SEN病毒中国分离株基因克隆及序列分析

目的：测定SENV-D亚型中国分离株的基因组序列，并对其进行初步分析。方法：根据国外已发表的SEN病毒基因序列设计特异性引物，应用套式PCR方法从一份非甲-非戊型(non-A-E)肝炎患者血清中，分段扩增了包括SENV-D型所有编码区(ORFs)长3175bp的DNA片段，将其克隆到T载体后测序。结果：测序结果经BLAST软件分析，与国外发表的3株D型SEN病毒SENV-D(AX025730)，SENV-D(AB059352)，TTV(AB028668)的核苷酸序列同源性分别为90％，88％和91％；与2株D型SEN病毒SENV-D(AX0Z5730)，TTV(AB028668)0RF1所编码蛋白的氨基酸同源性分别为93％和92％。ORF1蛋白中含有Rep蛋白(在病毒复制中起作用的一种蛋白)的两个保守基序，此外还有一个保守的ATP／GTP结合基序(P-loop)以及若干个高度保守的蛋白激酶磷酸化位点。结论：测定得到了SENV-D亚型中国分离株的基因组序列，有助于其检测方法及致病性的研究，并为研究SEN病毒的进化地位提供方便。     

中国人TTV部分基因的克隆及序列测定

目的：了解我国人群中是否存在ＴＴ病毒（ＴＴＶ）感染，分析国内ＴＴ病毒株基因结构特点。方法：用ＰＣＲ方法检测血清标本中ＴＴＶ ＤＮＡ，对ＴＴＶ ＤＮＡ阳性的标本进行序列测定。结果：１０例临床诊断为非甲至非戊型肝炎病人血清标本中，用ＰＣＲ方法检测出５例为ＴＴＶ ＤＮＡ阳性。将其中的一株命名为ＴＴＶＣＨ１（ＴＴＶ中国株１）并进行序列测定，该序列与日本ＴＴＶ部分基因（ＣＬＯＮ２２）相对位置的核苷酸同源性为     

SEN病毒H亚型中国株流行病学及进化研究

目的：了解SEN病毒H亚型中国株的流行病学特点及其进化地位。方法：结合已知的基因序列设计引物，建立了半套式PCR检测方法，对58份献血者血清样本和25份non-A-E肝炎患者血清样本进行了SENV-H亚型的检测，并对部分阳性血清的PCR产物进行克隆测序。结果：检测结果显示无偿献血者中SE-V-H亚型感染率为34％，在non-A-E肝炎患者中SENV-H亚型感染率为24％，两者间无显著差异；但在无偿献血者中的阳性检出率大大高于国外报道。测序结果经BLASTP软件在GenBank中检索表明，各测序株均与已知的SENV-H株序列有较高的同源性，并在此基础上用MegAlign软件进行进化树分析。结论：建立的半套式PCR检测方法适用于SEN病毒H亚型检测；SENV-H亚型中国株之间以及与已发表的国外SENV-H株序列之间都有较大的变异。与无偿献血者相比，non-A-E肝炎患者血清SENV-H株无进化上的显著倾向性。     

中国人庚型肝炎病毒（HGV）部分基因的克隆和cDNA序列测定

中国人庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）部分基因的克隆和ｃＤＮＡ序列测定周育森王海涛唐时幸王竟陈薇赵秋敏张习坦军事医学科学院微生物学流行病学研究所北京１０００７１在急、慢性输血后肝炎、散发性肝炎及暴发性肝炎中，有相当比例的病人用现有甲、乙、丙、丁、戊型肝炎的诊断...     

中国人庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定

首次报道了中国人庚型肝炎病毒基因ｃＤＮＡ的克隆及序列测定。中国庚型肝炎病毒基因全长为９１２８个核苷酸，编码一个长度为２８７０个氨基酸残基的多聚前体蛋白。     

我国戊型肝炎病毒组织培养分离株的RT—PCR及序列分析

我国戊型肝炎病毒组织培养分离株的ＲＴＰＣＲ及序列分析黄如统中园直树＊石井庆藏＊＊川俣治＊＊军事医学科学院微生物学流行病学研究所北京１００８５０我国新疆戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）８７Ａ株的组织培养分离和一系列的理化生物学、形态和形态发生学、生化特性、核酸杂...     

Wistar大鼠c-ski基因部分序列的克隆、测序及实时荧光定量PCR的建立

目的 测定Wistar大鼠c-ski基因部分序列,并应用于检测大鼠c-ski基因表达的实时荧光定量PCR的建立.方法 提取培养的Wistar大鼠皮肤成纤维细胞总RNA,通过RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到PMD-18T载体上并测序.根据获得的c-ski基因部分序列设计实时荧光定量PCR引物,建立SYBR green定量PCR检测方法,并检测培养的大鼠皮肤成纤维细胞c-ski mRNA表达水平.结果 获得的Wistar大鼠c-ski基因cDNA序列长561bp,为未曾报道的新序列,其与人、小鼠具有较高的同源性,Gen-Bank收录(收入号DQ409171).建立的SYBR green定量PCR检测标准品在103～109拷贝范围内的相关系数为0.991 49.体外培养的Wistar大鼠皮肤成纤维细胞样晶中c-ski mRNA水平为(1.024±0.18)×106拷贝/μl.结论 新获得了Wistar大鼠c-ski基因部分序列,该序列可用于实时荧光定量PCR的建立.     

我国戊型肝炎病毒（87A株）基因的克隆及初步鉴定

在对经２ＢＳ细胞培养直接自病人粪便分离的戊型肝炎病毒８７Ａ株进行生物学、血清学及病原学等鉴定的基础上，为了查明该株病毒基因的组成与特点，特将纯化病毒ＲＮＡ反转录合成双链ｃＤＮＡ，酶切及接臂后重组入载体ｐＢＲ３２２中，点杂交后获得２５个阳性重组。     

5种虫媒病毒基因组部分核苷酸序列的测定及同源性比较

目的 :从分子水平对引进的 5种虫媒病毒 :马雅罗病毒 (MAY)、西门利克病毒 (SFV)、墨累谷脑炎病毒(MVE)、伊利乌斯病毒 (ILH)和布尼安姆韦拉病毒 (BUN)进行鉴定。方法 :提取病毒基因组RNA ,用逆转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)进行 5种虫媒病毒目的片段的cDNA扩增 ,将获得的片段分别克隆于pGEM_T_Easy载体 ,进行测序和同源性分析。结果 :测得的病毒基因组核苷酸序列与相应病毒的序列同源性最高 ,分别为MAY 97% ,SFV 99% ,MVE 99% ,ILH 99%和BUN 98%。结论 :通过对 5种病毒基因组部分核苷酸序列的测定及同源性比较 ,最终将这 5种虫媒病毒鉴定到种     

丙型肝炎病毒河北定州株C33c基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

采用反转录ＰＣＲ方法从河北定州地区献血员血清中克隆了丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）的Ｃ３３ｃ抗原基因，序列分析结果表明，该株的Ｃ３３ｃ基因和中国泰安株的同源性为９１．０％，氨基酸序列同源性为９２．２％；与ＨＣＶ河北株的同源性分别为９１．３％和９６．２％；和日本ＪＫ１株的同源性分别为９１．６％和９４．８％。克隆的基因在大肠杆菌中得到表达和纯化，并可用作抗ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂的抗原组分     

人肝癌细胞中端粒酶RNA的克隆及序列分析

目的：比较不同组织细胞中端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）的序列，建立以ｈＴＲ为基础的肿瘤诊断与治疗新技术。方法：采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术从人肝癌细胞株（ＨｅｐＧ２）中扩增出了ｈＴＲ部分ｃＤＮＡ序列，并通过电泳的方法鉴定了其特异性。通过分子克隆技术将上述产物插入Ｔ－质粒后转化入大肠杆菌ＪＭ１０９中，经聚合酶链反应（ＰＣＲ）鉴定了插入片段的特异性及方向，最后采用自动ＤＮＡ序列分析仪分析了上述插     

幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆及论著高效分泌表达

目的 :从幽门螺杆菌 (Hp)分离热休克蛋白A基因 ,并实现在大肠杆菌中的融合分泌表达。方法 :提取Hp染色体DNA ,用PCR方法扩增hspA基因。经克隆、测序后 ,构建融合分泌表达载体 pMAL HspA ,转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达。 结果 :分离得到了高度保守的 354bp的hspA基因片段 ,并在大肠杆菌中实现了该基因的融合分泌表达。在 37℃诱导表达 3h后 ,其融合分泌表达蛋白可占细菌周质总蛋白的 66.6%。该表达带可被抗Hp的特异抗体所识别。 结论 :幽门螺杆菌hspA基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。     

多药抗药基因mdrl探针的基因克隆

多药抗药基因（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅ，ｍｄｒｌ）的表达水平与细胞的耐药性直接相关，检测ＭＤＲ１的表达水平可预测化疗的效果以及预后。用分子原位杂交的方法可检测单个细胞中ＭＤＲ１的表达水平。采用ＰＣＫ扩增方法获得了一段特异的ＤＮＡ片段，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，经ＤＮＡ序列分析证明与文献一致。此探针可用于临床标本的分子杂交检测。     

一种适合临床快速基因诊断乙肝的PCR新方法

介绍一种适合临床快速基因诊断乙肝的ＰＣＲ新方法。通过改变ＰＣＲ的循环参数，缩短反应时间，减小反应体系体积，试剂一步加入混合，使之具有了快速、微量、简便、特异、灵敏的特点，利于临床的快速基因诊断和普及应用．     

大肠杆菌aroE基因的克隆与表达

目的:克隆表达大肠杆菌莽草酸脱氢酶基因aroE,并测定其生物学活性。方法:根据大肠杆菌中aroE基因的序列设计了一对引物,利用PCR技术扩增得到aroE基因,将其克隆入高效原核表达载体pBV220,以双脱氧法进行测序,然后对该重组子利用温度诱导表达,并测酶的生物活性。结果:构建了aroE基因的克隆和表达重组子,aroE基因获得高效表达,SDS-PAGE图谱显示新增30×103蛋白带,酶活性测定结果表明奎尼酸脱氢酶的相对酶活性是5.6倍。结论:实现了莽草酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的高效表达,证明了其具有奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌种奠定了基础。     

BALB/c小鼠sIL-4受体基因克隆及腺病毒载体的构建

目的：克隆小鼠sIL-4R基因并构建sIL-4R基因腺病毒穿梭质粒，将之包装至重组腺病毒颗粒。方法：从小鼠脾脏细胞中提取总RNA，逆转录为cDNA，应用巢式PCR的方法克隆sIL-4R基因。目的基因经限制性内切酶酶切，定向克隆至腺病毒穿梭载体。利用脂质体将含目的基因的穿梭质粒与腺病毒包装质粒pJM17共同转染腺病毒包装细胞293细胞，PCR方法鉴定重组腺病毒阳性克隆。结果：BALB／c小鼠的sIL-4RcDNA序列与文献报道的小鼠sIL-4RcDNA序列同源性达98％，有9个碱基不匹配，与小鼠IL-4R的同种异型体的膜外区100％同源。293细胞出现特征性细胞病变。PCR鉴定获得重组病毒颗粒。结论：获得了小鼠sIL-4R基因和含sIL-4R基因的腺病毒颗粒，为探讨应用腺病毒介导sIL-4R蛋白治疗过敏性疾病打下了实验基础。     

EphB2受体胞外区结构域的克隆和序列测定

 目的 对酪氨酸蛋白激酶EphB2受体胞外区结构域进行克隆和序列测定.方法 从胃癌患者手术切片标本中提取RNA,进行RT-PCR,将扩增片段克隆入pUC9质粒,进行测序及酶切鉴定.结果 克隆片段序列正确.结论 为进行表达,筛选与之相互作用的蛋白,阐明其生理功能打下基础.