应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌

目的 探讨应用多重PCR技术快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的可靠性.方法 根据结核分枝杆菌种的MTP40基因序列(396bp),分枝杆菌属的32kD基因序列(506bp),结核分枝杆菌复合体群的IS6110序列(984bp),采用3对特异性引物(PT1,T2;MT1,T2;IS5,S6)在同一反应体系和条件下对92株结核杆菌临床分离株和5株非结核分枝杆菌临床分离株进行扩增,并与标准菌株进行比较.结果 92株结核分枝杆菌临床分离株中,0株扩增出与结核分枝杆菌H37RV标准株相同的396bp、506bp、984bp 3条DNA片段,敏感性达97.8%,特异性为100%;5株非结核分枝杆菌临床分离株均扩增出506bp DNA片段,敏感性达100%,特异性为100%.结论 应用多重PCR方法,对结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌进行鉴定,结果快速、准确、可靠,为临床结核病与非结核分枝杆菌病的快速诊断提供了有效的手段,具有很好的临床应用价值.     

一株牛分枝杆菌的分离与鉴定

采集一头检疫阳性的结核牛病变的淋巴组织进行细菌分离.分离物(Z-N)染色为阳性.提取细菌DNA,用PCR检测结核分枝杆菌特异性插入片段IS1081,确定该细菌为结核分枝杆菌.将PCR扩增出的特异性片段克隆到PMD-18T载体上.重组质粒经酶切和PCR鉴定均为阳性,测序结果与牛分枝杆菌标准菌株的同源性为100%.对其用Richard C.Huard等公布的PCR分型方法设计引物进行基因分型,确定该菌株为牛分枝杆菌BCG(M.bovis BCG).     

两种培养基对结核分枝杆菌分离鉴定的比较

与世界总体水平相比 ,目前我国的结核病发病率仍然较高。为了选择检测效果好、成本低的培养基对结核分枝杆菌进行分离与鉴定 ,我们采用匡铁吉[1] 琼脂培养基与Ｌ ｗｅｎｓｔｅｉｎ[2 ] 培养基对痰标本中的结核分枝杆菌进行分离、鉴定 ,结果显示匡铁吉琼脂培养基临床效果较优。1　材料和方法1 1　痰标本与前处理　从我院住院肺结核患者中留取 12 7份痰标本 ,每份大约 10ｍｌ,收集在一个10 0ｍｌ的干净厂口玻璃瓶内。按痰标本量的 2 5倍体积加入 2 %氢氧化钠 (ＮａＯＨ)溶液 ,用玻璃棒反复搅拌 ,以使浓痰液化均匀 ;作用 2 0ｍｉｎ后即可用于…     

军人肺结核分枝杆菌耐药性与耐药基因检测研究

目的 :了解军人肺结核病人结核分枝杆菌耐药情况及评价耐药基因检测的应用价值。方法 ;采用聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (PCR SSCP)检测结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变 ,用绝对浓度法作药物敏感试验 ,采用耐药基因检测等方法 ,对我院 1995年 1月～ 2 0 0 2年 6月痰结核杆菌培养阳性的肺结核菌种进行鉴定、检测其耐药性 ,并与地方肺结核病人进行比较。结果 ;军人组和非军人组初治耐药率分别为 31 5 %和 4 0 8%复治耐药率分别为 78 5 %和 76 2 %。复治耐药率均明显高于初治耐药率 (P <0 0 5 )。军人组耐药频度从高到低依次为异烟肼、利福平、链霉素、吡嗪酰胺和乙胺丁醇 ,非军人组为利福平、异烟肼、链霉素、吡嗪酰胺和乙胺丁醇。用药 >6个月者耐药率为 6 9 0 % ,显著高于其他各组 (P <0 0 1)。药敏试验阳性株的耐药基因检测阳性率为 33 9%～ 85 9% ,耐药基因检测阳性株的药敏试验阳性率为 92 0 %～ 10 0 %。结论 :军人结核病人耐药情况与地方病人相类似 ,应重视军人肺结核病人耐药性监测 ,耐药基因检测有潜在的应用价值     

匡氏琼脂PNB培养基用于分枝杆菌直接鉴定效果调查

 目的 调查匡氏琼脂PNB培养基用于痰分枝杆菌直接鉴定的效果.方法 采用匡氏琼脂PNB培养基直接鉴定痰标本中的结核菌和非结核分枝杆菌;并采用琼脂PNB培养基和多重PCR技术对分离物重鉴定.结果 281例痰标本,110例培养阳性,经匡氏PNB培养基直接鉴定,非结核分枝杆菌感染3例(3/110,2.7%),结核菌和非结核分枝杆菌混合感染7例(7/110,6.4%),结核菌感染100例(100/110,90.9%).匡氏琼脂PNB培养基痰菌直接鉴定法对结核菌和非结核菌感染病例的灵敏度和特异性达100%.结论 匡氏琼脂PNB培养基痰菌直接鉴定法,能快速准确鉴定非结核菌感染和混合感染,操作简易,适合推广应用.     

肺结核病人分枝杆菌菌型鉴定及耐药情况分析

目的：提高对结核与非结核分枝杆菌的鉴别。方法：对驻京部队217株分枝杆菌菌型鉴定结果进行分析，并对分枝杆菌耐药性进行测定；菌株鉴定均按1995年全国结核病细菌学检测规程进行。结果：人型结核分枝杆菌201株(92．6%)，牛型结核分枝杆菌4株(1．8％)，非结核分枝杆菌7株(3．2％)，混合型5株(2．3%)，结核分枝杆菌205株对INH、SM、RFP、EMB、PZA和PAS的耐药率分别为23．9％、20．5%、19．5％、14．6％、8．8％、4．4%。非结核分枝杆菌12株(含混合型)的耐药率分别为91．7％、83．3％、83．3％、75．0％、66．7％和75．0％。结论：驻京部队肺结核病人分枝杆菌主要是人型结核分枝杆菌，非结核分枝杆菌所占比重很小，低于全国水平，且耐药率极高，应引起重视。     

结核分枝杆菌耐药基因快速检测研究进展

耐药结核是重大的公共卫生问题并且成为控制结核病的一大障碍［1］。2015年10月28日,WHO 2015年全球结核病报告［2］中指出,2014年全球新发的结核病病例约960万,其中新发耐多药结核（multidrug-resisi-tant tuberculosis MDR-TB）病例48万,新发的MDR-TB中不到13万病例得到检测和报告,而开始接受MDR-TB治疗的病例约为11万。中国每年耐多药结核病患者达到近10万人,其中初治患者耐多药结核为5.7%,复治患者高达25.6%［3］。在很多地区,因为传统的结核药敏实验受生物安全、培养时间长等因素影响,不能常规进行耐药结核检测,甚至最基本的结核菌培养都不能开展,这表明大多数的耐多药结核病例仍然不能确诊,导致临床上的治疗无针对性。目前,具有生物安全要求级别低、检测时间短、敏感性较高等特点的耐药结核分子生物学诊断方法日益受到重视,现就结核分枝杆菌的基因快速检测研究进展综述如下。     

结核分枝杆菌特异PE/PPE蛋白家族研究进展

结核分枝杆菌（Mycobacterium. tuberculosis,MTB）是结核病的病原菌。富含甘氨酸的独特蛋白质家族——PE/PPE蛋白家族编码基因约占整个MTB菌基因组的10%,该蛋白家族可能是细菌毒力和抗原变异的主要来源,对其结构和生物学功能的研究将对结核感染的血清学诊断和结核菌苗的开发具有重要意义。     

重组结核分枝杆菌Rv2389c蛋白的纯化及其生物学功能的初步研究

目的：纯化晕组的结核分枝杆菌促进复活因子（resuscitation-promoting factor，Rpf）Rv2389c蛋白，并研究其对结核分枝杆菌、卡介苗（BCG）和藤黄微球菌的生长有无促进作用？方法：用亲和层析柱纯化重组的结核分枝杆菌Rv2389c蛋白，并将其加到一定浊度的结核分枝杆菌、BCG和藤黄微球菌培养液中，每隔一定时间测定菌液OD600值。结果：经过纯化，得到了去掉谷胱苷肽转移酶（GST）标签的重组Rv2389c蛋白，浓度为306.9μg／ml，且发现Rv2389c蛋白对结核分杆菌、BCG和藤茧微球菌的牛长都有一定的促进作用。结论：成功纯化了重组结核分枝杆菌Rv2389c蛋白，并证实它具有生物学活性，能促进结核分枝杆菌、BCG和藤黄微球菌的生长，为进一步研究其机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌利福平依赖株与耐受株差异蛋白的筛选与鉴定

%.依赖株表达量显著上调的蛋白质点7个,明显低表达的35个,单独表达的5个,缺如表达的6个,多为小分子蛋白质.在差异表达蛋白质中初步筛选了10个蛋白斑点进行质谱鉴定,9个蛋白斑点被鉴定,代表7种蛋白质.结论 结核分枝杆菌利福平依赖株可能主要通过脂肪酸生物合成和能量代谢相关酶类的差异表达,从而表现出迅速和旺盛的生长特点.     

结核分枝杆菌Rv0309抗原的重组表达、纯化和鉴定

目的重组表达结核分枝杆菌Rv0309蛋白,以进一步探讨其免疫效应。方法将结核分枝杆菌抗原Rv0309的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成Rv0309重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,进一步经GST亲合层析柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白。结果获得了pGEX4T-Rv0309重组子,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组Rv0309蛋白,其条带大小约23000,与预期结果相符。结论成功地进行了结核分枝杆菌抗原Rv0309的基因克隆与重组表达,为进一步研制新型结核病疫苗打下了基础。     

三种结核分枝杆菌耐药基因检测的临床应用和评价

采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌耐药基因（rPOB、katG和rPSL），评估它的临床应用价值。通过Bactec-960快速培养、PCR－SSCP和药物敏感试验了解123例肺结核病人结核分枝杆菌耐药情况，分析了临床治疗效果。近1／3的初治肺结核病人至少耐一种抗结核药物，RFP、INH和SM敏感株SM敏感株rPOB、katG和rPSL基因突变率分别为6．2％、10．8％和25．4％，耐药株基因突变率分别为60．2％、48．0％和61．5％，耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高。药敏试验联合耐药基因检测指导治疗效果满意。耐药基因检测指导治疗是一种新探索，与药敏试验联合应用可互相弥补，有可能成为临床指导用药的较好方法。     

结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗的免疫原性和治疗作用

目的 研究结核分枝杆菌Ag85A DNA 疫苗的免疫原性和治疗作用.方法 40只BALB/c小鼠随机分为4组,分别用生理盐水、pVAX1载体、微卡菌苗、Ag85A DNA 疫苗免疫,每2周肌内注射1次,共3次.研究 Ag85A DNA 疫苗的免疫原性.用结核分枝杆菌H37Rv通过尾静脉注射40只BALB/c小鼠,分别用生理盐水、pVAX1载体、利福平、Ag 85A DNA 疫苗治疗.治疗结束后2周杀鼠,观察肺和脾病理改变,称取重量、做菌落计数,用ELISPOT方法检测小鼠分泌γ干扰素(IFN-γ)的T淋巴细胞斑点数.结果 与其他组比较,Ag 85A DNA疫苗能诱导产生大量Ag85A特异的分泌IFN-γ 的T淋巴细胞(S=11.832,P=0.0080).肺组织病理显示:生理盐水组肺组织病变严重、广泛;载体组比生理盐水组病变略轻,但病变仍较重、广泛;Ag 85A DNA 疫苗组肺组织病变减轻、局限,3/5区域肺泡结构完整,清晰;利福平组肺组织无病变.与生理盐水组比较,Ag85A DNA 疫苗组和利福平组肺脏菌落数分别减少0.73 log和2.11 log;肝脏菌落数分别减少0.88 log和2.11 log(P<0.01).结论 Ag85A DNA 疫苗对小鼠结核病具有较好的治疗效果.     

检测耐利福平结核分枝杆菌寡核苷酸芯片的研制及应用

目的：探讨用寡核苷酸芯片检测结核分枝杆菌耐利福平株的rpoB基因突变的可行性。方法：制备了检测耐利福平结核分枝杆菌寡核苷酸芯片，并且通过优化引物比例和杂交温度以获得最佳结果。应用该寡核苷酸芯片检测6例结核分枝杆菌的rpoB基因突变，并与测序结果比较。结果：不同引物比例PCR产物经热变性后杂交，杂交结果无明显差异。杂交温度可以影响杂交结果的特异性和杂交信号的强度。引物比例1：1，杂交温度50℃为最佳条件。6例标本的芯片检测结果显示其中有1例野生型标本，5例突变标本：516位GAC→AAC，GTC，TAC，GAG，531位TCG→TTG。其结果与测序结果完全相符。结论：寡核苷酸芯片可以推广应用到临床作为耐药结核病快速诊断的一种有效方法。     

重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究

目的探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达多表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定重组多表位肽的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,多表位肽(10μmol)能刺激全部10例HLA-A*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖,SI为46.2±5.6;增殖反应明显高于单肽(平均SI为10.2±2.3)以及PPD(平均SI为15.6±3.6)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在多表位肽诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μmol)的T2细胞作为靶细胞,多表位肽诱导的CTL作为效应细胞,多表位肽能诱导全部的10例A2+PPD+健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(86.2±9.6%),显著高于单肽[平均为(25.4±3.6)%]和PPD[平均为(22.6±2.8)%](P<0.01)。结论重组优化多表位肽在细胞水平具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性。     

链霉素对结核分枝杆菌sRNA表达影响的研究

目的：研究链霉素对结核分枝杆菌非编码sRNA表达量的影响,探讨sRNA是否参与细菌与药物的相互作用。方法基于结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的高通量测序结果,选出表达量估计值较高的4个sRNA作为研究对象,根据链霉素的最小抑菌浓度（MIC）对标准菌株H37Rv进行不同浓度和不同时间的链霉素诱导,提取各组菌液的总RNA,通过实时定量逆转录聚合酶链反应（ qRT－PCR）检测4种sRNA在各组中的表达量,比较不同抑菌浓度和不同时间的链霉素作用下sRNA的表达量差异。结果当链霉素浓度在1／2MIC时对结核分枝杆菌的生长产生明显抑制作用;在4种sRNA中,MTS2823表达量最高,F6表达量相对较低;MTS1338在4MIC浓度的链霉素处理18 h即出现表达上调;在4MIC浓度链霉素作用6 d后,MTS1338和mcr11表达量分别出现（4．80±1．14）倍和（2．91±0．86）倍上调,而MTS2823表达下调。在各组药物处理组中F6表达量的变化均不明显。结论链霉素对结核分枝杆菌sRNA的表达可产生促进或抑制作用,提示sRNA可对某些基因进行转录后调控,促进或拮抗链霉素对结核分枝杆菌的作用。     

脓肿型分枝杆菌肺部感染胸片和CT表现

目的：探讨脓肿型分支杆菌病的胸部X线和CT影像学表现。方法：回顾性分析18例经临床确诊为脓肿型分枝杆菌感染患者的X线、CT表现。结果：胸片异常征象：斑点状、细网状阴影16例（89%,16/18）,空洞8例（44%,8/18）,肺叶体积缩小8例（44%,8/18）,实变4例（22%,4/18）,支气管扩张8例（44%,8/18）。CT异常征象：支气管扩张12例（66.7%,12/18）,其中表现为柱状支气管扩张9例（50%,9/18）,囊状支气管扩张5例（27.8%,5/18）,静脉曲张型支气管扩张3例（16.7%,3/18）;直径小于10mm结节17例（94.4%,17/18）,树丫征15例（83.3%,15/18）;直径大于10mm结节13例（72.2%,13/18）,肺叶实变6例（33.3%,6/18）,段或亚段实变9例（50%,9/18）,空洞9例（50%,9/18）,肺体积缩小7例（38.9%,7/18）。结论：脓肿型分枝杆菌感染的胸片和CT表现主要为小结节样斑片状、细网状影、支气管扩张和空洞形成。     

两种染色法在分枝杆菌检测中的临床应用价值

目前,临床上结核病细菌学的诊断主要采用抗酸染色法,即萋-尼染色法,但其检出率偏低,尤其是在标本含菌量较少时。本研究采用快速荧光染色液检测420例痰液标本,并与萋-尼染色法进行对比,以探寻分枝杆菌的最佳检测方法。1材料与方法收集2010年10-12月解放军309医院收治的初     

结核分枝杆菌异烟肼依赖性的初步调查

目的 调查临床结核菌分离株对异烟肼的依赖状况.方法 采用匡氏琼脂培养基分离痰结核菌并进行结核菌药敏试验,采用匡氏双向琼脂培养基检测结核菌药物依赖性.结果 184例临床分离结核菌株异烟肼依赖包括4种类型.A型:含药管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,且高浓度管菌落生长优于低浓度管者占6.52%(12/184);B型:含药管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,且低浓度管菌落生长优于高浓度管者占5.43%(10/184);C型:低浓度管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,而高浓度管菌落生长劣于对照管者占8.15%(15/184);D型:高浓度管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,而低浓度管菌落生长劣于对照管者占2.17%(4/184).统计结果显示具有异烟肼依赖特征的临床分离株占全部菌株的22.28%(41/184).结论 结核菌临床分离株中存在异烟肼依赖株,并显示出不同的依赖特征.     

胞内分枝杆菌肺病的CT表现

目的 探讨胞内分枝杆菌肺病的CT特点.方法 收集在本院经临床确诊的37例胞内分枝杆菌肺病患者,回顾性分析其影像学表现.结果 胞内分枝杆菌肺病主要的CT征象为小叶中心结节(97.3%)、支气管扩张(73.0%)和肺斑片状病灶(54.1%),其次为纤维条索灶(43.2%)、≥1 cm结节灶(35.1%)、薄壁空洞(29.7%),而厚壁空洞和胸腔积液却不常见.较为特征性的CT征象为发生于右中叶和(或)左舌叶支气管扩张伴周围小叶中心结节.结论 胞内分枝杆菌肺病的CT表现具有一定的特征性,CT检查对该病的诊断具有重要价值.