实时荧光定量PCR在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用评估

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的应用。方法采用头孢西丁纸片扩散法和mecA基因PCR检测法,将85株临床分离的金黄色葡萄球菌区分为MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA),并采用实时荧光定量PCR对这些菌株进行检测,评价MRSA检测中实时荧光定量PCR与目前常规检测方法的一致性。结果根据头孢西丁纸片扩散法和mecA基因扩增结果进行分组,85株金黄色葡萄球菌中MRSA组菌株45株,MSSA组菌株40株;实时荧光定量PCR检测结果与上述结果完全一致,符合率为100%。结论实时荧光定量PCR检测MRSA的结果与常规方法一致性好,且具有操作简便、耗时短等特点。作为一种快速检测方法,实时荧光定量PCR能将金黄色葡萄球菌的鉴定和MRSA的筛选结合起来,对于指导临床用药及MRSA医院感染控制具有重要意义。     

PCR检测腹膜透出液中的金黄色葡萄球菌

检测腹膜透出液中的金黄色葡萄球菌。方法应用ＰＣＲ检测未感染的及已感染的腹膜透出液,并与传统培养方法进行对比。结果培养出金黄色葡萄球菌的腹透液,ＰＣＲ均出现了２７９ｂｐ的特异性扩增带,且ＰＣＲ检出率高于培养法。结论ＰＣＲ与培养方法相比具有快速、特异,敏感的优点,而且不受抗菌素使用的限制。     

实时荧光定量PCR在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的评价与应用

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的临床应用价值。方法经培养鉴定的70例已知细菌中22例为MRSA,48例为非MRSA,对已知细菌用实时荧光定量PCR进行检测,了解该方法的特异性和敏感性。对临床88例医护人员和患者的鼻拭子进行实时荧光定量PCR检测,了解医院内MRSA的携带情况。结果培养为MRSA,实时荧光定量PCR检测结果均为MRSA,敏感性为100%;培养为非MRSA,实时荧光定量PCR检测结果均为非MRSA,特异性为100%。实时荧光定量PCR检测MRSA的敏感性可确定为1×103cfu/mL。48例患者的鼻拭子mecA耐药基因阳性26例,金黄色葡萄球菌阳性28例,两者同时阳性(即为MRSA)20例,MRSA阳性检出率为41.6%;40例医护人员鼻拭子mecA耐药基因阳性12例,金黄色葡萄球菌阳性13例,两者同时阳性(即为MRSA)9例,MRSA阳性检出率为22.5%。结论实时荧光定量PCR可用于临床对MRSA的快速检测。     

实时荧光PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的临床评估

目的:采用实时荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),并评价该方法在临床上的应用价值。方法:将临床分离的62株金黄色葡萄球菌(金葡菌)和35株非金黄色葡萄球菌同时采用分离培养及药物敏感试验(药敏试验)和实时荧光PCR法进行检测并比较,对2种方法检测结果不符的菌株辅以测序法进行最后鉴定,并确定实时荧光PCR法的检测灵敏度。结果:分离培养法与实时荧光PCR法对金葡菌检测的一致率为100%,都检测出了62株金葡菌阳性株。实时荧光PCR法与分离培养药敏试验法MRSA检测的符合率为96.77%,而分离培养药敏试验法检测为阴性而实时荧光PCR法检测为阳性的2株待检菌的测序结果显示为MRSA阳性株。最后确定实时荧光PCR法检测MRSA的临床灵敏度为1×103 cfu/mL。结论:实时荧光PCR法可用于临床对MRSA的快速检测,具有较高的临床价值。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MecA基因的实时荧光定量PCR方法学评价

目的评估实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测临床标本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)MecA耐药基因的价值。方法选择该院2013年6~12月125份临床标本,包括血液40份,痰液52份,创面分泌物33份进行FQ-PCR检测和细菌鉴定,分析结果符合率,以检测FQ-PCR的灵敏度及特异性。结果FQ-PCR的灵敏度为0.159pg/μL,检测经细菌培养鉴定的菌株,特异性达到100%,与临床标本结果符合率为97.6%。结论 FQ-PCR检测MRSA的MecA基因更加方便、快速,且灵敏度和特异性等性能指标均比较理想,与细菌鉴定结果符合率较高,适合临床广泛应用。     

多重PCR法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌染色体mec盒的分型研究

目的研究本院2002年连续收集的102株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）染色体mec盒（SCCmec）的分型特点。方法用多重PCR法对MRSA SCCmec的结构和其变异情况进行分析及分子分型。结果102株MRSA中有94株属SCCmec-Ⅲ型，4株属SCCmec-ⅢA亚型，2株属SCCmec-Ⅳ型，2株属SCCmec-Ⅰ型。结论通过多重PCR法分型，表明SCCmec-Ⅲ型是引发本院2002年MRSA感染的主要菌型。     

双重PCR反向杂交快速检测及鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的　研究以非培养法为基础的快速检测和鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)的方法。方法　将金黄色葡萄球菌mecA基因特异性探针固定在尼龙膜上 ,双重聚合酶链反应 (PCR)同时扩增待检DNA片段 ,在扩增中用bio 11 dUTP标记扩增产物 ,然后与探针膜杂交。结果　 5 0株金黄色葡萄球菌sa4 4 2特异性基因片段检测结果为 10 0 %阳性 ,mecA基因结果阳性占 72 %。结论　该方法灵敏度高、特异性强 ,适用于临床快速检测和鉴定MRSA。     

多重实时荧光定量聚合酶链反应检测携带耐药基因及肠毒素A基因的金黄色葡萄球菌

目的 建立一种快速鉴定携带耐药基因和肠毒素A基因的金黄色葡萄球菌的方法.方法 根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因nuc、甲氧西林耐药基因mecA和肠毒素A基因sea的序列,设计特异性的引物和不同荧光素标记的TaqMan探针,通过反应体系和反应条件的优化,建立了能同时检测鉴定耐甲氧西林和产肠毒素A的金黄色葡萄球菌的多...     

实时荧光定量-聚合酶链反应检测食品中金黄色葡萄球菌方法的研究

目的利用实时荧光定量-聚合酶链反应（real-time PCR）技术,建立食品中金黄色葡萄球菌（金葡萄）污染的快速敏感特异的检测方法。方法以金葡菌的IFemB/I基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以金葡菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mgsup2+/sup浓度,以金葡菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.8 mol/L、0.6 mol/L,Mgsup2+/sup浓度为3.5 mmol/L时,具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中,除金葡菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,最低检测限为44 cfu/ml。稳定性分析表明:同一样品重复检测3次IC/It值的变异系数均5％。检测样品结果显示real-time PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。     

金黄色葡萄球菌肠毒素快速分型体系的建立及应用

目的 建立SYBR-Green荧光PCR体系金黄色葡萄球菌肠毒素快速分型体系,应用于金黄色葡萄球菌食物中毒和食品风险监测快速诊断.方法 根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E基因的保守序列设计特异性引物,分别建立SYBR-Green荧光PCR体系.应用该系列体系检测185株金黄色葡萄球菌野生株的肠毒素基因A～E型.结果 建立的SYBR-Green荧光PCR系列体系其DNA灵敏度为1.34～2.80 ng/μL,菌液灵敏度为46～96 CFU/mL;用以检测185株金黄色葡萄球菌的肠毒素基因A～E型,携带一种基因型的为58.38%,同时携带两种以上毒素基因占4.86%.结论 建立的荧光PCR反应体系快速、灵敏度高、特异性强,能应用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因的准确分型,对食物中毒诊断和食品风险监测很有意义.     

荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌方法的建立

目的建立沙门氏菌实时荧光定量PCR的快速检测方法 ,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据沙门氏菌fimY基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于沙门氏菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法。结果成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量PCR方法 ;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为食源性沙门氏菌污染的快速检测提供依据,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等。     

实时荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、D

目的建立一种快速、准确、特异、定量检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素A、D的方法并探讨肠毒素在食物中毒引起腹泻中的意义。方法选择femB、SEA和SED基因分别作为金黄色葡萄球菌菌株、肠毒素A、肠毒素D的靶序列,设计合成引物和探针;收集食物中毒导致腹泻患者粪便标本487份,并对其进行检测分析。结果采用荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌和肠毒素A的灵敏度为1·0×102拷贝,而检测肠毒素D的灵敏度为1·0×103拷贝;487份粪便标本中检出金黄色葡萄球菌72例(14·8%),检出产肠毒素A菌株为11例(15·3%,11/72),产肠毒素D菌株为9例(12·5%,9/72),同时产肠毒素A、D菌株1例(1·4%,1/72)。结论应用Taqman探针实时荧光PCR技术能够快速、准确检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素,适合于大样本筛查;肠毒素是金黄色葡萄球菌食物中毒导致腹泻的重要病因之一。     

Rapid detection and identification of Staphylococcus aureus from blood culture specimens using real-time fluorescence PCR

Molecular surveillance of pathogens has shown the need for rapid and dependable methods for the detection and identification of organisms of clinical and epidemiologic importance. Staphylococcus aureus, one of the most frequent causes of human infections, was used as a model organism to develop and refine a real-time fluorescence PCR assay and enhanced DNA purification method. One hundred clinical isolates of S. aureus, verified by biochemical reactions and latex agglutination and 90 negative control clinical isolates were screened in the assay. Moreover, fifty blood broth samples from blood culture bottles showing Gram-positive cocci in clusters on direct Gram's stain and 25 showing Gram-negative bacilli were screened. The probes, constructed from the nuc gene, correctly detected all S. aureus genomes present without cross-reaction to negative controls. The speed and ease of this approach will make it adaptable to identification of many bacterial pathogens and provide potential for adaptation to direct detection from other types of clinical specimens.     

实时荧光定量聚合酶链反应在肺结核诊断中的应用

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在肺结核诊断中的应用价值。方法应用FQ-PCR对临床诊断肺结核及其他肺部疾病患者的临床标本进行结核分枝杆菌DNA定量检测,同时与涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法作比对。结果 189例临床诊断肺结核患者FQ-PCR检测123例阳性,提示敏感度为65.1%(123/189),而涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法分别为40.2%(76/189)、63.5%(120/189)。94例其他肺部疾病患者及20例健康对照者FQ-PCR检测均为阴性,特异度为100.0%。结论 FQ-PCR敏感度和特异度均高,检测过程简单、易标准化、全过程仅需4～5h,可用于结核病的快速诊断。     

实时荧光定量PCR法检测产气荚膜梭菌

目的:运用实时荧光定量PCR法检测产气荚膜梭菌,为早期快速诊断气性坏疽提供新方法.方法:以产气荚膜梭菌16s rDNA基因序列为模板,在其保守区域设计特异性引物与探针,将PCR扩增所得产物片段克隆,作为定量检测的标准品,绘制标准曲线.并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性、重复性及可行性.结果:实时荧光定量PCR法对产气荚膜梭菌的检测具有高度特异性,与创伤弧菌等24种相关细菌等均无交叉反应;检测灵敏度以纯菌计数达9×102cfu/mL,相当于9 cfu/反应;反应体系有较高稳定性;整个操作过程仅需3 h;300例创伤可疑分泌物样本的荧光定量PCR检测结果与细菌培养结果一致.结论:实时荧光定量PCR法特异、灵敏、快速,适用于产气荚膜梭菌的临床检测及突发事件的批量检测.     

多重荧光定量PCR法快速鉴定MRSA的临床研究

目的 构建mecA、nuc、内标基因3种基因联合检测的单管多通道Taqman探针荧光定量PCR法,用于鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),并与传统细菌培养和鉴定方法进行比较,评估其临床应用价值.方法 以169例临床标本和经常规细菌培养和VITEK2 Compact全自动微生物分析仪鉴定的金黄色葡萄球菌(SA)15...     

实时荧光PCR法定量小腿慢性静脉性溃疡表面的细菌分布

背景:小腿慢性静脉性溃疡表面的细菌在溃疡的愈合过程中起重要作用,但细菌的种类、密度与溃疡愈合的关系仍然存在争议。目的:探讨小腿慢性静脉性溃疡中的常见菌群种属和细菌量与溃疡愈合的关系。方法:纳入2009-05/2010-09重庆医科大学第一附属医院血管外科诊断为小腿慢性静脉性溃疡患者39例,共42条患肢。所有患者均进行标准的加压疗法治疗,经过6个月的随访以确定溃疡的愈合率,42条患肢中,28条患肢在6个月内完全愈合,为愈合组,14条患肢未完全愈合,为未愈合组。获取治疗前所有溃疡的组织样本,提取样本中的细菌基因组DNA,合成细菌的通用引物及下肢慢性静脉性溃疡中常见细菌种属的特异性引物,运用常规PCR及荧光定量PCR方法比较愈合组与未愈合组溃疡表面的细菌差异。结果与结论:愈合组和未愈合组标本中都可检测到细菌,最常见的细菌为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌。荧光定量PCR结果显示未愈合组标本中的细菌总量较愈合组明显增多(P<0.05),两组中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌的含量无明显差异(P>0.05)。实验结果中未见任何一种溃疡的常见细菌种属与溃疡的愈合具有直接关系,而溃疡中的细菌总量与溃疡的愈合有较大的关联。结果表明溃疡表面细菌总量的增加引起的皮肤慢性感染可能是导致小腿慢性静脉性溃疡长期不愈合的重要原因。     

实时荧光定量PCR快速诊断肠道病毒71型感染

目的探寻快速准确早期诊断肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)感染的方法。方法手足口病患儿871例,采用实时荧光定量PCR检测患儿咽拭子或疱液的EV71感染情况,实时荧光定量PCR检测EV71阳性患儿采用ELISA法检测血清EV71-IgM和EV71-IgG。结果871份标本中,RT-PCR检测EV71感染阳性率为17.91%,其中5月份检测阳性率(24.44%)最高,12月份检测阳性率(4.17%)最低;随机抽取64例RT-PCR检测阳性患儿外周血,EV71-IgM阳性率为51.56%,EV71-IgG阳性率为14.06%。结论 RT-PCR能快速准确诊断EV71早期感染。     

实时荧光PCR法定量小腿慢性静脉性溃疡表面的细菌分布

背景：小腿慢性静脉性溃疡表面的细菌在溃疡的愈合过程中起重要作用,但细菌的种类、密度与溃疡愈合的关系仍然存在争议。目的：探讨小腿慢性静脉性溃疡中的常见菌群种属和细菌量与溃疡愈合的关系。方法：纳入2009-05/2010-09重庆医科大学第一附属医院血管外科诊断为小腿慢性静脉性溃疡患者39例,共42条患肢。所有患者均进行标准的加压疗法治疗,经过6个月的随访以确定溃疡的愈合率,42条患肢中,28条患肢在6个月内完全愈合,为愈合组,14条患肢未完全愈合,为未愈合组。获取治疗前所有溃疡的组织样本,提取样本中的细菌基因组DNA,合成细菌的通用引物及下肢慢性静脉性溃疡中常见细菌种属的特异性引物,运用常规PCR及荧光定量PCR方法比较愈合组与未愈合组溃疡表面的细菌差异。结果与结论：愈合组和未愈合组标本中都可检测到细菌,最常见的细菌为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌。荧光定量PCR结果显示未愈合组标本中的细菌总量较愈合组明显增多（P〈0.05）,两组中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌的含量无明显差异（P〉0.05）。实验结果中未见任何一种溃疡的常见细菌种属与溃疡的愈合具有直接关系,而溃疡中的细菌总量与溃疡的愈合有较大的关联。结果表明溃疡表面细菌总量的增加引起的皮肤慢性感染可能是导致小腿慢性静脉性溃疡长期不愈合的重要原因。