研究可溶性小鼠CD83-Ig对NIT-1细胞在同种异基因糖尿病模型小鼠体内存活时间的影响.方法 将表达小鼠CD83胞外功能区和人IgGlαFc融合基因的真核表达载体pmcD83-hIg转染COS-7细胞,取细胞培养上清液制备CD83-Ig融合蛋白.采用链尿佐菌素(STZ)诱导法制作BALB/c小鼠糖尿病模型,并移植胰岛细胞系NIT-1进行治疗,同时在NIT-1移植的-1,1和3 d输注CD83-Ig,并观察输注CD83-Ig对NIT-1在糖尿病模型小鼠体内存活时间的影响.结果 移植NIT-1后第3天各组小鼠血糖均恢复至正常水平;移植物NIT-1细胞在输注CD83-Ig组小鼠体内的存活时间为18 d,较在输注入IgG组和PBS组小鼠体内的存活时向(均为9 d)明显延长;输注CD83-Ig组小鼠平均存活时间为(44.50±6.41)d,而输注人IgG组和PBS组小鼠存活时间分别为(29.86±4.18)d和(30.71±4.49)d.结论 CD83-Ig融合蛋白可延长小鼠胰岛β细胞在同种异基因糖尿病小鼠体内的存活时间,可能是一种用于治疗移植排斥反应的较好的免疫抑制剂.     

人胰岛提取物与大鼠β肿瘤细胞具有共同抗原决定簇

鉴定抗大鼠β肿瘤细胞系Rin5F细胞膜单克隆抗体所结合的胰岛特异性抗原。采用匀浆后超速离心的方法提取动物胰腺及胰岛细胞膜蛋白。经SDS-PAGE、电转移后，分别与大鼠β肿瘤细胞系Rin5F细胞膜单克隆抗体1A2(第一抗体)和羊抗鼠(第二抗体)反应。用放射自显影、Dot blot、western blot方法显示结果。除单抗1C7以外的其他6株抗大鼠β肿瘤细胞系Rin5F细胞膜单克隆抗体能与正常大鼠胰腺提取物不同成分结合。其中单抗1A2能与大鼠、狗、猪、猴、人的胰腺提取物及人、猪胰岛提取物不同分子量的抗原结合。大鼠β肿瘤细胞系Rin5F细胞与正常大鼠胰腺有共同的抗原决定簇。单抗1A2所结合抗原在不同动物胰腺，尤其是在人和猪胰岛上具有共同抗原决定簇。为1型糖尿病自身免疫发病机制及临床前早期诊断带来了新的希望。     

同种异体胰岛细胞移植在糖尿病小鼠中的实验研究

目的 通过建立糖尿病小鼠模型,观察同种小鼠胰岛细胞移植前后血糖、胰岛功能的变化,探索胰岛细胞分离、纯化、移植的方法及有效性.方法 采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)复制糖尿病小鼠模型,经胆囊注入V型胶原酶水浴消化胰腺并进行密度梯度离心以分离纯化胰岛细胞,并在消化液和Ficoll分离液中加入了大豆胰酶抑制剂(STI)和牛血清白蛋白组份V(BSA),用双硫腙(DTZ)法判定胰岛纯度,锥虫蓝排斥试验评估胰岛存活率;糖尿病小鼠行同种异体胰岛细胞移植后,检测受体血糖、胰岛素及C肽变化,以判定胰岛功能.结果 糖尿病小鼠模型胰腺形态有明显病理变化,同种小鼠胰岛纯化后细胞形态完好,使分离纯化后的胰岛产量由原来方法的(40.7±13.2)个提高到了(263.5±32.I)个(P<0.01),活性在95%以上,胰岛移植后,实验组48 h后血糖明显下降,C肽水平上升.结论 采用加用STI、BSA小鼠胰岛细胞分离纯化方法可增加胰岛细胞产量,同种小鼠胰岛细胞移植能明显降低糖尿病小鼠血糖水平,改善胰岛功能,从而达到治疗目的 .     

同种胰岛细胞移植的最佳移植数量研究

目的 探讨同种胰岛移植最低胰岛细胞有效数量,为临床高效利用有限的胰岛细胞提供实验依据. 方法 同种胰岛来自SD大鼠,原位灌注切取胰腺,用胶原酶Ⅴ消化胰腺组织,Ficoll400密度梯度离心纯化得到胰岛细胞,DTZ染色进行胰岛细胞计数及纯度鉴定、AO-PI荧光染色进行活性鉴定,采用体外胰岛素释放试验鉴定胰岛功能.大鼠一次性静脉注射STZ 60 mg/kg诱导Ⅰ型糖尿病模型,然后按照移植的胰岛细胞数量不同随机分为:A组(6 000 IEQ/kg)、B组(9 000 IEQ/kg)、C组(12 000 IEQ/kg) 、 D组(15 000 IEQ/kg).经门静脉途径进行胰岛移植.观察移植后连续10 d的血糖变化,移植3 d后血液中胰岛素分泌水平的变化. 结果纯化后胰岛细胞收获量为(3.49±0.23)×105IEQ/kg,纯度为86%,活性为90%.体外胰岛素释放实验显示胰岛功能良好,胰岛细胞移植后,A组、B组血糖未降至正常.C、D组血糖降至正常范围,最早出现时间分别为22 h、25 h.胰岛移植3 d后,随着胰岛数量增多,受体大鼠血液中的胰岛素量随之升高. 结论 每次以12 000IEQ/kg的数量进行胰岛移植可以作为大鼠胰岛细胞移植的最低有效浓度,可以达到胰岛移植的最佳效果也可以最大程度地利用有限的胰岛细胞.     

情绪应激对NOD小鼠血糖、胰岛炎及胰岛内细胞凋亡的影响

目的探讨情绪应激在NOD鼠 1型糖尿病发生中的作用及可能机制。方法采用饮水焦虑冲突应激及限制应激合用 ,对 2月龄NOD小鼠进行急性应激作用 ,研究应激 1d ,2d及 3d后 ,小鼠的情绪性、血糖、胰岛炎及胰岛内细胞凋亡水平与对照组之间的差异和时间趋势。结果应激 1d后小鼠情绪唤醒和血糖水平即升高 ,从开始的 (2 .0 0± 1.41)mmol/L和 (3 .2 7± 0 .70 )mmol/L上升至 (4 .67± 1.3 7)mmol/L和 (8.68± 4.63 )mmol/L ,并随着应激时间的延长有逐步下降的趋势。而胰岛炎和胰岛细胞凋亡水平则随着应激时间的延长逐步升高 ,平均每胰岛的胰岛炎积分从 0 .16逐渐上升到应激 3d后的 0 .75 ,平均每胰岛凋亡细胞个数则从对照组的 0 .82± 0 .93上升为 3 .93± 1.0 5 (应激 1d)、5 .72± 3 .90 (应激 2d)、5 .77± 2 .75 (应激 3d)。结论 1、2、3d的饮水焦虑冲突应激及限制应激可增加NOD鼠胰岛炎和胰岛细胞凋亡水平 ,从而可能促进 1型糖尿病的发生     

细胞免疫在异种胰岛移植排斥反应中的作用

虽然胰岛移植作为治疗 1型糖尿病的一种手段已获成功[1] ,但不能长期维持其效果 ,主要是移植后排斥反应。为了更深入的了解T细胞亚群在胰岛异种移植中的作用 ,我们把成年猪胰岛分离纯化后移植给经链脲佐菌素 (STZ)诱发的糖尿病小鼠 ,探讨细胞免疫在排斥反应中的作用。1　材料与方法1.1.　实验动物　昆明系小鼠 18～ 2 1g,由 (吉林大学动物部提供 ) ,成年杂种猪 (长春市郊区屠宰厂提供 )。1.2　主要试剂　STZ(购于sigma公司 )。抗小鼠CD4、CD8单克隆抗体 ,(北京大学基础医学院免疫系单克隆抗体研究室 )。胶原酶 (由吉林大学地方病研究所…