转人白细胞介素2基因人膀胱癌细胞株的建立及体外生物学特性

探讨转基因膀胱癌瘤苗的可行性。采用逆转录病毒载体Ｚｉｐ／ｈＩＬ－２将ｈＩＬ－２基因导入人膀胱癌细胞系ＥＪ细胞中，在体外建立了具有分泌ｈＩＬ－２活性的细胞株ＥＪ／ＩＬ－２。经ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测证实ｈＩＬ－２基因已整合到ＥＪ／ＩＬ－２基因组中。流式细胞仪行细胞ＤＮＡ周期分析表明ｈＩＬ－２基因的导入及表达对ＥＪ细胞的增殖无影响。免疫荧光检测发现ｈＩＬ－２基因的导入及表达不能促进ＥＪ细胞表面ＨＬＡ抗原的表达。放射线灭活后ＥＪ／ＩＬ－２细胞丧失增殖能力，但仍能维持一定水平的ｈＩＬ－２分泌活性达２周左右。从而为制备灭活的转基因瘤苗提供了初步经验。     

RNA激活上调PTEN基因表达对膀胱癌细胞增殖和凋亡影响的研究

目的 探讨通过RNA激活(RNAa)技术上调PTEN基因的表达对人膀胱癌BIU-87细胞增殖和凋亡的影响。方法 设计靶向抑癌基因PTEN启动子DNA序列互补的双链RNA分子(ds PTEN),转染入BIU-87细胞中,采用RT-PCR法及Western Blot检测PTEN基因m RNA及蛋白质的表达变化,MTT法检测BIU-87细胞增殖速度,流式细胞仪检测PTEN细胞凋亡率。结果 ds PTEN转染BIU-87细胞后能显著上调PTEN基因的m RNA和蛋白的表达,与空白对照组、阴性对照组相比,经ds PTEN作用的BIU-87膀胱癌细胞增殖受到明显抑制,凋亡率较对照组明显升高(P<0.05)。结论RNAa技术能有效激活PTEN基因,使其表达上调并抑制膀胱癌BIU-87细胞增殖,诱导细胞凋亡,为膀胱癌的基因治疗提供了新的依据和方法。     

PTEN基因对人膀胱癌细胞系BIU-87化疗敏感性的影响

目的 研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞系BIU-87化疗敏感性的影响.方法 将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定;pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞(pBp-PTEN-BIU87),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞(pBp-BIU87)和正常BIU-87细胞为对照,用RT-PCR检测PTEN的表达情况,应用MTT法分别研究转染前、后膀胱癌细胞对不同浓度抗癌药物丝裂霉素(MMC)、羟基喜树碱和吡柔比星的敏感性变化. 结果 RT-PCR证实PTEN在转染的BIU-87细胞中能稳定表达.PTEN转染后,BIU-87细胞对MMC的药物敏感性明显提高.对吡柔比星和羟基喜树碱的药物敏感性无明显变化. 结论 PTEN基因转染能提高人膀胱癌细胞系BIU-87对抗癌药物MMC的敏感性.     

人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因转染瘤苗的抗肿瘤研究

目的 建立以腺病毒为载体的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因转染瘤苗，并对其体内抗肿瘤作用进行研究。方法 应用携带有人GM-CSF基因的重组腺病毒(R-AdS)载体转染BALB／c小鼠肝瘤细胞株(H22)，体外应用酶联免疫吸附试验（ELISA法)检测GM-CSF表达水平，以GM-CSF基因转染的H22细胞进行致瘤性研究及预防性免疫保护作用的研究。结果 重组腺病毒载体能成功地介导GM-CSF基因转染H22细胞并能持续有效表达16～21天，瘤苗的辐照处理并不明显影响GM-CSF表达水平；GM-CSF基因转染瘤苗体内致瘤性显著降低，其预防性免疫治疗后能诱导小鼠产生抗原特异性免疫反应抵抗随后野生型H22细胞的攻击。结论 应用GM-CSF基因转染瘤苗进行肿瘤基因治疗具有可行性。     

靶向沉默Notch1基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨沉默Notch1基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响. 方法 将靶向Notch1的siRNA真核表达载体psiRNA Notch1-1转染膀胱癌细胞株T24和BIU-87,噻唑盐法、流式细胞术检测沉默Notch1后膀胱癌细胞生长、细胞周期和凋亡情况.RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染前后Notch1基因mRNA和蛋白表达的变化. 结果 转染后72 h,T24和BIU-87细胞G0/G1期细胞比例明显增加,分别为(80.13±2.69)%和(69.44±2.41)%,与T24对照组(23.89±1.32)%和BIU-87对照组(24.63±1.68)%比较差异有统计学意义(P值均<0.05).转染后72 h,T24和BIU-87细胞凋亡率分别为(13.75±1.23)%和(8.72±1.01)%,与T24对照组(1.28±0.14)%和BIU-87对照组(1.01±0.27)%比较差异均有统计学意义(P值均<0.05).转染后24 h细胞生长明显受到抑制,该抑制作用持续到转染后96 h.转染后72 h,T24和BIU-87细胞中Notch1基因mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05). 结论 Notch1在膀胱癌细胞株中可能起致癌作用.沉默Notch1基因能够抑制膀胱癌细胞的增殖.     

联合RNAi膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性及其增殖影响的机制

目的 观察基因芯片分析联合小型干扰(siRNA)人端粒酶RNA(hTR)及人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的影响.方法 根据siRNA设计原则和TERT、TR基因mRNA编码序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA序列并筛选出最高效抑制序列(pRNAT-TERT-Ⅲ:GTACAGGTTTCACGCATGT基因的第3229位、pRNAT-TR-Ⅲ:CGAAGGTGCCTTGGAATAT基因的第306位).构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰(RNAi)装置pRNAT-TR-Ⅲ+pRNAT-TERT-Ⅲ(脂质体法)并将其转染膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析hTR和hTERT mRNA表达(以目的基因与GAPDH拷贝数比值进行相对定量分析),端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性(测其A值),噻唑蓝(MTT)比色法检测BIU-87细胞的生长抑制(按MTT法检测转染细胞的存活率),并对联合RNAi前后进行基因芯片分析,采用RNA抽提、RNA质量检测、cRNA标记与合成、芯片杂交、化学发光检测、图像采集和数据分析,并进一步采用逆转录(RT)-PCR验证部分差异表达基因.结果 联合RNA干扰hTR及hTERT基因后,pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-Ⅲ的联合RNAi可以特异性抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株中TERT和TR表达(pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-ⅢTERT:0.300±0.033,P＜0.05;TR:0.430±0.028,P＜0.05).且联合RNAi后膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长和端粒酶活性均明显受到抑制(pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-Ⅲ:1.250±0.012,P＜0.05).联合siRNA前后进行基因芯片分析发现21个基因下调(ATM、BAX、BCL2、BCL2L1、BIRC5、CD44、CTNNB1、E2F1、JUN、MCAM、MTA1、MYC、NFKB1、NFKBIA、NME4、PNN、PRKDC、SERPINE1、THBS1、TNFRSF1A、UCC1).结论 联合RNA干扰hTERT及hTR基因能明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长;联合siRNA抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长的原因为21个基因下调所致.     

RNAi表达载体对膀胱癌细胞Livin基因表达的抑制作用

目的观察RNA干扰（RNAi）表达载体对膀胱癌BIU-87细胞Livin基因的抑制作用。方法构建针对Livin基因的RNAi质粒表达载体，脂质体法转染膀胱癌BIU-87细胞株，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot检测其对Livin mRNA及蛋白表达的影响。结果构建的表达质粒在膀胱癌BIU-87细胞株中均抑制了Livin mRNA及蛋白表达。与空白载体组细胞作对照，前者产生的小干扰RNA（siRNA）在对Livin mRNA的抑制率24、48h分别为（81．28±9．21）％、（55．88±6．27）％，蛋白抑制率24h为（64．75±7．55）％。结论RNAi表达载体可以有效地抑制膀胱癌细胞Livin基因的表达。     

PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU-87中PI3K-Akt信号通路的影响

目的 研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞BIU-87中PI3K-Akt信号通路的作用.方法 将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞(pBp-PTEN-BIU87),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞(pBp-BIU87)和正常BIU-87细胞为对照,用RT-PCR检测PTEN的表达情况.将PTEN基因的真核表达质粒转染膀胱癌细胞BIU-87(pBp-PTEN-BIU87),以BIU87细胞和pBp-BIU87细胞为对照,应用Wester blot方法 检测三组细胞P110(PI3K的催化亚单位)、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt表达的情况.结果 3种细胞P110和Akt蛋白总水平没有变化,但磷酸化P110和磷酸化Akt在PTEN转染细胞中的表达明显弱于对照组.结论 PTEN是通过对PI3K-Akt信号传导途径的负调控而抑制肿瘤的形成.PTEN-PI3K-Akt途径可能是PTEN抑癌作用的重要机制.     

人Uroplakin Ⅱ启动子用于靶向性基因治疗膀胱癌的实验研究

目的探讨利用人UroplakinⅡ(hUPⅡ)启动子进行靶向性基因治疗膀胱癌的可能性。方法将hUPⅡ启动子和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)克隆到腺病毒载体Ad5中,构建重组体pAd-hUPⅡ-TNF。转染细胞293后产生复制缺陷型的重组腺病毒,感染膀胱癌细胞系BIU-87,检测TNF-α对BIU-87细胞体外生物学行为及体内成瘤性的影响。结果成功构建pAd-hUPⅡ-TNF重组腺病毒载体,转染细胞293获得复制缺陷型重组腺病毒。BIU-87细胞经重组腺病毒感染后可产生高浓度的TNF-α,并降低BIU-87的生长速度。感染腺病毒的BIU-87培养液可抑制L929细胞的生长。裸鼠原位膀胱肿瘤动物模型实验结果表明膀胱灌注重组腺病毒48h后,裸鼠尿液含高浓度的TNF-α,4周后腺病毒组膀胱重量和体积明显低于对照组(P<0.01)。结论hUPⅡ启动子TNF-α为治疗基因的重组腺病毒可特异性使膀胱癌细胞系BIU-87产生高浓度的TNF-α,并降低BIU-87和L929细胞的生长速度。重组腺病毒可使裸鼠尿内含高浓度的TNF-α,并可抑制裸鼠原位膀胱肿瘤动物模型膀胱癌细胞的成瘤性。     

PBK/TOPK表达对膀胱癌BIU-87细胞株增殖及迁移的影响

目的 探讨PBK/TOPK在膀胱癌中的表达及其表达对BIU-87细胞株增殖及迁移的影响。方法 采用QRT-PCR及Western blot检测3例配对膀胱癌及癌旁正常组织中PBK/TOPK的表达。随后,对膀胱癌BIU-87细胞株中PBK/TOPK的表达分别干扰及过表达,通过CCK-8实验检测细胞的增殖,Transwell实验检测细胞的迁移能力。结果 结果一致表明PBK/TOPK在膀胱癌中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。干扰PBK/TOPK表达后,BIU-87细胞的增殖及迁移能力下降(P<0.05) ;而PBK/TOPK过表达后,BIU-87细胞的增殖及迁移能力增强(P<0.05) 。结论 PBK/TOPK高表达于膀胱癌,有助于膀胱癌细胞的增殖及迁移。     

LRIG1基因对膀胱癌细胞侵袭力的影响

目的探讨抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87侵袭能力的影响。方法用脂质体介导的基因转染技术,将pLRIG1-GFP质粒转染人膀胱癌细胞BIU87,用G418筛选出抗性克隆。用Boyden小室观察转染前后细胞侵袭能力的变化,并用逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）法和Western—blot检测转染前后LRIG1和表皮生长因子受体（EGFR）的mRNA和蛋白表达水平。结果转染pLRIG1-GFP后的BIU87细胞侵袭能力显著降低,LRIG1的mRNA和蛋白表达水平明显升高,而EGFR的mRNA和蛋白表达水平则显著降低（P〈0．01）。结论LRIG1对膀胱癌细胞BIU87的侵袭能力有显著的抑制作用。     

抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87生物学特性的影响

质粒转染人膀胱癌BIU87细胞，用G418（800mg／L）筛选出抗性克隆。Western blot检测转染前后LRIG1和EGFR蛋白水平的变化；MTT法绘制转染前后细胞的生长曲线；Boyden小室和同质黏附实验观察转染前后细胞侵袭和黏附能力的变化。结果转染pLRIG1-GFP组LRIG1蛋白表达水平较对照组和转染空载体组明显升高，而EGFR蛋白表达水平较对照组和转染空载体组显著降低；转染pLRIG1-GFP组细胞的生长速度较对照组和转染空载体组明显减慢；转染pLRIG1-GFP后的BIU87细胞侵袭目的研究抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87生物学特性的影响。方法用脂质体介导的基因转染技术，将pLRIG1-GFP和黏附能力显著降低（P〈0．05）。结论LRIG1是一种抑癌基因，通过参与形成EGFR的负反馈环路，对膀胱癌细胞BIU87的生长、侵袭和转移有显著的抑制作用。     

稳定表达LRIG1基因的人膀胱癌细胞株BIU87-LRIG1的建立和鉴定

目的 建立稳定表达外源性LRIG1基因的人膀胱癌细胞株BIU87-LRIG1.方法 利用脂质体介导的基因转染技术将质粒转染人人膀胱癌细胞株BIU87,实验分为3组:BIU87-LRIG1组(转染pLRIG1-GFP)、BIU87组(未转染质粒)和BIU87-neo组(转染pEGFP-N1).经用G418筛选3周后出现抗性克隆,对其扩大培养后,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分析各组中LIRG1 mRNA及其蛋白表达.结果 RT-PCR结果 表明,BIU87-LRIGl组中LRIG1 mRNA的表达水平(2.352 ±0.133)较BIU87-neo组(0.642±0.091)和BIU87组(0.516±0.045)明显升高;Western blot结果 显示,BIU87-LRIG1组LRIG1蛋白表达水平(2.120±0.113)较BIU87组(0.946±0.075)和BIU87-neo组(1.132±0.076)明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 成功建立了稳定表达外源性LRIG1基因的人膀胱癌细胞株BIU87-LRIG1.     

三氧化二砷抑制人膀胱癌细胞BIU-87体外生长的实验研究

目的：观察三氧化二砷对人膀胱癌细胞的生长抑制作用,并探讨其机制。方法：采用ＭＴＴ法检测不同浓度的Ａｓ２Ｏ３对人膀胱细胞株ＢＩＵ＿８７的生长抑制率,原位末端转移酶标记技术检测细胞凋亡,ＳＡＢＣ免疫组织化分析ＢＩＵ－８７中ｂｃｌ－２的表达。结果：Ａｓ２Ｏ３可有铲地抑制ＢＩＵ＿８７细胞生长,具有时间、浓度依赖性特点;经药物作用后,膀胱癌凋亡细胞明显增多,凋亡率随作用时间的延长而增高,ＢＩＵ－８７细胞中的     

Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响

目的:构建Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl,并检测其对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响.方法:将经同源重组产生的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度.用Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl分别感染人膀胱癌细胞BIU87及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,MTT法评估Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl对BIU87细胞生长的抑制作用.结果:当感染复数(MOI)=25时,Ad-Surp-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为74.56%,在SV-HUC-1细胞中转染率为0,差异有统计学意义(χ2=58.64,P<0.05);Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为68.27%,在SV-HUC-1细胞中转染率为72.52%,差异无统计学意义(χ2=0.075,P>0.05).Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率相比,差异无统计学意义(χ2=0.016,P>0.05).与PBS相比,Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl均能明显抑制BIU87细胞的生长,转染后第4天这一差异显著(F=15.96,P<0.05),而Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞生长速度无明显差异.结论:成功构建了含有Survivin启动子驱动LRIG1基因的重组复制腺病毒Ad-Surp-LRIGl并鉴定正确,Ad-Surp-LRIGl能选择性转染人膀胱癌细胞BIU87,在体外能明显抑制膀胱癌细胞BIU87的生长.     

逆转录病毒载体介导HSV—TK基因在膀胱癌细胞的表达和作用

应用基因工程技术构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＸＴＫ，磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７细胞，建立了重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ细胞。用病毒上清感染人的膀胱癌细胞株ＢＩＵ８７，Ｇ４１８筛选抗性克隆ＢＩＵ８７／ＴＫ细胞。提取ＰＡ３１７／ＴＫ和ＢＩＵ８７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ，用ＤＩＧ标记检测证实整合了ＨＳＶＴＫ基因，在病毒上清用ＲＴＰＣＲ检测到目的基因的转录。转导ＨＳＶＴＫ基因的膀胱癌细胞获得对ＡＣＶ的化学敏感性，给予ＡＣＶ可有效地杀伤肿瘤细胞。     

反义bcl-2 RNA促进膀胱癌BIU-87细胞的凋亡

为探讨反义ｂｃｌ２对膀胱癌ＢＩＵ８７细胞凋亡的作用，应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将插有反义ｂｃｌ２基因片段的重组逆转录病毒载体转染ＢＩＵ８７细胞，使细胞在体外标准培养条件下生长速率降低，用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果显示：Ｇ期细胞比率增高，细胞周期分析可见凋亡峰，细胞形态学观察凋亡细胞增多，ＤＮＡ凝胶电泳出现梯状电泳带。结果提示：反义ｂｃｌ２瞬时表达可促进ＢＩＵ８７细胞凋亡     

5-杂氮脱氧胞苷逆转膀胱癌细胞WIF-1基因转录表达的研究

目的 探讨去甲基化药物5-杂氮脱氧胞苷对膀胱癌WIF-1基因表达的影响及其生物学效应.方法 用5-杂氮脱氧胞苷处理膀胱癌细胞株T24和BIU87,RT-PCR检测WIF-1 mRNA表达情况,免疫细胞化学和Western blot检测WIF-1蛋白表达变化,甲基化特异性PCR检测WIF-1启动子甲基化状态变化,MTT法检测5-杂氮脱氧胞苷对膀胱癌细胞的增殖抑制作用,TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 5-杂氮脱氧胞苷处理72 h后,WIF-1 mRNA及蛋白表达明显增加,而且恢复为启动子未甲基化状态,膀胱癌细胞增殖明显抑制,FCM法检测T24和BIU87的凋亡率分别为(18.2±2.6)%和(17.3±2.7)%.结论 DNA甲基化是导致WIF-1不表达的重要原因,5-杂氮脱氧胞苷可以通过逆转WIF-1甲基化状态而恢复WIF-1表达,从而抑制膀胱癌细胞的生长并诱导细胞凋亡.5-杂氮脱氧胞苷有望成为膀胱癌的有效辅助化疗药.     

人膀胱癌耐药细胞株p53基因突变与染色体畸变的关系

目的：研究膀胱癌耐药细胞株p53蛋白表达，探讨其与细胞染色体变化特点及耐药性的关系。方法：使用药物深度递增的方法，分别采用阿霉素（ADM）或足叶乙甙（VP－16）建立了人膀胱癌耐药细胞株BIU－87／A和BIU－87／V，采用免疫组织化学的方法对比分析其和亲代细胞株p53蛋白表达情况，并用G显带法研究各株细胞染色体特点。结果：BIU－87／A对ADM、VP－16的耐药倍数分别为57．42、59．40；BIU－87／V对ADM、VP－16的耐药倍数分别为6．45、5．44。BIU－87的p53蛋白表达阴性，而BIU－87／A、BIU－87／V的p53蛋白均阳性，且BIU－87／A的表达量多于BIU－87／V。BIU－87／A和BIU－87／V细胞染色体数目为超三倍体，染色体众数分别为78、73，数目在50－113之间，大多数染色体均有数目异常，变动于1－4条之间，染色体缺失、突变、到位、易位和环状染色体等结构畸形明显多于亲本细胞。结论：膀胱肿瘤耐药细胞株p53的异常表达可导致细胞染色体畸变增加，并与细胞多药耐药性与有一定的关系。     

HSV-TK/GCV系统体外对膀胱癌细胞的旁观杀伤作用

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）基因联合羟基无环鸟苷（GCV）对膀胱癌细胞的旁观杀作作用及其机制。方法 将转染HSV－TK基因的膀胱癌细胞（BIU 87－TK）分别与人膀胱癌细胞（BIU 87、T 24）和鼠膀胱癌细胞（T 739）混合培养。在GCV作用下,观测细胞的存活情况及BIU 87－TK条件培养液和细胞死亡裂解对共培养细胞的影响。结果 当BIU 87－TK细胞占50％时,共培养细胞对GCV的敏感性与100％ BIU 87－TK细胞一致。表明每个表达HSV－TK基因的细胞能杀死至少一个不含HSV－TK基因的膀胱癌细胞。BIU 87－TK细胞的条件培养液对BIU 87亲本细胞的生长无影响。G 418诱导的细胞裂解与对其共培养的BIU 87－TK细胞无旁观毒性作用。结论 HSV－TK／GCV对膀胱癌细胞产生的“旁观者”效应是该系统特异性的毒性作用。“旁观者”效应不仅可在人膀胱癌不同细胞株之间产生,而且不局限于某一种属的膀胱癌细胞之间。