无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性

目的：探讨无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性（SNP）的实用性．方法：采用新型荧光染料EvaGreen和无标记探针技术对IL-6基因启动子SNP进行基因分型．以其-597G〉A位点为例设计PCR扩增引物和无标记探针,按PCR扩增效率和产物特异性进行Mg^2＋浓度、不对称PCR引物比例以及模板浓度等条件的优化．并用此优化体系基因分型100例临床标本,杂合型与突变型以测序验证．结果：结果显示EvaGreen荧光PCR检测体系是最适Mg^2＋浓度为2．5mmol／L,不对称PCR引物比例为0．1／0．5umol／L,模板浓度为10ng／10uL的两步法不对称PCR．该体系对100例样本进行IL-6基因～597G〉A位点基因分型,发现7例杂合型和1例突变型,经测序与检测结果一致．结论：无标记探针技术检测基因SNP是一种值得推广的简便易行、低成本、常规化的基因分型方法．     

基于AllgloTM探针检测IL-1单核苷酸多态性检测方法的建立

目的：探讨AllgloTM探针检测IL-1单核苷酸多态性的实用性。方法：采用AllgloTM 探针实时荧光PCR对IL-1β基因SNP进行基因分型。设计其3954C＆gt;T位点AllgloTM探针序列和PCR扩增引物,按照PCR产物特异性和扩增效率,对退火温度、引物浓度等条件进行优化。结果：结果显示AllgloTM探针实时荧光PCR检测体系最适引物浓度为0.4μM,退化温度为58.9℃两步法PCR。在同一条件体系下,检测100例健康体检者IL-1β基因3954C＆gt;T位点,并进行基因分型,测序验证其分型结果。结论：AllgloTM探针实时荧光PCR检测IL-1β基因SNP是一种值得推广的高通量、低成本、常规化的基因分型方法。     

CYP450热点突变基因芯片分型方法的建立

目的:探索适合多位点同步检测的SNP扩增方案和杂交检测条件,建立芯片杂交信号判读的标准。方法:设计多重扩增的引物和探针;优化荧光标记引物的多重PCR条件。自行制备氨基化片基并点样制片,激光共聚焦扫描后判读检测结果。结果:野生与突变探针杂交信号比值大于4或小于2.5对分型结果的判断有意义,而当信号值在2.5~4范围内应重新检测分析。结论:通过多片段同步扩增和不同位点平衡杂交的实现,本方法适于流行病学调查,体现了寡核苷酸芯片对药物代谢酶多态性基因分型的优势。     

直接测序联合多重连接依赖探针扩增法检测家族性腺瘤性息肉病APC基因胚系突变

目的 研究中国家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者APC基因胚系突变的特点.方法 对来自北京、河北、河南、安徽、内蒙古、山西、福建等地区的14个FAP家系先证者用直接测序法进行APC基因突变检测,对突变检测阴性者应用多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术进行APE基因大片段缺失检测.结果 14例先证者中9例(64.3%)检测出APC基因微小突变,其中移码突变6例,剪接区突变2例,无义突变1例;2例(14.3%)检测出APC基因大片段缺失,微小突变与大片段缺失的总检出率为78.6%.c.2336-2337insT、c.3923-3929delAAGAAAA、c.532-2A>T和c.4179-4180GAdelinsT等4个微小突变和外显子11、10A缺失、外显子15 start缺失等2个大片段缺失为首次报道.结论 中国FAP患者APC基因的胚系突变类型多样,以移码突变居多,突变位点以第15外显子居多;直接测序法联合MLPA法检测大片段缺失可提高APC基因突变的检出率.     

HMGB1基因SNP位点实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立基于Taq Man探针实时荧光PCR技术的高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测方法。方法收集2014年4月在深圳口岸医院体检的健康人群样本20份,选择HMGB1基因上的2个SNP位点设计常规PCR和实时荧光PCR扩增引物和Taq Man探针,采用基因测序和实时荧光PCR方法对样本进行SNP分型。结果实时荧光PCR方法SNP分型结果显示,在20份样本中的HMGB1基因rs1412125位点检测到TT基因型11例,CC基因型1例,TC基因型8例;HMGB1基因rs3742305位点检测到GG基因型15例,GC基因型5例,未发现CC基因型。这一结果与基因测序方法结论完全一致。结论基于Taq Man探针技术的实时荧光PCR方法进行HMGB1基因SNP分型简单、快速、高效,可用于人群大规模样本的SNP筛查,具有广泛应用的价值。     

高保真酶特异性检测大鼠SNP基因型新方法

目的应用高保真酶(Pfu)和3’末端修饰引物在单管双向等位基因特异性扩增(SB-ASA)中区分SNP基因型,建立高保真酶特异性检测SNP基因型的新方法。方法选取近交系大鼠SNP位点,以RS8149053为例,设计两个外部引物和两个等位基因特异性引物,四引物3’末端进行硫代磷酸化修饰,应用高保真聚合酶(Pfu)进行特异性扩增,扩增结果测序验证其可靠性。结果在RS8149053 SNP位点(C/T)上,等位基因型CC扩增出179 bp目的片段,基因型TT扩增出597 bp目的片段,基因型不同则扩增出分子量不同的片段,目的条带测序结果与Rat Genome Database数据库基因型结果一致,高保真酶扩增结果稳定且特异性强。结论高保真酶等位基因特异性扩增技术能有效降低假阳性率,是一种快速、特异的SNP基因分型新方法。     

基于连接酶-琼脂糖凝胶电泳的单核苷酸多态性快速检测方法

目的：研究一种简便、快速、灵敏的单核苷酸多态性（SNP）分型方法,使其能够在简单实验条件下进行常规的临床检测。方法基于连接酶-琼脂糖凝胶电泳技术,设计突变位点的检测探针,通过对检测探针的连接、纯化和通用扩增反应,根据琼脂糖凝胶电泳条带的出现情况判定检测位点的突变类型。以表皮生长因子受体（EGFR）基因的3个 SNP 突变位点 EGFR, c．2573T＞G（L858R）,EGFR,c．2582T＞A（L861Q）和 EGFR,c．2155G＞T（G719C）为检测对象,分别对质粒模板和肺癌血浆循环 DNA 样本进行了检测。结果建立方法操作简便,具有较高的特异性和灵敏度。经过20～30个循环的 PCR 扩增,能够根据扩增条带的有无清晰判断检测位点的基因型。在对不均一样本中混合等位基因检测时,能够最低检测出2．5％的突变型等位基因。本方法和直接测序法分别能够从62例肺癌样本检测出6例和 2例 L858R 位点杂合子突变。结论SNP 突变检测方法适合于在简单实验条件下对不均一样本进行常规突变检测。     

寡核苷酸芯片在细胞因子及其受体单核苷酸多态性检测中的应用

目的建立检测细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-10、转化生长因子(TGF)-β1、IL-4、IL-6及其受体单核苷酸多态性位点的寡核苷酸芯片,通过测序等方法评价其性能。方法根据相关文献、参照NCBI的SNP数据库和NCI的SNP 500 Cancer数据库,选取临床上有意义的细胞因子及其相应受体单核苷酸多态性位点基因和相应序列,设计寡核苷酸探针59条,基因组DNA通过多重多聚酶链反应(PCR)扩增,Cy5标记。标记后的产物与芯片上探针杂交,激光扫描,荧光信号值分析,判断各位点的基因型,并通过测序验证。结果130份外周血样,除10份因时间过久,没有PCR产物外,余120份均检测成功,3次重复检验无差异,测序验证无位点错误。结论寡核苷酸芯片技术检测细胞因子及其受体单核苷酸多态性位点,具有特异性高、敏感性高、重复性好、高通量、操作简便等优点,是一种较为理想的方法。     

单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性

目的:建立了一种单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性(SNP).方法:以TYP基因外显子1上的3个SNP位点(71G>A、425A>T和758G>A)为例,首先采用PCR预扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;然后用限制性内切酶将其消化成短片段,在连接酶的作用下与设计的DNA适配器相连;以此连接产物为模板,在单个PCR管中加入一种适配器特异性通用引物和所有等位基因特异性引物进行PCR扩增;最后用琼脂糖凝胶电泳法分离检测PCR扩增产物,并根据扩增片段的大小判断SNP的类型.结果:采用该法成功测定了30名健康中国人的TYP基因中的3个SNP位点,与限制性片段长度多态性法(RFLP)测定结果完全一致.结论:该方法特异性高、结果准确、检测成本低,可用于同时测定多个SNP位点.     

MDA在PCR-RFLP基因分型中的实用性

目的:评估多重置换扩增(MDA)在聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因分型中的实用性.方法:用MDA法对50例样本进行了全基因组扩增,并用扩增后的DNA作为模板,对两个单核苷酸多态性(SNP)进行了PCR-RFLP基因分型.结果:对于所检测的两个SNP,以经MDA扩增的基因组DNA为模板,与未经MDA扩增的基因组DNA为模板进行的PCR-RFLP基因分型,结果完全一致.结论:MDA可用于PCR-RFLP等遗传分析.