全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中分化抑制因子1表达水平的变化

目的 探讨分化抑制因子1(ID1)在全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的作用.方法 运用基因芯片、放线菌酮抑制试验、实时定量RT-PCR和Western blot.方法 检测ID1存ATRA诱导的APL细胞系及原代APL细胞分化过程中表达情况.结果 在ATRA污导的NB4细胞和APL初诊患者原代细胞分化过程巾ID1基因的表达上调,ATRA诱导NB4细胞2hID1表达达高峰,其相对表达水平与对照相比升高359.4±48.7倍;ATRA处理APL患者骨髓细胞ID1表达水平2 h达高峰,其中1例患者晕复3次检测的.结果 为对照的(311.1±48.7)倍.而且ID1基因的上调不需要其他蛋白的合成.而在ATRA处理ATRA耐药细胞系NB4-R2细胞未见ID1的表达发生明显变化.结论 ID1基因可能作为ATRA的靶基因参与了ATRA诱导的粒系分化.     

冈田酸对全反式维甲酸诱导NB4、MR2细胞分化的影响

目的 探讨丝(苏)氨酸蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抑制剂冈田酸(Okadaic acid,OKA)对全反式维甲酸(ATRA)诱导白血病细胞分化的影响,探讨PP2A活性与白血病细胞ATRA耐药的关系.方法 用ATRA、OKA、ATRA+OKA分别作用于急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞及其耐药细胞系MR2细胞,采用瑞特染色法和NBT还原实验观察细胞形态变化,流式细胞术分析细胞表面CD11b表达,丝(苏)氨酸蛋白磷酸化酶试剂盒检测细胞内PP2A活性,Western blot法检测细胞内PP2A各亚基表达.结果 ①细胞形态学、NBT还原实验及流式细胞术检测结果均显示,加入OKA抑制蛋白磷酸化酶活性能促进ATRA诱导的NB4细胞分化,并协同ATRA能诱导其耐药细胞MR2细胞发生部分分化.②酶活性分析显示,未处理的NB4细胞PPA活性为(959±83)pmol磷酸盐·min-1,μg蛋白-1;ATRA诱导NB4细胞分化过程中,PP2A活性明显下降[(534±43)pmol磷酸盐·min-1.μg蛋白-1],ATRA+OKA组PP2A活性下降更加明显[(229±23)pmol磷酸盐·min-1·μg蛋白-1];单用ATRA作用于MR2细胞,则PP2A活性无明显影响,而ATRA+OKA诱导MR2细胞分化中,PP2A活性下降.③Western blot.结果 显示,ATRA作用5d的NB4细胞中PP2A-C亚基表达较对照组明显减少,而A和B亚基表达与对照组比较变化不明显;在MR2细胞中,A、B和C亚基表达在处理组与对照组之间无明显差别.结论 ATRA诱导的NB4细胞分化过程中细胞内PP2A-C表达减少,PP2A活性降低.ATRA不能有效抑制MR2细胞内PP2A的活性,可能是MR2细胞对ATRA耐药的机制之一.     

全反式维甲酸与三氧化二砷对NB4细胞CD44v6表达的调节

黏附分子CD44v6与急性髓系白血病(AML)疾病进展密切相关。本研究探讨全反式维甲酸(ATRA)及三氧化二砷(As2O3)对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞CD44v6及其相关的PI3K/Akt信号通路的影响。应用显微镜观察检查和流式细胞术检测NB4细胞的分化;AnnexinⅤ-FITC/PI双染色流式细胞术检测NB4细胞凋亡;实时RT-PCR检测NB4细胞CD44v6 mRNA的表达;Western blot检测NB4细胞CD44v6蛋白的表达及PI3K/Akt信号通路的变化。结果显示:在ATRA诱导NB4细胞分化过程中,CD44v6的转录明显受抑制,但CD44v6蛋白表达无明显增减,PI3K/Akt信号通路被激活。在As2O3诱导NB4细胞凋亡过程中,CD44v6的转录水平及蛋白表达均明显下调,PI3K/Akt信号通路受抑。结论:ATRA与As2O3对NB4细胞CD44v6表达的影响不同。此研究结果为从干预白血病细胞和造血微环境相互关联角度进一步揭示ATRA和As2O3的作用机制奠定了实验基础。     

全反式维甲酸诱导APL细胞分化过程中钙信号途径基因表达水平的变化

为研究钙信号途径在髓系分化中的作用,采用基因芯片技术检测了钙信号途径相关基因在全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞株NB4细胞分化过程中的表达情况,并运用实时定量RT-PCR验证基因芯片部分结果,同时检测这些基因在ATRA和8-CPT-cAMP单独和联合作用于NB4-R1细胞和ATRA诱导APL初诊患者原代细胞分化时的表达情况。结果发现:在ATRA诱导NB4细胞分化过程中,许多能直接调节胞内钙离子浓度的基因发生了变化,同时发现许多钙信号途径下游的效应分子的表达上调,并得到实时定量RT-PCR验证。这些基因在ATRA和8-CPT-cAMP单独作用于NB4-R1细胞时变化不大,而在ATRA和8-CPT-cAMP联合作用于NB4-R1细胞分化时与ATRA诱导NB4细胞分化时的表达变化相似。另外,以上基因在ATRA诱导APL初诊患者原代细胞分化的变化情况与诱导NB4细胞分化时相似。结论:钙信号途径可能参与了ATRA诱导的APL细胞分化。     

罗格列酮诱导白血病NB4细胞凋亡的作用及机制探讨

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮(rosiglitazone,RGZ)时白血病NB4细胞的诱导凋亡作用及其作用机制.方法:以不同浓度的RGZ(20-80 μmol/L)作用于体外培养的NB4细胞0、24、48及72 h,应用RT-PCR法检测PPARγ的表达水平,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率.应用Western blot检测60 μmol/L的RGZ作用不同时间后凋亡抑制蛋白XIAP的表达水平,同时检测不同浓度药物作用不同时间后Caspase-3活性的变化.结果:40μmol/L以上的RGZ可显著抑制细胞的生长及诱导细胞发生凋亡,呈现出明显的量-效与时-效关系.RGZ在诱导细胞凋亡的同时.PPARγmRNA的表达水平逐渐升高.而凋亡抑制蛋白XIAP的表达水平显著下降.Western blot结果还显示Caspase-3被活化出现20 kD亚单位片段.结论:RGZ可以通过PPARγ信号途径抑制NB4细胞的生长并诱导细胞发生凋亡,下调凋亡抑制蛋白XIAP的表达水平以及激活Casapse-3可能是RGZ诱导NB4细胞发生凋亡的重要作用机制之一.     

APN/CD13对乌苯美司增强全反式维甲酸诱导急性早幼粒白血病细胞株NB4细胞分化的影响

本研究探讨细胞表面APN/CD13在乌苯美司(bestatin)增强全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞分化过程中的作用.采用四氮唑蓝还原实验检测细胞分化;Western blot检测细胞P38MAPK及p-P38MAPK蛋白表达.结果显示:APN/CD13中和抗体WM-15能够完全阻断乌苯美司对ATRA诱导分化作用的增强效应.WM-15能够部分阻断乌苯美司抑制NB4细胞P38 MAPK磷酸化的作用.100μg/ml乌苯美司呈时间依赖性抑制APL细胞株NB4细胞及MR2细胞的P38MAPK磷酸化水平,l00 μg/ml乌苯美司对CD13表达低下的K562细胞的P38 MAPK磷酸化水平无明显影响.100μg/ml乌苯美司不能恢复MR2细胞及难治复发患者原代APL细胞对ATRA的敏感性.结论:氨肽酶N/CD13抑制剂乌苯美司可能通过细胞表面APN/CD13分子的介导抑制NB4细胞P38 MAPK的磷酸化,从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用.     

CSN复合物在ATRA诱导APL细胞分化过程中的表达及其意义

目的:探索CSN复合物在急性早幼粒细胞白血病(APL)患者中的表达及其在全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞分化中的作用。方法:以NB4细胞为实验对象,通过细胞形态学观察及流式细胞术的CD11b检测以监测ATRA诱导分化;用Western blot及逆转录荧光定量PCR检测CSN复合物在细胞分化过程中的变化,并采用实时荧光定量PCR的方法检测APL患者及其治疗缓解后CSN复合物亚基的表达情况。结果:在NB4细胞中ATRA可诱导细胞CD11b表达,细胞在形态上呈明显分化特征;CSN复合物各个亚基的表达水平随细胞分化逐渐下调。APL患者中CSN表达水平明显高于非白血病患者组(P0.05),ATRA诱导缓解治疗后达完全缓解的患者中CSN的表达水平较治疗前明显下降。结论:CSN复合物在APL中高表达,ATRA可以下调CSN复合物的表达,提示CSN复合物在APL发病和治疗中发挥着重要作用。     

转染VEGF-C cDNA对NB4细胞增殖、分化与凋亡的影响

目的探讨转染血管内皮生长因子(VEGF)-C cDNA 对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞增殖、全反式维甲酸(ATRA)诱导分化及化疗药物介导的细胞凋亡作用的影响。方法采用脂质体法将重组表达载体(pcDNA3.1-VEGF-C)和 pcDNA3.1转染 NB4细胞建立稳定细胞株;采用MTT 法及集落形成实验分析转染 VEGF-C cDNA 对 NB4细胞增殖的影响;NB4/VEGF-C 细胞经 ATRA诱导后涂片经瑞特-姬姆萨染色作形态学分析,实时荧光定量 PCR 检测调控粘细胞分化基因 C/EBPα相对表达水平,同时以流式细胞术检测细胞表面的 CD11b 表达量;Annexin V/PI 双染流式细胞术检测NB4/VEGF-C 细胞经鬼闩乙叉甙(Vp16)诱导的细胞凋亡;并以实时荧光定量 PCR 检测 bcl-2基因相对表达水平,均以 NB4/pcDNA3.1细胞为对照。结果成功转染获得稳定表达 VEGF-C 的细胞株 NB4/VEGF-C,其增殖能力显著高于 NB4/pcDNA3.1细胞;NB4/VEGF-C细胞对抗 ATRA 介导的早幼粒细胞分化成熟,CD11b 表达量低于对照组,C/EBPα基因含量仅为对照组的1/32;NB4/VEGF-C 细胞经Vp16介导后 bcl-2基因表达约为 NB4/pcDNA3.1细胞的2.28倍,而凋亡的 NB4/VEGF-C 细胞百分率(7.20±2.52)%明显低于凋亡的 NB4/pcDNA3.1细胞的(16.07±3.58)%(P=0.005)。结论 VEGF-C 通过 VEGF 受体3(VEGFR-3)信号途径促进白血病细胞增殖,抑制分化诱导剂介导的 NB4 细胞分化及化疗药物介导的细胞凋亡,推测 VEGF-C/VEGFR-3信号途径在白血病疾病进展中发挥重要作用并可望作为白血病治疗的靶点。     

PADI4对NB4细胞分化过程中炎性因子表达水平的影响

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4向粒细胞分化过程中肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)的表达变化及其是否参与炎性因子的表达.方法:建立ATRA诱导的NB4细胞分化模型,采用Wright-Giemsa染色观察细胞形态学变化;采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达;RT-...     

槲皮素对白血病细胞中PML基因及蛋白表达的影响和定位的研究

目的 探讨PML基因及蛋白在白血病细胞中的表达和细胞内分布定位。方法 经全反式维甲酸（ATRA）、槲皮素处理后的NB4、HL-60、K562细胞为研究对象，细胞形态学观察采用Wright染色法及荧光染色法；PML蛋白细胞分内分布定位采用免疫荧光技术；PML mRNA表达的检测采用RT-PCR法。结果 （1）ATRA处理后，NB4和HL-60细胞形态学上出现分化表现，K562细胞无变化；经槲皮素处理后，各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变。（2）ATRA处理后，NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白恢复定位，HL-60、K562细胞内PML蛋白定位分布无变化；槲皮素处理后NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白聚积于POD结构，随后降解，在HL-60及K562细胞，PML蛋白发生相似改变。（3）ATRA、槲皮素对各组细胞PMLmRNA表达均无显著影响。结论 在不同诱导剂刺激下，PML在蛋白水平参与细胞终末分化及诱导白血病细胞凋亡机制；PML蛋白在POD中发挥诱导凋亡、控制细胞生长的作用。