标签引物-套式/多重PCR检测恶性疟原虫和间日疟原虫的研究

目的 建立简便、灵敏、低本底、可同时检测恶性疟原虫和间日疟原虫的套式/多重聚合酶链反应（PCR）系统。 方法 应用标签引物扩增技术、Primer Premier 5.0软件、美国生物信息中心(NCBI-BLAST)网络资源和矩阵试验法优化套式/多重PCR，检测疟疾患者滤纸血样并与镜检结果进行比较。 结果 新建立的标签引物套式/多重PCR，检测模拟现场滤纸血样的敏感性为恶性疟原虫1～2个虫/μl血，间日疟原虫5～10个虫/μl血。检测71份现场采集的镜检疟原虫阳性滤纸血样（恶性疟24份和间日疟47份）的结果与镜检结果的符合率分别为87.5%和100%。 结论 通过标签引物扩增技术优化的套式/多重PCR系统，适用于检测现场采集的滤纸血样，其检出低原虫血症的敏感性和鉴定虫种的准确性均优于镜检法，是很有潜力的疟疾诊断技术。     

套式/多重PCR方法应用于疟疾诊断与监测的初步评价

目的 与镜检法比较评价标签引物-套式/多重PCR（UT-PCR）在疟疾监测中的应用价值。 方法 在海南、云南省恶性疟和间日疟混合流行区和广西疟疾控制区的疟疾监测中,采集初诊为疟疾或疑似疟疾的发热患者的血片与滤纸血样400份,在双盲条件下比较镜检法与UT-PCR的初检结果,对结果不一致的血片再次镜检复查,同时对其滤纸血样重复PCR 2～3次;评估UT-PCR与镜检法的敏感性和特异性。 结果 400例发热患者血样中,镜检法初检检出疟原虫阳性234例,其中恶性疟125例,间日疟109例;UT-PCR检出疟原虫阳性235例,其中恶性疟124例,间日疟109例;恶性疟和间日疟混合感染2例。两法初检结果一致的血样占92.5%（370/400）,其中阴性154例,阳性216例（间日疟117例,恶性疟99例）。复查25份初检结果不一致的血样,包括镜检阴性PCR阳性11例,镜检阳性PCR阴性10例,镜检为恶性疟PCR为间日疟3例,镜检为间日疟而PCR为混合感染1例,其中15份与UT-PCR的初检结果一致,7份“假阳性”原因不明,仅3份为PCR的假阴性。根据复查结果评估PCR的敏感性为99.6%,特异性为98.8%。 结论 采用更敏感的UT?鄄PCR疟疾诊断方法有助于解决疟疾诊断与鉴别诊断中的疑难问题,提高疟疾监测的质量和效率。     

多重PCR种特异性检测恶性疟原虫和间日疟原虫方法的建立

目的建立恶性疟原虫和间日疟原虫种特异性检测的多蕈PCR方法,用于疟疾的检测和诊断.方法根据疟原虫18S核糖体小亚基ssRNA的基因序列设计合成8对11条引物,通过对恶性疟、间日疟患者及健康对照者血样的DNA进行扩增,选择出敏感性和特异性最佳的引物用于建立多重PCR方法,并用梯度变化的方法分别对引物浓度、复性温度、延伸温度和循环次数等反应参数进行比较分析,优化PCR反应条件.利用优化后的多重PCR埘采自云南和上海的139份疟疾患者血样和32份非疟疾患者血样进行检测,以镜检方法为金标准,分析多重PCR方法检测患者血样的敏感性和特异性.结果从8对11条引物中优选出2对共3条引物用于建立多重PCR.利用这3条引物进行多重PCR,一次反应即可完成对恶性疟原虫和间日疟原虫的种特异性鉴定.对疟疾和非疟疾患者血样检测结果显示,该方法检测患者血样的敏感性为97.8%,特异性为100%.结论多重PCR方法敏感、特异、可进行批量检测,适用于对人群的疟疾监测和疑似疟疾病例的诊断,并能鉴定恶性疟原虫和间日疟原虫虫种.     

PCR鉴别诊断间日疟及恶性疟的研究

目的 :在同一反应体系中建立能鉴别诊断间日疟与恶性疟的 PCR检测方法。方法 :根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 3个引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,在同一反应体系中 ,间日疟原虫和恶性疟原虫分别预期被扩增出 34 1bp和 4 31bp的 DNA条带。结果 :间日疟原虫和恶性疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小的 DNA片段 ,并经限制性酶切证实 ;杜氏利什曼原虫、弓形虫、健康人血及空白对照均无特异性扩增条带 ;以该检测体系至少可检出原虫血症为 2 .56× 10 ^-7间日疟原虫感染和 1.0 8× 10 ^-5恶性疟原虫感染 ;69份镜检阳性的间日疟和 2份恶性疟患者血样 PCR检测均为阳性 ,1例发热待查患者PCR诊断为间日疟 ,与镜检复查结果一致 ,所有疟疾阳性标本中未检出混合感染 ,2 0份健康人血 PCR均为阴性。结论 :该检测体系灵敏、特异 ,对于诊断间日疟和恶性疟以及鉴别间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有一定的应用价值。     

套式PCR扩增特定SSUrDNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的：用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrDNA）基因为靶基因,选用1对疟原属特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果：从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp,102bp和115bp预测大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％,并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.F.和P.m.的混合感染病例,结论本系统特异、灵敏,稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断,大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的 评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。方法 采集海南省疟疾混合感染流行区304份滤纸干血滴样本，根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列，设计合成3条引物．采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段，检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA；同时与镜检法进行比较。结果 在304份样本中，PCR法阳性15份，其中间日疟7份．恶性疟8份；镜检法阳性11份，其中间日疟6份，恶性疟5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性；镜检阴性而PCR阳性的4份样本，其扩增产物经限制性酶切鉴定，证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。结论 此PCR检测体系灵敏、特异．对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

套式PCR扩增特定SSU rRNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrRNA）基因为靶基因,选用1对疟原虫属特异性引物和4对种特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp、102bp和115bp预期大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％。并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.f.和P.m.的混合感染病例。结论本系统特异、灵敏、稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

1例国内罕见的输入性卵形疟的实验室检测

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样进行疟疾检测及分型。将PCR扩增片段进行序列测定,并与已知的卵形疟序列进行blast比对分析。结合血样的分子生物学检测结果,重新对镜检结果进行复核。结果血样初次镜检为疟疾阴性。使用疟原虫巢式PCR通用引物对血样的DNA进行PCR检测,扩增出了预期大小约240bp的条带;巢式PCR分型检测表明,血样仅扩增出预期大小约450bp的卵形疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和三日疟扩增条带产生。疟原虫通用型和卵形疟特异性的荧光PCR检测结果均为典型的S形阳性曲线,卵形疟扩增片段的熔解温度为72.5℃。序列分析表明,扩增片段长度为434bp,blast比对发现去除引物后的393个碱基与GenBank DQ845247等卵形疟的SSU rRNA对应部分的基因序列同源性为100%。重新对血涂片进行镜检复核,结果在薄血膜中发现了卵形疟的环状滋养体,被寄生的红细胞为椭圆形,边缘呈伞矢状。结论使用巢式PCR、实时荧光PCR、序列分析和镜检等方法,证实该例输入性的疑似疟疾患者为卵形疟原虫感染。     

疟疾复合PCR检测系统的建立

目的：建立简易、快速的复合ＰＣＲ系统,用于检测间日疟、恶性疟及混合感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计疟原虫属特异性上游引物Ｓ１和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物Ｓ２和Ｓ３,建立双温度点复合ＰＣＲ扩增系统并用于临床血样的检测。结果：从间日疟原虫和恶性疟原虫感染血样中分别扩增出７０５ｂｐ和５７５ｂｐ特定扩增带,而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及健康人血样均未见扩增带。检测原虫水平达２－１０虫／μｌ全血。限制性内切酶酶切分析证实扩增产物为目的片段。检测１０４份镜检确诊疟疾患者血样,其中８１份与镜检结果相符,并查出镜检未发现的１７份混合感染和２份虫种鉴别失误的恶性疟。结论：本系统敏感性高,特异性强,操作简便,可在一次扩增中同时检出间日疟和恶性疟两种原虫。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的　采用套式 PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。　方法　采用已建立的套式 PCR系统扩增 SSU r DNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的 6份血样 ,并设阳性与阴性对照。　结果　间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出 10 4 bp、10 2 bp和 115 bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫 DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。 6份血样中检出 4份 P.v.、P.f.和 P.m.的混合感染 ,1份 P.v.和 P.f .及 1份 P.f .和 P.m.的混合感染。　结论　该系统特异、灵敏、稳定 ,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染 ,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

PCR检测Pf60.1基因诊断恶性疟实验方法研究

为探讨通过PCR技术检测Pf60.1基因来诊断恶性疟的可行性,采用PCR技术检测了4年前采集贮存的20例疑似疟疾病人的血样。阳性对照为恶性疟原虫FCC1／HN培养株;阴性对照为食蟹猴疟原虫、间日疟原虫及非疟区的正常供血员血样。结果为FCC1／HN株、12例镜检定为恶性疟和2例混合感染的血样扩增出长度为313bp～320bp的特定Pf60.1基因片段;而阴性对照均未产生DNA带型。此结果说明检测Pf60kD中的Pf60.1基因片段的方法稳定性好,特异性强和敏感性高,是恶性疟诊断的理想方法之一。     

复式PCR检测间日疟原虫和恶性疟原虫的现场应用

目的探讨复式PCR方法在疟疾诊断中的现场应用价值。方法根据疟原虫18 S rRNA基因序列,合成疟原虫属特异性上游引物和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物,优化PCR反应体系,建立在同一PCR反应体系中同时检测间日疟原虫、恶性疟原虫基因组特异性DNA片段的疟疾诊断方法,并评价其现场应用价值。结果间日疟原虫和恶性疟原虫基因组DNA经过复式PCR后,分别扩增出1 451 bp和833 bp的特异性条带,而伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫及健康人血样均无扩增带出现,用该反应体系可检出原虫血症为1.1×10-6和5.6×10-7的间日疟原虫和恶性疟原虫感染。与镜检法相比,复式PCR检测119份现场样本,112份与镜检结果相同,阳性率为54%,漏诊率为0.8%,误诊率为0,而镜检法依次分别为53%、1.7%和3.4%。结论复式PCR方法检测疟原虫具有简便、快速、特异、敏感等优点,在疑似病例的鉴别诊断和分子流行病学调查中具有良好的应用价值。     

多重PCR快速检测恶性疟和间日疟的研究

目的 建立一种简便快速、能同时检测恶性疟和间日疟的核酸检测方法。方法 针对两种疟原虫18S rRNA基因设计2对(3条引物),优化引物浓度与退火温度,建立可扩增出两种疟原虫基因片段的多重PCR。并进行最低检测限确定和临床标本检测,以镜检法为金标准分析灵敏度和特异度等指标。结果 该方法可扩增出431 bp(恶性疟原虫)和341 bp(间日疟原虫)基因片段,最低检测限为10²copies/反应,检测临床标本的结果与镜检法无差别(P＞0.05),敏感度为93.55%,特异度为70.83%,阳性预测值为89.23%,阴性预测值为80.95%。结论 所建立的多重PCR方法可快速检测疟疾感染并鉴别分型,灵敏度高,值得推广。     

A single-step,PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax and P. falciparum

The ability to detect and differentiate between Plasmodium falciparum and P. vivax is of great importance for the routine laboratory diagnosis of malaria, donor-blood screening and epidemiological studies. Most PCR-based methods for the discrimination of these two species require nested protocols or an additional hybridization reaction, leading to high labour costs and long turn-around times. A simple, time-effective and yet sensitive and specific technique, based on a multiplex PCR, has now been developed for the simultaneous detection and differentiation of P. falciparum and P. vivax in blood samples. Compared with the 'gold standard' of microscopy, this method had a sensitivity and specificity of 100%, with a detection limit of just one P. falciparum or three P. vivax parasites/microl blood.     

Evaluation of a rapid diagnostic test specific for Plasmodium vivax

Plasmodium vivax is the only human malaria indigenous to the Republic of Korea (ROK). A rapid and sensitive diagnostic test (RDT) that detects P. vivax is appropriate for evaluating suspected malaria patients with no travel history abroad. The RDTs, SD Malaria Antigen P.v (SD diagnostic, Kyonggi, ROK) specific for P. vivax and the well documented OptiMAL (DiaMed, Cressier, Switzerland) were compared among 282 volunteers for specificity and sensitivity of P. vivax and Plasmodium falciparum malaria infections against Giemsa-stained blood smears read by an experienced microscopist. A total of 137 volunteers were diagnosed with P. vivax, 45 cases (returned travellers from overseas) were diagnosed with P. falciparum and 100 healthy volunteers were diagnosed as negative for malaria. Correspondingly, the SD Malaria Antigen P.v test identified P. vivax infections in 128/137 malaria patients (93.4%) and 0/100 (0%) healthy volunteers. Three patients identified with P. falciparum also were interpreted as P. vivax by the SD Malaria Antigen P.v test; however, these patients were later confirmed as mixed infections of P. vivax and P. falciparum by polymerase chain reaction. OptiMAL interpreted the three mixed infections only as P. falciparum and detected 130/137 (94.9%) patients with P. vivax. The sensitivity of the SD Malaria Antigen P.v test decreased from 100% (>5000 parasite/microl) to 81.3% (1-100 parasites/microl) as parasitaemia levels declined. For the regions where P. vivax is the primary malaria parasite, the SD P. vivax-specific rapid diagnostic test may be useful for screening suspected malaria patients when sufficient material and human resources (e.g. trained microscopists) are unavailable for malaria diagnosis.