IRAK-4活性在脂多糖预处理减轻肝脏缺血再灌注损害中作用的实验研究

目的:观察脂多糖(LPS)预处理后白细胞介素-1受体相关激酶-4（IRAK-4）表达水平在大鼠肝脏缺血再灌注(I/R)早期的变化，探讨LPS预处理减轻肝脏缺血再灌注损害(I/RI)的相关机制。 方法:雄性SD大鼠，随机分为正常对照组，缺血再灌注组(I/R组)和LPS预处理组（LPS组）。正常对照组未予任何处理；LPS组第 1 d 经尾静脉给予脂多糖0.1mg·kg-1，第2、3、4、5 d给予0.5 mg·kg-1；I/R组给予等体积0.5 mL无菌PBS液。第 8 d，建立肝脏缺血再灌注模型。再灌注后0 min、60 min及180 min, 蛋白免疫印记法及逆转录-聚合酶链式反应测定肝组织的IRAK-4蛋白和mRNA表达水平；酶连免疫吸附法检测肝组织NF-κB活性及血清TNF-α含量。 结果:再灌注0 min, IRAK-4蛋白与mRNA表达水平依次为LPS组>I/R组>正常对照组(P<0.01), NF-κB活性以及TNF-α含量LPS组与I/R组差异无显著(P>0.05)，但均高于正常对照组(P<0.01)；再灌注后60 min及180 min，LPS组的IRAK-4蛋白与mRNA表达水平，NF-κB活性以及TNF-α含量却明显低于I/R组（P<0.01）。 结论:抑制IRAK-4表达是LPS预处理减轻肝脏I/RI的重要机制之一。     

乳酸抑制脂多糖介导的核因子-κB p65入核转录及环氧化酶-2转录

目的 探讨嗜酸乳杆菌代谢产物乳酸(LA)对内毒素(LPS)介导的NF-κB p65入核、转录及环氧化酶-2(COX-2)转录的抑制作用.方法 以体外培养的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMMVECs)为材料,设对照组、LPS组、LA预处理组和NF-κB特异性阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)预处理组4个实验组.LPS作用30min后,Western blotting检测不同实验组细胞核、细胞质内NF-κB p65蛋白水平,LPS作用9h后,实时荧光定量PCR法检测NF-κB p65、COX-2 mRNA水平.结果 LPS作用30min后,各实验组细胞NF-κB p65蛋白总量差异不显著,但LA和PDTC预处理组细胞核内NF-κB p65比例显著低于LPS组;LPS作用9h后,LA和PDTC预处理组细胞NF-κB p65和COX-2 mRNA水平显著低于LPS组.结论 乳酸具有类似NF-κB阻断剂的作用,可以抑制LPS介导的NF-κB p65入核、转录,抑制NF-κB下游靶基因如COX-2的转录,从而发挥抗炎作用.     

T0901317对apoE基因敲除小鼠肝脂质蓄积及肝固醇调节元件结合蛋白-1c表达的影响

目的本文研究肝X受体(LXR)激动剂T0901317对apoE基因敲除小鼠肝脏脂质蓄积及肝脏固醇调节元件结合蛋白1-c(SREBP-1c)表达的影响。方法52只雄性apoE基因敲除小鼠被随机分成4组:基础组(n=10)对照组(n=14)、LXR激动剂治疗组(n=14)、d.LXR激动剂预防组(n=14)。各组小鼠均被给予高脂/高胆固醇饲料喂养;基础组小鼠被赋形剂灌胃处理8周;对照组小鼠被赋形剂灌胃处理14周;LXR激动剂治疗组小鼠在前8周被赋形剂灌胃处理,后6周被T0901317灌胃处理;LXR激动剂预防组小鼠被T0901317灌胃处理14周。使用HE和油红O染色方法观察小鼠肝脏脂质蓄积情况;采用实时定量PCR和蛋白质印迹方法分别检测肝脏SREBP-1cmRNA和蛋白质的表达。结果实验结果显示LXR激动剂治疗组和预防组小鼠肝脏脂质滴较对照组明显增多,组织结构排列逐渐紊乱(P<0.05);LXR激动剂治疗组和预防组小鼠肝脏SREBP-1cmRNA和蛋白质表达上调(P<0.05)。结论LXR激动剂T0901317能增加高脂高胆固醇饲料喂养的apoE基因敲除小鼠肝脏脂质蓄积并上调SREBP-1c表达。     

LPS诱导MC3T3-E1成骨细胞增殖并增加NF-κB p65蛋白的表达

目的： 研究LPS-NF-κB信号通路在骨形成过程中的作用。方法: MC3T3-E1成骨细胞常规培养,待细胞融合率为80%时,分别加入100 μg/L和500 μg/L LPS处理6 h。流式细胞仪检测细胞周期,计算细胞DNA相对增殖指数;RT-PCR法检测LPS处理成骨细胞后NF-κB mRNA的表达;蛋白质印迹法（Western blotting）检测LPS处理成骨细胞后NF-κB p65蛋白的表达;细胞免疫荧光法检测LPS处理成骨细胞后NF-κB p65的核易位情况;电泳迁移率变动分析（EMSA）LPS处理MC3T3-E1细胞后NF-κB活力的变化情况。结果: 100 μg/L和500 μg/L LPS可诱导MC3T3-E1成骨细胞增殖;LPS处理成骨细胞后NF-κB mRNA的表达与正常组比较无显著变化（P>0.05）,而NF-κB p65蛋白的表达明显高于对照组（P<0.01）;LPS处理成骨细胞后免疫荧光法可明显观察到NF-κB p65从细胞质转移入细胞核,且EMSA结果显示LPS处理组细胞核内NF-κB结合活性增加。结论: 低浓度的LPS可促使成骨细胞增殖,此过程中并不影响NF-κB p65的基因表达水平,但能增加NF-κB p65蛋白的表达并提高细胞核内NF-κB的结合活性。     

TLR4-TRPC6在LPS致16HBE细胞内NF-κB P65表达和核转位的作用

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)和瞬时受体电位通道蛋白6(TRPC6)信号通路在细菌脂多糖(LPS)诱导气道上皮细胞16HBE内NF-κB P65表达和核转位的作用,为气道炎症的发生机制提供实验依据。方法:用LPS(1mg/L)作用16HBE细胞0、0.5、2、6、12和24 h后,分别使用RT-PCR和Western blot法检测核因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB) P65的mRNA和蛋白表达情况,并用免疫细胞化学染色法检测NF-κB P65的核转位。用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测TLR4抑制剂CLI-095(5μmol/L)对LPS(1mg/L)诱导16HBE细胞NF-κB P65表达以及核转位的影响。用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测TRPC6激动剂Hyp9(10μmol/L)对LPS(1mg/L)诱导16HBE细胞内NF-κB P65表达以及核转位的影响。结果:LPS上调16HBE细胞NF-κB P65的mRNA和蛋白表达及核转位。TLR4抑制剂CLI-095抑制LPS诱导的16HBE细胞内NF-κB P65的mRNA和蛋白表达及核转位。TRPC6激动剂Hyp9加重LPS诱导的16HBE细胞内NF-κB P65的mRNA和蛋白表达及核转位。结论:LPS通过TLR4-TRPC6信号通路诱导16HBE细胞内NF-κB P65表达和核转位。     

过表达SIRT1抑制脂多糖诱导的胰岛β细胞炎症因子表达及NF-κB信号通路激活

目的研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对脂多糖(LPS)诱导的胰岛β细胞炎症因子表达及核因子-κB(NF-κB)信号通路激活的影响。方法用LPS处理胰岛β细胞,qRT-PCR和Western blot测定细胞中SIRT1表达变化。用pcDNA3.1-SIRT1慢病毒感染胰岛β细胞,qRT-PCR检测细胞中白细胞介素-6(IL-6)mRNA和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达水平,流式细胞术测定细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、核因子-κBp65亚型(NF-κBp65)、Toll样受体4(TLR4)蛋白表达水平。结果 LPS处理后的胰岛β细胞中SIRT1表达水平降低。pcDNA3.1-SIRT1慢病毒感染可以提高LPS条件下胰岛β细胞中SIRT1表达水平。LPS处理后的胰岛β细胞中IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表达水平升高,凋亡率升高,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4蛋白表达升高。过表达SIRT1可以降低LPS条件下胰岛β细胞中IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表达水平,抑制细胞凋亡,减少细胞中Bax、cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4蛋白表达。结论 SIRT1减少LPS诱导的胰岛β细胞炎症因子表达并下调细胞中NF-κB信号激活水平。     

青蒿素减轻LPS诱导的肠上皮细胞屏障功能损伤的实验研究

目的:探究青蒿素对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠肠上皮IEC-6细胞屏障功能损伤的影响。方法:体外培养IEC-6细胞,随机分为5组:对照组、LPS(100 mg/L)组和LPS+青蒿素(30、50和100μmol/L)组,MTT法检测各组细胞毒性变化,ELISA检测各组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的变化,电阻仪检测肠上皮细胞跨上皮电阻(TER),酶标仪检测单层细胞对辣根过氧化物酶(HRP)的通透性,RT-qPCR和Western blot检测各组细胞紧密连接蛋白(ZO-1、claudin-1和occludin)以及TLR4/My D88/NF-κB mRNA和蛋白表达的变化。结果:LPS与青蒿素在本实验浓度范围对IEC-6细胞均无毒性。与对照组相比,LPS处理下,细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/My D88/NF-κB的mRNA和蛋白表达明显增加,ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表达降低。而青蒿素干预下,细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/My D88/NF-κB mRNA和蛋白表达明显降低,ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表达升高(P0.05),均呈现浓度依赖性。结论:青蒿素可能通过抑制TLR4/My D88/NF-κB通路减轻LPS诱导的肠上皮细胞屏障功能损伤。     

抑制核因子-κB对人眼角膜基质细胞分泌细胞因子的影响

目的 观察体外抑制核因子-κB (NF-κB)对人眼角膜基质细胞分泌细胞因子的影响。 方法 四甲基偶氮唑盐（MTT)法检测不同浓度的大黄素对人眼角膜基质细胞活性的影响。用脂多糖(LPS)刺激体外培养的基质细胞,将细胞分为正常对照组(n=6)、LPS组(n=24)和大黄素组(n=24)。LPS组单纯给予LPS刺激,大黄素组于LPS刺激前先用大黄素预处理30min,其余处理同LPS组。分别用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附实验（ELISA）检测LPS刺激对角膜基质细胞白细胞介素8（IL-8）基因表达和蛋白分泌的影响,Western blotting检测角膜基质细胞中κB抑制因子α(IκB-α)蛋白的表达。 结果 所用浓度大黄素对体外培养的角膜基质细胞活性无影响。与刺激前相比,LPS刺激可引起人眼角膜基质细胞IL-8 mRNA表达增加,促进IL-8蛋白分泌、下调细胞内IκB-α蛋白水平,P＜0.01差异均有统计学意义。大黄素预处理可明显抑制LPS诱导的人眼角膜基质细胞表达IκB-α,下调细胞IL-8基因表达,减少IL-8蛋白分泌,明显低于同时间点LPS组的表达,P＜0.01差异具有统计学意义。 结论 LPS可引起人眼角膜基质细胞IκB-α的降解,促进NF-κB核转位,引起IL-8表达。体外抑制NF-κB,能减少人眼角膜基质细胞分泌IL-8。     

IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号通路调节研究

目的 研究IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号调节通路,探索DC -SIGN表达的信号调控网络.方法 以佛波脂(PMA)刺激THP-1细胞24h后加入IL-4作用48 h诱导DC-SIGN的表达,并设ERK阻断剂、NF-κB阻断剂、JAK-STAT阻断剂和MAPK阻断剂处理组.用RT-PCR检测DC-SIGN的mRNA表达,Western blot检测胞质内DC-SIGN蛋白的表达,流式细胞术检测细胞表面DC-SIGN的表达.另外,提取IL-4诱导0、10、20、30、60和120 min的THP-1细胞胞质和胞核蛋白,Western blot检测不同信号通路的信号蛋白及其磷酸化蛋白的变化.结果 IL-4可以大幅提高DC-SIGN在THP-1细胞上的表达,包括mRNA和胞膜蛋白水平.在mRNA、胞质和细胞表面蛋白表达3个水平上,ERK通路阻断剂阻断效果最好,几乎完全阻断了IL-4的诱导效果,JAK-STAT和NF-κB通路阻断剂具有部分阻断效果,而p38通路阻断剂无阻断效果.信号蛋白检测结果显示,IL-4诱导0～120 min内,胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65、NF-κBp50、磷酸化IKB和磷酸化AKT随时间推移浓度逐渐升高,而p38MAPK及其磷酸化蛋白浓度无明显改变.胞核内胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65和NF-κBp50随时间推移浓度逐渐升高.结论 ERK、JAK-STAT和NF-κB通路参与了DC-SIGN启动子的活化,其中以ERK通路为主.     

匹诺塞林缓解大鼠肝细胞系BRL-3A低氧/复氧损伤

目的探讨匹诺塞林(PIN)对低氧/复氧(H/R)诱导的大鼠肝细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法将大鼠肝细胞(BRL-3A细胞系)分为正常对照组、PIN实验组、低氧复氧损伤模型组和PIN预处理组。CCK-8检测细胞存活率;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞计量术检测细胞凋亡;检测细胞培养液中谷丙转氨酶(ALT)活性;ELISA检测TNF-α和IL-1β含量;Western blot检测细胞中TLR4、IκB-α和NF-κB P65蛋白水平;RT-q PCR检测细胞中TLR4、IκB-α和NF-κB P65mRNA表达。结果在H/R条件下细胞存活率明显降低(P0.01),细胞凋亡率增高(P0.001),ALT活性升高(P0.01),IL-1β和TNF-α含量增多(P0.01),TLR4和NF-κB P65蛋白与mRNA表达水平显著提高(P0.01)而IκB-α降低(P0.05);经PIN预处理后,细胞存活率显著提高(P0.01),细胞凋亡率显著减小(P0.001),ALT活性降低(P0.01),IL-1β和TNF-α含量降低(P0.01),TLR4和NF-κB P65蛋白与mRNA表达水平明显降低(P0.01)而IκB-α升高(P0.05)。结论 PIN对H/R诱导的BRL-3A肝细胞的损伤具有保护作用,且该作用可能是通过TLR4/NF-κB信号通路实现的。