SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测食品中转基因成分方法的初步建立

目的：建赢SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法检测食品中转基因成分35S启动子和NOS终止子,并对样品进行检测。方法：以大豆Lectin基因为内源性基因,以转基因食品中常用的花椰菜花叶病毒启动子（CaMV35S）和根癌农杆菌终止子（NOS）基因为目标基因,设计并合成3对特异性引物,优化反应条件,使用SYBR GreenⅠ染料实时荧光PCR检测35S启动子和NOS终止子,并做熔解曲线分析。同时利用该方法对胡萝卜、青豆、玉米、马铃薯等实际样品进行检测。结果：运用该方法检测8份样品,有4份检出35S基因和NOS基因成分。结论：SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法能有效检测出35S和NOS两种转基因成分,简便、快速。     

SYBR Green Ⅰ实时PCR检测甲肝病毒方法的建立与初步应用

目的建立一种快速、特异的SYBR Green Ⅰ实时PCR方法检测甲肝病毒.方法对SYBR Green Ⅰ实时PCR检测甲肝病毒方法的反应条件、反应体系进行优化,同时与传统RT-PCR方法进行灵敏度比较,提高该方法的特异性、灵敏性.并用该方法对甲肝病毒毒株、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(1～6型)毒株、贝类水产品标本进行检测.结果SYBR Green Ⅰ实时PCR与传统RT-PCR检测甲肝病毒方法的灵敏度无明显区别,但检测时间缩短了1/2.该方法能特异检测出甲肝病毒,不能扩增脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(1～6型)毒株,对农贸市场40份贝类水产品进行甲肝病毒核酸检测,检出3份.结论建立的SYBR Green Ⅰ实时PCR方法用于甲肝病毒检测具有特异、灵敏、快速等优点,可用于甲肝的病原学监测.     

多重定性PCR和SYBR GreenⅠ实时PCR快速检测转基因食品方法的研究

转基因植物具有特殊的营养价值、产量和抗病能力,但其安全性,尤其是食用安全性已引起世界范围内的广泛关注。许多国家和地区先后制定了转基因食品标识管理政策,以保障消费者的知情权和选择权。因此建立检测转基因食品的方法势在必行。     

多重定性PCR和SYBR Green I实时PCR快速检测转基因食品方法的研究

转基因植物具有特殊的营养价值、产量和抗病能力,但其安全性,尤其是食用安全性已引起世界范围内的广泛关注[1,2].许多国家和地区先后制定了转基因食品标识管理政策,以保障消费者的知情权和选择权.因此建立检测转基因食品的方法势在必行.     

SYBR GreenⅠ实时PCR检测乙脑病毒方法的建立与初步应用

目的建立一种快速、特异的SYBR GreenⅠ实时PCR方法检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒。方法对SYBR GreenⅠ实时PCR检测乙脑病毒方法的反应条件、反应体系进行优化,同时与传统RT-PCR方法进行灵敏度比较,提高该方法的特异性、灵敏性。并用该方法对乙脑病毒毒株、登革病毒(Ⅰ~Ⅳ型)毒株、90份猪血清标本进行检测。结果SYBR GreenⅠ实时PCR与传统RT-PCR检测乙脑病毒方法的灵敏度无明显区别,但检测时间缩短了1/2。该方法可检测出乙脑病毒,不能扩增登革病毒,对90份猪血清标本检测结果均为阴性。结论建立的SYBR GreenⅠ实时PCR方法用于乙脑病毒检测具有特异、灵敏、快速等优点,可用于乙脑的病原学监测。     

SYBR GreenⅠ染料法定量PCR检测疟原虫感染及

目的评价一种可以快速定量检测疟原虫及虫种鉴别的荧光定量PCR法。方法将SYBR Green Ⅰ法与TaqMan探针法检测疟原虫进行比对,评价定量的准确性及方法的敏感度。以PCR-DNA测序法为金标准,评价SYBR Green Ⅰ法分型的准确性。结果两个方法的定量拷贝检测数无显著性差异(P>0.05)。SYBR Green Ⅰ法检测疟原虫的最低检测下限为1×102copy/mL至5×102copy/mL之间。与PCR-DNA测序法比较,SYBR Green Ⅰ法能准确的对感染的疟原虫虫种做准确的鉴定。结论 SYBR Green I染料法定量可同时进行人体疟原虫的定量检测和虫种鉴别,且成本低廉,操作简便快速,可以在疟疾的高发地区推广使用。     

SYB GRreenⅠ实时PCR检测甲肝病毒方法的建立与初步应用

目的：建立一种快速、特异的SYBR GreenⅠ实时PCR方法检测甲肝病毒。方法：对SYBR GreenⅠ实时PCR检测甲肝病毒方法的反应条件、反应体系进行优化,同时与传统RT-PCR方法进行灵敏度比较,提高该方法的特异性、灵敏性。并用该方法对甲肝病毒毒株、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒（1～6型）毒株、贝类水产品标本进行检测。结果：SYBR GreenⅠ实时PCR与传统RT-PCR检测甲肝病毒方法的灵敏度无明显区别,但检测时间缩短了1/2。该方法能特异检测出甲肝病毒,不能扩增脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒（1～6型）毒株,对农贸市场40份贝类水产品进行甲肝病毒核酸检测,检出3份。结论：建立的SYBR GreenⅠ实时PCR方法用于甲肝病毒检测具有特异、灵敏、快速等优点,可用于甲肝的病原学监测。 基金 上海市医学重点学科建设项目（05Ⅲ029）     

HBV cccDNA SYBR GreenⅠ荧光定量检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种稳定、特异、敏感的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA (cccDNA) SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法.方法 根据乙肝病毒松弛环状DNA (HBVrcDNA)与cccDNA的结构差异,设计跨越双缺口的特殊引物,并利用一种ATP依赖不降解质粒的DNA酶(Plasmid-SafeTMATP dependent DNase,PSAD)提高反应的特异性;建立荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性检验.应用所建立的方法评价拉米夫定和阿德福韦酯对HBVcccDNA的抑制效果.结果 该方法能特异性检测到HBV cccDNA,在2.68×1082.68×103 copies/μl检测范围之间有良好的线性关系,相关系数为-1.00,扩增效率为102％;最低检测限为2.68×101 copies/μl.拉米夫定和阿德福韦酯对HBVcccDNA均有很好的抑制效果.结论 该实验所建立的方法稳定性强、特异性好、灵敏度高,可快速定量检测HBVcccDNA,用于抗HBV药物的评价.     

应用SYBR Green Ⅰ荧光PCR快速检测副溶血弧菌及其毒力基因

目的利用SYBR Green Ⅰ荧光PCR反应检测副溶血弧菌及其trh和tdh毒力基因。方法根据副溶血弧菌tlh基因设计引物,建立检测副溶血弧菌SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,利用33株副溶血弧菌分离株以及22株其他种属细菌进行特异性和灵敏度评价。根据副溶血弧菌trh和tdh毒力基因序列设计引物,建立检测副溶血弧菌毒力基因的单重和双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,并对这两种方法进行特异性和灵敏度评价。结果本研究中基于tlh基因的荧光PCR检测对全部33株副溶血弧菌检测为阳性,检测下限为5×101拷贝/μl,而22株其他种属细菌均为阴性。毒力基因trh和tdh均能特异性检测,其单重荧光PCR检测下限为5×101拷贝/μl,双重荧光PCR检测下限为5×102拷贝/μl。结论本研究建立了tlh作为靶基因检测副溶血弧菌的单重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法和同时检测副溶血弧菌trh和tdh毒力基因的双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,简化了毒力基因检测,有良好的实际应用前景。     

转基因成分实时荧光PCR定量分析数学方程的理论研究

目的：根据TaqMan荧光探针实时荧光PCR的技术原理，建立实时荧光PCR循环次数与荧光强度问的动力学方程、样品中转基因成分含量与Xo及Cr的定量关系和定量分析数学方程。方法：采用数学推导和理论测算的方法，研究数学方程中各参数的意义、影响因素、变化特点和规律。结果：转基因成分含量的定义、定量分析模式、样品DNA提取效率、PCR扩增效率、反应管中初始模板数、荧光分子形成效率、荧光测量阈值、PCR测量的系统和偶然误差，是导致定量关系发生偏离及测定灵敏度发生变化的重要原因。结论：数学方程中各项参数可用于评估定量关系的偏离程度及变化趋势，还可作为选择、优化定量分析条件和校正、降低定量方法系统误差的技术指标。     

转基因食品多重定性PCR及实时荧光定量PCR检测方法的研究

多重PCR方法是建立在传统PCR检测技术基础上的快速简便的检测手段。本研究以国际市场上转基因食品的主流产品转抗除草剂大豆 (RR大豆 )、Bt176玉米及我国自行研发的抗菌肽辣椒为材料 ,以多重PCR方法为基础 ,通过基因片段筛选及引物比例调整 ,进行了转基因食品的调控元件、外源结构基因及物种内源特性基因三种片段的单管同时扩增。结果与常规PCR方法检测结果完全相符。同时 ,针对RR大豆 ,对几类大豆产品运用实时定量PCR方法进行定量分析 ,得到相应的转基因成分的含量。操作简便快速 ,检测结果与标准相符 ,检测灵敏度较常规PCR更高。     

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测西尼罗病毒

目的建立快速、敏感和特异的检测西尼罗病毒的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR法，用于西尼罗病毒（WNV）疾病的早期诊断。方法采用RT—PCR扩增WNV基因片段，将其克隆至T载体，重组质粒测序并进行同源性分析；阳性质粒用于替代WNV，以阳性质粒为模板，建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，并进行敏感性和特异性检测。结果经测序证实扩增片段属于WNV，所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR法可检测到10拷贝的西尼罗病毒RNA，而对其他黄病毒科成员日本脑炎病毒及登革热病毒的检测则为阴性，表明该方法特异。结论SYBRGreenⅠ荧光定量PCR简便快速，具有较高的敏感性和特异性，可以成为一种早期检测西尼罗病毒的新方法。     

食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列，设计一对引物和探针，以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板，优化引物和探针的浓度比和Mg^2＋浓度，以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性，并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0．8μmol／L，1．0μmol／L，Mg^2＋浓度为3mmol／L时，具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中，除沙门菌出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。在纯菌条件下，定量检测低限33cfu／ml。稳定性分析表明：同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5％。检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强，稳定性高，操作简便快捷，适应食品微生物检验发展需要，具有较大的推广及应用价值。     

腺病毒荧光定量PCR快速检测方法建立

目的 建立腺病毒双链嵌合荧光染色(SYBR Green)实时定量PCR快速检测方法,用于腺病毒感染的早期诊断及病毒核酸定量分析.方法 建立并优化SYBR Green荧光定量PCR反应体系和反应条件,评价该方法的特异性、灵敏度和重复性,同时进行熔解益线分析,构建定量分析模型,并对84份临床样本进行检测.结果 该方法与其他呼吸道病毒无交叉反应,检测灵敏度10~2拷贝/μL,熔解曲线显示单一的峰,熔解温度为(84.9±0.1)℃,临床样本检测阳性率达30.95%.结论 建立了快速、敏感、特异的腺病毒SYSR Green荧光定量PCR检测方法,适用于腺病毒的早期快速诊断.     

食品过敏原荞麦的实时荧光PCR检测

目的:荞麦是日本法规要求强制性标识的食品过敏原,我国需要建立出口日本食品中过敏原荞麦成分的标准方法。方法:参考现有文献,采用实时PCR方法建立食品过敏原荞麦成分的检测方法。结果:研究表明建立的检测方法具有特异性,灵敏度高,检测限为1 mg/kg。结论:本方法适用于食品中过敏原荞麦成分检测。     

实时荧光定量PCR检测特殊人群中HCV-RNA的研究

[目的]探讨HCV在特殊人群中的流行和干扰素治疗效果对HCV-RNA含量的影响。[方法]收集223份抗-HCV阳性血清并跟踪观察和用荧光定量实时荧光定量PCR法检测HCV-RNA的含量。[结果]在141份抗-HCV阳性血清中,58份实时荧光定量PCR阳性,阳性符合率为41.13%,在86份有输血史患者中39份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为45.35%,17份有家族遗传史患者中11份实时荧光定量PCR阳性符合率为64.70%。在38例不明原因感染者中有8份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为21.05%（χ^2=16.21Р=0.000）。58例实时荧光定量PCR阳性的病人经治疗两年后,39份有输血史患者,转阴24例,转阴率61.53%。11份有家族遗传史患者中6例转阴,转阴率54.54%。在8例不明原因感染者中有5例转阴,转阴率62.24%。[结论]不同的传染途径在RNA的含量和治疗的预后有差异。     

实时荧光PCR对奶粉中坂崎肠杆菌的检测

目的：研究奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法。方法：针对坂崎肠杆菌16s-23s rDNA间区序列（ITS）设计一对SYBRGreenⅠ染料法引物、一对TaqMan探针法引物及探针，建立奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法，并对实时荧光PCR法、传统方法及PCR方法进行比较。结果：用10株坂崎肠杆菌，18株近源菌验证试验表明，本文所建立的两种实时荧光PCR方法特异性强；加菌试验表明，奶粉中坂崎肠杆菌有1．1cfu／100g时就可检出，灵敏度高；检验时间仅需2d。结论：本文提出的奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法可在实际工作推广。     

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。