大鼠肝细胞的微载体黏附培养及其功能测定

目的 探讨一种简单获取大量高活性肝细胞的培养方法。方法 用半原位酶消化技术对ＳＤ大鼠肝细胞进行分离与微载体黏附培养,连续观察肝细胞的形态。检测肝细胞的白蛋白分泌功能和葡萄糖合成功能,并同时与贴壁培养的肝细胞比较。结果 黏附培养的肝细胞存活率,白蛋白分泌功能,葡萄糖合成功能都保持较高水平,优于贴壁培养的肝细胞。结论 微载体培养提供长时间保持高活性,高密度生长的肝细胞,为肝细胞移植,肝病防治以及生物人     

壳聚糖微载体的制备及原代大鼠肝细胞培养

目的 探讨制备壳聚糖微载体在原代大鼠肝细胞培养中的应用效果。方法 利用甲苯—四氯化碳作有机分散介质，戊二醛作交联剂，通过反相悬浮交联制备微米级的壳聚糖微载体。用其进行原代大鼠肝细胞培养，利用相差显横镜和扫描电镜对细胞形态进行观察，测定细胞的代谢活性。结果 通过对壳聚糖浓度和戊二醛用量等反应条件的优化，制成了性能优良的微载体。肝细胞在壳聚糖微载体上保持良好的球形状态，白蛋白分泌可维持7天以上，最高分泌量达到26．7μg／24h／m1。结论 壳聚糖微载体是一种优良的肝细胞培养支架。     

微载体培养人肝细胞在混合型生物人工肝系统上的应用

目的　探讨微载体培养L 0 2人肝细胞株应用于混合型生物人工肝系统 (HBLS)及其治疗实验效果。方法　采用微载体Cytodex 3培养人肝细胞 ,经简易体外灌流实验后装配成HBLS ,用于治疗急性肝衰犬 ;观察模型犬的临床体征、生存时间、生化指标以及死亡后各脏器的病理检查。结果　HBLS治疗组和对照组的平均生存时间分别为 (7 9± 2 3)h和 (3 4± 1 4 )h ,差异具有显著性 (P <0 0 5 ) ;空舱对照组生化指标呈现进行性恶化趋势 ,而HBLS组治疗过程中 ,FBI上升 ,TBIL、ALT、AST、LDH、PT指标呈下降趋势 ;肝组织的病理显示治疗组较对照组肝细胞变性坏死程度减轻。结论　微载体培养L 0 2人肝细胞株成功应用于HBLS ,能改善急性肝衰犬的状态 ,延长生命 ,具有一定的安全性和有效性。     

微载体培养L02人肝细胞应用于生物人工肝的初步研究

Ｌ0 2人肝细胞株组织学来源为人正常肝组织 ,具备一定正常肝细胞的生物功能。我们将高密度微载体培养的Ｌ0 2人肝细胞聚集体加入中空纤维生物反应器 ,构建简易体外生物人工肝装置并进行初步的应用研究。一、材料与方法1.材料 :Ｌ0 2人肝细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所 ;Ｃｙｔｏｄｅｘ3微载体为Ｐｈａｒｍａｓｉａ公司产品 ;聚羟乙基异丁烯酸 (Ｐｏｌｙ ＨＥＭＡ )及ＤＭＥＭ、ＨａｍｓＦ12培养基均为Ｓｉｇｍａ公司产品。2 .Ｌ0 2人肝细胞的微载体培养 :( 1)取 1.4ｇＣｙｔｏｄｅｘ 3,水化处理[1] ;( 2 ) 12 %Ｐｏｌｙ ＨＥＭＡ…     

微载体培养人肝细胞系作为人工肝生物材料的研究

目的 为提高人肝细胞系的培养效率和细胞获取数量。方法 本研究采用微载体细胞培养技术进行了人肝细胞系CL-1的高密度培养，动态观察细胞生长，检测肝细胞特异性功能变化。结果 CL-1在微载体Cytodex-3上生长良好，于培养的第7天达到高峰，细胞数量为2.13×10^8／100ml，白蛋白合成量71．23μg／100ml．尿素合成量23．32mg／100ml，安定转化量619．7μg／100ml，与CL-1普通培养结果比较，细胞产量是普通培养的49．3倍．而白蛋白合成量、尿素合成量及安定转化量则分别是普通培养的39．8倍、41．6倍和33．3倍。结论 微载体培养CL-1可提高培养效率和细胞数量．且具有较好的功能，微载体高密度培养CL-1可作为组合型人工肝的生物材料。     

微囊包载体肝细胞培养方式对肝细胞功能及活性的影响

目的：探讨采用海藻酸钠/壳聚糖/海藻酸钠（ACA）微囊包裹微载体的肝细胞培养方式对肝细胞功能及活性的影响。方法：设立微囊包载体组和普通单层细胞培养组;以微载体Cytodex3进行肝细胞（HL-7702）培养;选择合适时机进行ACA微囊化包裹。收集两组第1～6天的培养液,测定其中白蛋白及乳酸脱氢酶（LDH）含量;并用Calcein-AM/PI双染细胞,在荧光显微镜下观察细胞的荧光强度变化,了解细胞活性的改变。结果：观察培养6d,微囊包载体组培养液中的白蛋白含量至第4天达到峰值,之后缓慢下降;而普通单层培养组培养液中白蛋白含量至第2天达到峰值,之后迅速下降。微囊包载体组培养液的LDH含量明显低于单层培养组（P〈0.01）。微囊包载体组中活细胞的绿色荧光强度逐渐减弱,至培养第6天,显示黄绿色荧光;而单层培养组中每天有大量失活细胞悬浮于培养液中,至培养第6天,贴壁细胞数量仅占培养前的27%。结论：微囊包载体肝细胞培养方式中前期,微载体细胞培养可在较短的时间及较小的空间内实现细胞扩增;外周的微囊机构对肝细胞营养物质的供给及合成产物的排出无影响,但可阻挡大分子免疫球蛋白;两者结合有利于维持肝细胞的白蛋白分泌功能及细胞活性,是一种兼具高密度培养及免疫屏障功能的细胞培养方式,在生物人工肝中有一定的可行性。     

新型编织型生物反应器内大量乳猪肝细胞的组织化培养

目的使反应器内培养的肝细胞能在较长时间保持肝细胞的特殊功能和活力,提高生物反应器的功效并为反应器内储存和运输肝细胞提供可能.方法将新生实验型小猪肝细胞与微载体共同培养,待肝细胞与微载体充分粘附形成微载体-球形聚集体后,将其置入新型编织型生物反应器的外腔,用培养液循环式人工毛细管培养系统进行培养,在培养液内加入氯化氨、醋胺酚检测生物反应器的转化功能,行无血清培养检测肝细胞的白蛋白的合成功能,观察肝细胞的酶漏出量.锥虫蓝染色观察肝细胞的活力,电镜观察其超微结构.结果生物反应器内培养的肝细胞在1周内能保持较高的活力,并保持着较高的氯化氨、醋胺酚的生物转化及白蛋白合成功能,酶的漏出量也少.肝细胞超微结构示内质网、线粒体等细胞器丰富,核内染色体分布均匀,肝细胞间的微绒毛形成胆小管样结构.结论肝细胞与微载体及肝细胞之间的聚集,形成直径大小不等的肝细胞-微载体球形聚集体,这种由肝细胞重新结合而成的聚集体类似于体内的肝组织结构,在新型编织型生物反应器内的中空纤维网架的支持下,肝细胞聚集体均匀地分散其中,为肝细胞的生长提供了一个类似体内内环境的三维空间,因而在无氧合器供氧的情况下,肝细胞也能在1周内保持较好的形态和功能.     

Cytodex-3微载体高密度培养人肝细胞系CL-5

目的采用微载体进行高分化的人肝细胞系CL－5的高密度培养以作为生物人工肝的生物材料。方法进行CL－5的微载体均匀搅拌培养,于培养的1、3、5、7、9天进行细胞计数及培养上清人白蛋白浓度检测,并在显微镜下动态观察细胞生长情况。结果细胞密度于培养的第七天达最高峰为1.98×10~9／L,同时人白蛋白的分泌亦最高,为54.79μg。结论实验表明使用Cytodex-3微载体培养CL-5肝细胞系,可达到较高的密度,并且具有一定的分泌功能。     

微载体技术高效扩增人毛乳头细胞的培养

目的探讨用微载体培养技术进行人毛乳头细胞高效扩增的培养方法，以满足对毛乳头细胞的大量需求。方法采用Cytodex-3为培养载体进行人第3代毛乳头细胞的微载体培养，定期观察培养液颜色的变化，采用苔盼蓝染色进行活细胞计数，倒置显微镜下观察生长状况。将微载体上消化的细胞进行传统培养，观察细胞生长情况，甲苯胺蓝染色，细胞免疫组织化学染色。结果培养至第12天，微载体上细胞数量最多，并且细胞聚集成团，类似毛乳头样结构。利用这时的细胞进行普通培养，仍然表现出凝集性生长特点，细胞呈异染性，免疫组织化学染色阳性。结论利用Cytodex-3培养可以收获大量具有生物活性的毛乳头细胞。     

载体腹腔内肝细胞移植

目的肝细胞移植可替代部分肝细胞功能及介导基因治疗。腹腔肝细胞移植操作简便,损伤小,但除脾脏、门静脉外,其他部位移植肝细胞不易存活。作者介绍一种用聚羟基乙酸－胶原载体腹腔内移植同种异体肝细胞的方法。方法将聚羟基乙酸纤维制成直径１ｃｍ的棉絮状,浸入提纯的鼠尾胶原２４小时;用胶原酶灌注收获ＳＤ大鼠单肝细胞,以８×１０／ｍｌ细胞浓度植入胶原铺底的Ｃｏｓｔａｒ　５０ｍｌ斜口瓶与聚羟基乙酸－胶原载体培养９６小时,构建聚羟基乙酸－胶原载体粘附肝细胞。移植入４０％肝切除Ｗｉｓｔａｒ大鼠的大网膜内。分别于术后２周、４周、２月处死大鼠,取移植部位病检。移植２月肝细胞用异硫氢肥分离细胞总ＲＮＡ,人工合成白蛋白,Ｐ４５０ｂ寡核苷酸探针行Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交。结果肝细胞移植后２周至２月均在网膜移植部位发现肝细胞团,４周时已呈索状排列,肝细胞团周边可见细胞核大的新生细胞,并有分裂相。ＰＡＳ染色这些肝细胞内有糖原颗粒。这些移植入的肝细胞均有白蛋白,Ｐ４５０ｂ的ｍＲＮＡ表达。结论利用聚羟基乙酸－胶原载体粘附的肝细胞腹腔内移植易于存活并保持其特异基因表达,参与机体糖、蛋白代谢和生物转化功能。     

人白介素-10和EGFP双顺反子结构载体的构建及其在原代培养的豚鼠肝细胞中的表达

构建携带入IL-10和EGFP双顺反子的腺病毒载体，检测其对原代培养的豚鼠肝细胞体外转染的效力和hIL-10的体外表达水平，为下一步的肝脏基因治疗实验做准备。     

肝细胞基因转导载体系统应用进展

目的 探讨稳定、高效、低毒的基因转导载体系统在基础研究和临床应用中的重要意义。方法 采用文献回顾的方法并结合当前实验研究，对肝细胞基因转导载体系统的研究和应用进展加以综述。结果 病毒载体系统和非病毒载体系统均可实现目的基因对肝细胞的有效转导，转导效率因各载体系统生物学特性不同而各异。结论 肝细胞是基因治疗有效的靶细胞，多种与肝脏相关的遗传性疾病、恶性肿瘤、感染性疾病等均可实现靶基因的有效转导，但临床应用的安全性尚需进一步评价。     

人肝细胞的球体培养及其意义

人肝细胞的球体培养及其意义王英杰李梦东王宇明刘国栋丁健普通单层培养的肝细胞贴壁生长后，再次消化损伤大，活力显著下降，难以在肝细胞移植和生物人工肝等研究中广泛应用。作者在体外两步灌流分离肝细胞后，综合应用限制贴壁技术进行了人肝细胞球体悬浮培养的实验研究...     

乳猪肝细胞旋转培养的意义

我们采用普通培养箱对乳猪肝细胞进行旋转培养 ,旨在探讨保持肝细胞良好功能和体外大规模培养的简便方法 ,现将结果报道如下。一、材料和方法1.材料 :本地杂种小猪 4头 ,雌雄不限 ,猪龄 10～ 15ｄ ,体重 2 .5～ 2 .9ｋｇ。2 .肝细胞分离 :采用改良的原位两步胶原酶灌注法。3 .旋转培养 :分离的肝细胞用含体积分数为 10 %的新生小牛血清、2 0 0μｇ/Ｌ氢化可的松 ,2 0 0 μｇ/Ｌ肝细胞生长因子、10 μｇ/Ｌ表皮生长因子、10 μｇ/Ｌ神经生长因子、10 0 μｇ/Ｌ胰岛素、2 0 0μｇ/Ｌ先锋必、10万Ｕ /Ｌ青霉素和 10 0μｇ/Ｌ链霉素的ＲＰＭＩ 1…     

人白介素-10和EGFP双顺反子结构载体的构建及其在原代培养的豚鼠肝细胞中的表达

构建携带人IL-10和EGFP双顺反子的腺病毒载体,检测其对原代培养的豚鼠肝细胞体外转染的效力和h IL-10的体外表达水平,为下一步的肝脏基因治疗实验做准备。1材料与方法1.1材料质粒载体pUC 19、pDC 315、含有脑心肌炎病毒IRES的质粒pCLON 13、腺病毒载体pBHGE 3及腺病毒E 1区转化     

大鼠肝细胞,krpffer和Ito细胞的分离与培养

我们采用Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ体内门静灌注结合体外Ｔｙｐｓｉｎ皿内消化制备游离肝细胞。进而采用ＰｒｏｎａｓｅＥ和Ｎｙｅｏｃｌｅｎａ离心处理获－Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞和Ｉｔｏ细胞。三种细胞的产生率分别１．２×１０＾８，１．１×１０＾７和２．３×１０＾７；其细胞纯度分别为９５％，８１％和８８％；存活率都在９０％以上。作者对三种细胞原代培养过程的形态特征和生物学活性进行了观察与讨论。     

多孔明胶微载体旋转培养hMSC的研究

[目的]观察利用多孔微载体结合旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)培养人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cell,hMSC)对其增殖的影响。[方法]体外分离hMSC,扩增至第2代(P2)后分为两组。实验组采用多孔明胶微载体CultiSpher G在RCCS内进行动态培养,对照组则继续静止培养。应用倒置显微镜、扫描电镜对微载体表面的细胞粘附、生长情况进行观察,并在不同的时相点取样,行细胞计数、MTT检测,了解细胞的增殖情况。[结果]接种24 h后,大部分细胞贴附于微载体表面,随培养时间延长细胞数量增多并分泌大量基质。MTT检测及细胞计数提示细胞对数生长期较静止培养方法延长,达到生长高峰时旋转培养方法收获细胞总量为接种时10.75倍,而静止培养方法为3.19倍;细胞周期检测两种方法差别不大,大部细胞均处在S1期。[结论]Culti Spher G微载体旋转培养系统是体外扩增hMSC的有效方法,利用该系统可为工程化组织的构建提供大量特性稳定的种子细胞。