蚀斑法定量测定HSV-2病毒颗粒的优化实验条件

目的 建立稳定易操作的HSV-2蚀斑技术,为纯化和定量测定HSV-2毒株的感染性研究提供依据。方法HSV-2病毒悬液接种至Hela细胞单层,分别经37℃吸附和室温吸附60min,用含0．75％琼脂糖或0．75％羧甲基纤维素RPMI 1640液覆盖,3d后用1％结晶紫染色5min,记数蚀斑数量,在挑取蚀斑接种扩增及保祓的同时,应用PCR法对蚀斑培养物进行鉴定。结果 蚀斑经1％结晶紫染色在Hela细胞单层上呈紫色,多为圆形,着色深,散在分布,与周围区域界限明显。用琼脂糖和羧甲基纤维素覆盖下所形成的蚀斑大小及形状不同,但病毒滴度差异无显著性（P〉0.05）。经室温和37℃吸附的病毒滴度差异亦无显著性（P〉0．05）。结论 建立了简便易行的蚀斑形成测定方法,可准确滴定HSV-2病毒感染数量和感染力。     

猴疱疹病毒(B病毒)抗体检测方法的比较研究

目的 对HSV-1作抗原的玻片酶免疫法（EIA）用于B病毒抗体检测的可靠性进行研究。方法 用HSV-1为抗原的玻片酶免疫法（EIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）与B病毒为抗原的斑点酶免疫法（DIA）、免疫荧光法（IFA）及酶联免疫吸附法（ELISA）对猕猴血清进行B病毒抗体检测的比较分析。结果 HSV-1为抗原的EIA与B病毒为抗原的DIA、IFA和ELISA检测结果的符合率分别为100％、95．6％和97．4％；HSV-1为抗原的EIA检测确定的阴性血清样本，经B病毒抗原的IFA检测均为阴性；在HSV-1为抗原的EIA确定的779份阴性血清中，经B病毒抗原的ELISA检测，有2．6％（20份）为阳性；HSV-1抗原的EIA和HSV-1为抗原的ELISA检测均为阴性的20份血清样本，经B病毒抗原的ELISA检测，18份仍为检出阴性，2份为阳性。结论 HSV-1为抗原的EIA的检测结果与B病毒抗原的DIA、IFA和ELISA的检测结果一致性较好。同时，用HSV-1抗原进行B病毒抗体检测，存在极少数阳性动物漏检的可能。     

SARS-CoV细胞空斑试验

目的 建立适用于生物安全三级实验室操作的SARS-CoV空斑试验方法.方法 SARS-CoV10倍系列稀释接种Vero-E6细胞,用0.6%琼脂糖覆盖中性红着色(琼脂糖-中性红法)或覆盖1%甲基纤维素,4%甲醛固定,结晶紫染色(甲基纤维素-结晶紫法),空斑计数.结果 琼脂糖-中性红法病毒滴度为6.14 Lg pfu/mL,甲基纤维素-结晶紫法病毒滴度为6.57 Lg pfu/mL.结论 二种空斑试验方法相比,病毒滴度无明显差异.甲基纤维素-结晶紫空斑试验法形成的空斑比琼脂糖-中性红法清晰、操作简单安全、结果可长期保存.     

猴B病毒抗体不同检测方法的比对

目的猴B病毒(monkey B virus,BV),也称猴疱疹病毒I型(Cercopithecine herpesvirus 1),是重要的人兽共患病原。根据国家标准,猴B病毒作为抗原检测抗体,但由于生物安全问题,抗原制备受到很大限制,因此使用替代抗原进行抗体血清学检测并进行比对验证。方法应用2种ELISA方法(抗原分别为BV和HVP2)和1种免疫酶法EIA方法(抗原为HSV-1)对本实验室135份送检恒河猴血液样品进行筛查,对阳性及可疑样品再以免疫荧光法IFA和Western blot方法(抗原为HSV-1)以及以HSV-1 g C1纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法验证。结果HVP2-ELISA、BV-ELISA和HSV-1-EIA阳性检出率分别为32.6%、37.8%和34.8%;3种方法检测结果一致的样品占91.1%(123/135),阳性结果可被IFA和WB确证;可疑样品12份,33.3%(4/12)的样品经验证检验为阳性。结论与BV抗原相比,替代抗原HSV-1的敏感性和特异性较HVP2更为接近;阳性样品及可疑样品的确证检验应使用多种方法,避免漏检。     

两种方法检测猕猴B病毒抗体的初步探讨

【摘要】用BV DIAdot Kit和BV EIA抗原片对本中心100份经HSV-1抗原片检测为阳性,150份HSV1抗体阴性的食蟹猴血清进行B病毒抗体检测。结果发现,BV DiAdot Kit对150份阴性血清的阳性检测出率为8．7％,而B、EIA的阳性检测率为18．o％,二者的符合率90．7%。后者阳性检测率明显高于前者。用上述两种方法对100份HSV-1抗体阳性血清（ - )进行检测发现,BV DLAdotKit和BV EIA的阳性检出率均为100％。后者价格低廉且对HSV-1抗体阴性血清的阳性检出率较高,值得在国内猕猴生产和出口单位大力推广。     

登革病毒速成甲基纤维素半微量空斑试验的建立

目的：建立一种不需预先制备细胞单层的速成甲基纤维素半微量空斑技术。方法：以登革Ⅱ型病毒为代表，对速成法和常规法的实验条件、可靠性、敏感性、重复性等作系统研究。用方差分析和ｔ检验对实验结果进行统计学处理。结果：速成法重复性好，简单快速，敏感稳定，速成法空斑平均水平高于常规法（α１＞α２）。结论：速成甲基纤维素半微量空斑技术是一种可靠易行的病毒空斑新技术，可用于鉴定和滴定病毒，具有较大的实用和推广价值。     

靶向单纯疱疹病毒1型活性小分子化合物的筛选及鉴定

目的 双向筛选抗单纯疱疹病毒1型(HSV-1)或促进HSV-1在肿瘤细胞内复制的小分子活性药物,为抗病毒药物研发或溶瘤病毒联合疗法奠定研究基础。方法 通过PCR扩增、产物测序对供试病毒HSV-1 F株进行鉴定;采用TCID₅₀法测定HSV-1滴度;建立病毒核酸实时荧光定量PCR检测体系;通过细胞增殖抑制实验和实时荧光定量PCR检测体系筛选具有促进HSV-1在LN229细胞内复制活性的化合物;通过流式细胞术和病毒空斑减数实验筛选具有抗HSV-1的化合物。结果 PCR扩增、产物测序结果确定供试病毒为HSV-1 F株;成功建立病毒核酸实时荧光定量PCR检测体系,灵敏度高;化合物佛司可林(FOR)可协同HSV-1抑制LN229细胞的增殖,并促进HSV-1复制相关基因ICP4、UL12和Us6的表达;化合物盐酸石蒜碱(LYC)可抑制HSV-1诱导的细胞凋亡,并减少HSV-1病毒形成空斑数、缩小空斑大小。结论 FOR具有促进HSV-1复制相关基因在肿瘤细胞中表达的活性,有望成为HSV-1溶瘤联合治疗的候选药物;LYC可降低HSV-1诱导的细胞凋亡率,减少病毒空斑数,具有潜在的...     

黄芪总多糖抗人疱疹病毒的初步实验研究

目的 开发利用黄芪的抗病毒性质。方法 我们以阿昔洛韦（ACV）为阳性对照，采用对病毒所致细胞病变的抑制及空斑减数实验，观察黄芪总多糖抗人疱疹病毒（HSV）的药效。结果 在Hep2细胞系统中，ACV对HSV-1HS-1株和HSV-2333株增殖抑制的ED50为20.04μg/mL、10.85μg/mL，对HSV-2333株的相应ED50为6.04μg/mL、5.43μg/mL、7.50μg/mL。结论 ACV抑制HSV-1HS-1株和HSV-2333株增殖的治疗指数（Treatment Index,TI)为54和58。总多糖对HSV-1HS-1株增殖抑制的TIs为ACVTIs和5.5和3.3倍。值得开发利用。     

检测抗HSV-1IgG的斑点金免疫渗滤方法的建立

目的：建立检测人血清中抗单纯疱疹病毒Ⅰ型IgG（抗HSV-1 IgG）的斑点金免疫渗滤法（DIGFA）。方法：增殖纯化HSV-1抗原并包被于硝酸纤维素膜，自制胶体金并用于标记羊抗人IgG，自制斑点金免疫渗滤检测装置，用于检测血清中抗HSV-1 IgG。结果：当血清样本中抗HSV-1 IgG为阳性时，滴加的金标羊抗人IgG可使检测装置膜上出现红色斑点。以DIGFA与酶联免疫吸附试验（ELISA）用于检测血清样本41份，两法差异无显著性（X^2=0.01，P〉0.05）。结论：建立了检测抗HSV-1 IgG的斑点金免疫渗滤方法，该法较其他方法检测时间短，操作简便快捷。     

狨猴血清中重组人5型腺病毒中和抗体滴度的测定

目的构建表达荧光素酶与绿色荧光蛋白报告基因的重组人5型腺病毒rAd5/Luc/GFP,检测血清中和抗体最佳实验方法, 分析小型灵长类动物普通棉耳狨猴体内腺病毒5型中和抗体水平,为评价腺病毒载体疫苗提供实验动物基础数据。方法利用 ADMax包装系统,首先构建穿梭质粒pDC315-Luc-GFP,将所得的穿梭质粒和骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293A细胞, 进行重组人5型腺病毒（rAd5/Luc/GFP）的包装。通过3次空斑形成实验筛选出单克隆重组腺病毒,并在大量扩增单克隆腺病毒 后用CsCl密度梯度离心法进行浓缩纯化。采用TCID50法测定纯化后病毒滴度,并挑选进行中和实验的最优病毒滴度。将合 适病毒滴度的rAd5/Luc/GFP与狨猴血清混合预孵育后感染293A细胞,分别采用化学发光法及流式细胞术,对14只普通棉耳狨 猴血清中腺病毒5型中和抗体进行检测。结果PCR、酶切和测序结果均表明穿梭质粒pDC315-Luc-GFP构建成功;GFP检测 结果证明重组人5型腺病毒rAd5/Luc/GFP包装扩增成功,病毒滴度可达6.9×1011.5 PFU/mL。两种不同方法检测检测14只狨猴 的中和抗体结果一致性较好（P<0.05,Kappa=0.811）,化学发光法或流式细胞术检测阳性狨猴比率分别为28.6%（4/14）或21.4% （3/14）,化学发光法检测得其中2只狨猴中和抗体滴度为1/16,另2只为1/32,而流式细胞术检测得滴度均为1/16。结论化学发 光法是一种快速,准确,适用于多物种的方法,其灵敏度略高于以GFP为报告基因的流式细胞术（7.2%）。普通棉耳狨猴体内 Ad5血清阳性率较低,有望应用基于此型或其他型别腺病毒作为载体进行基因治疗和基因疫苗研究。     

MTT分析法、空斑减数法及CPE观察法评估药物体外抗病毒效果的比较与分析

目的:比较MTT分析法、空斑减数试验及细胞病变效应(CPE)观察3种方法在评估药物体外抗病毒效果分析中的优劣,为选择适宜的药物体外抗病毒效果的检测方法提供实验依据。方法:分别采用 CPE法、MTT分析法和空斑减数试验法评价大黄素于体外抗疱疹病毒 1 型、疱疹病毒 2 型和柯萨奇病毒增殖的效果,比较 3 种检测方法的结果,并分析该方法的实用性与利弊。结果:在抗疱疹病毒增殖的检测中,MTT法与空斑减数法所测结果具有显著性差异,空斑减数法比MTT法更准确,但对抗柯萨奇病毒增殖的检测,MTT法与空斑减数法无明显差异。结论:MTT法与 CPE法结合,可广泛用于对抗病毒药物的筛选,但对于疱疹病毒类非杀细胞病毒,使用空斑减数法较好。     

荔枝核提取物体外抗病毒活性及其机制研究

目的:研究荔枝核提取物(LSE)的体外抗病毒活性,并初步研究其抗病毒的作用机制.方法:采用细胞病变效应(CPE)减少法和MTY法检测LSE对柯萨奇B3病毒(Cox B3)、呼吸道合胞病毒(RSV)以及单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)的体外抗病毒活性,并通过观察直接杀病毒作用、对宿主细胞的保护作用、抑制病毒吸附作用以及在病毒感染后不同时间加入实验,对LSE抑制HSV-1的作用机制进行探讨.结果:LSE有一定的细胞毒性,它不能抑制Cox B3在宿主细胞内的增殖,但对RSV、HSV-1和HSV-2表现出明显的浓度依赖性抗病毒活性,其IC<,50>值分别为32.3,27.9和20.4μg/mL.该提取物预培养Vero细胞后不能保护细胞免受HSV-1感染,但它对HSV-1有直接的灭活作用.LSE可影响HSV-1对Vero细胞的吸附,当浓度为31.3μg/mL时对病毒吸附的抑制率为51%.ISE对HSV-1在细胞内的增殖表现出很强的抑制活性.结论:LSE具有较强的体外抗RSV和HSV活性,它对HSV的抑制作用可能通过多种方式和途径实现.     

藏药甘青乌头生物碱抗单纯疱疹病毒Ⅱ型体内外作用

目的探讨藏药甘青乌头脂溶性生物碱（ALA）和水溶性生物碱（AWA）抗单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）的作用和机制。方法四甲基偶氮唑蓝法测定细胞毒性,细胞病变作用法和蚀斑法测定甘青乌头生物碱体外抗HSV-2活性,以半数有效浓度和治疗指数为评价指标;荧光定量聚合酶链式反应法（FQ-PCR）和蚀斑法考察ALA和AWA体外抗HSV-2作用机制。用HSV-2建立小鼠脑炎模型,对AWA体内抗HSV-2的活性进行评价。结果 ALA和AWA对Vero细胞的半数中毒浓度分别为3.57和7.87mg/mL。ALA和AWA半数有效质量浓度分别为4.99和2.81 mg/mL,治疗指数分别为0.72和2.80。ALA和AWA均能直接灭活HSV-2,能够显著抑制HSV-2的感染性。ALA对吸附到非洲绿猴肾细胞的HSV-2没有抑制作用,能微弱抑制HSV-2大分子的增殖,对HSV-2 DNA的复制没有作用。AWA能够抑制HSV-2吸附,抑制HSV-2大分子的增殖,抑制HSV-2 DNA的合成,抑制倍数达10~2。AWA对小鼠的半数中毒质量浓度为0.28mg/kg。AWA延长了小鼠的平均存活时间,对小鼠的死亡显示出10%的保护率。结论 AWA抗HSV-2的活性大于ALA,ALA主要通过直接灭活HSV-2,AWA通过抑制HSV-2复制循环的各个环节起作用。     

含Ⅰ型单纯疱疹病毒包装信号序列片段的分离及扩增子质粒双表达载体的构建

利用基因工程技术分离出含有Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV－1）包装信号序列和HSV－1基因组复制起点序列的片段，表达外源基因所必需的启动子序列以及其下游作为报告基因的lacZ基因片段，构建成质粒型HSV－1载体pHSVL。用脂质体介导的方法可将该质粒转染入经辅助病毒HSV－1tsK株超感染的Vero细胞，并将其包装成HSV－1假型病毒颗粒，可如天然病毒一样再感染传代细胞和神经细胞并在其中进行基因表达。在pHSVL的基础上，我们还构建了一种可同时表达两种外源基因的质粒型疱疹病毒载体pHLCL，即在pHSVL中插入第二个转录单位：HCMVIE启动子和其下游的荧光素酶基因（lucgene），由此获得的pHLCL病毒接种传代细胞证明它可在其中同时表达两种报告基因．本研究成功地构建了两种质粒型HSV－1载体，其独特的基因转移方式使之在神经生理、病理及神经系统疾病的基因治疗的实验研究中都具有广阔的应用前景。     

灰树花多糖在小鼠体内抗病毒作用的研究

灰树花多糖具有增强免疫应答的作用。为了研究其抗病毒的作用，作者将１０ＬＤ_（５０）的流行性感冒病毒（ＰＲ８／３４株）或Ⅰ型单纯疱疹病毒分别接种小鼠，观察该成分对小鼠的保护作用。结果证明，抗流行性感冒病毒的保护效应十分明显，且与使用的剂量相关。当灌胃剂量为２０００、１０００及５００ｍｇ／ｋｇ／ｄ，病毒对照组１００％死亡时，病死率分别下降７０、６０和３０％，而抗单纯疱疹病毒的最佳浓度则较低，其病死率分别下降１０、２０和７０％。总之，灰树花多糖具有较明显的对抗流行性感冒病毒和Ⅰ型单纯疱疹病毒的作用。     

靶向S1PR3基因shRNA慢病毒表达载体构建及功能鉴定

目的：构建靶向小鼠S1PR3基因的shRNA慢病毒表达载体,并验证其对内皮祖细胞迁移能力的影响。方法依照shRNA设计原则,合成对应的shRNA序列,将其克隆到PHBLV载体中,使用三载体系统进行病毒包装,收集制备成功的病毒,并用荧光显微镜法测定病毒滴度,使用病毒感染EPC后,测定各组细胞中S1PR3蛋白表达情况,选择合适的病毒感染EPC后,测定其对EPC迁移能力的影响。结果成功将shRNA序列克隆到慢病毒表达载体PHBLV-U6-RFP,表达质粒与辅助质粒共转染293细胞后48 h就可以看到细胞中成功表达红色荧光。收集培养成功病毒感染小鼠EPC,可以不同程度干扰细胞中S1PR3蛋白表达,S1PR3蛋白表达受到抑制后,EPC的迁移能力明显减弱。结论我们成功构建了可以有效干扰S1PR3表达的慢病毒载体,并初步观察了其对EPC细胞的迁移能力的影响,为后续进一步调控S1PR3相关的细胞功能的研究奠定了基础。     

甘草甜素对HSV-1抑制作用的实验研究

目的:观察甘草甜素对单纯疱疹病毒Ⅰ型的抑制作用,为临床更为有效的治疗单纯疱疹病毒性脑炎探索新的药物.方法:体外培养Vero细胞,分成甘草甜素在病毒吸附vero细胞后加入病毒、吸附前甘草甜素预处理细胞以及吸附前甘草甜素预处理病毒,通过观察空斑形成单位来评价甘草甜素对单纯疱疹病毒Ⅰ型的抑制作用,以及作用发生于病毒感染的哪个阶段.结果:病毒吸附vero细胞后加入甘草甜素能明显抑制病毒所致的空斑形成,IC50为0.56mmol/L.吸附前甘草甜素预处理细胞以及吸附前甘草甜素预处理病毒,对病毒所致的空斑形成无明显影响.结论:甘草甜素能明显地抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型的复制,它的作用是发生在病毒穿入细胞后的阶段,不能阻止病毒对细胞的吸附,也不能直接灭活病毒.     

检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种高敏感度的检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)DNA的实时荧光定量PCR方法,为针对HSV-2潜伏感染的治疗性疫苗和抗病毒药物疗效提供一个评价方法。方法 依据HSV-2糖蛋白D(gD)基因序列,使用序列比对软件,选取其保守区序列设计引物及TaqMan探针并进行筛选;以gD基因重组质粒pcDNA3-HSV-2 gD作为标准模板,对该检测方法的反应条件进行优化,提高其检测特异性、敏感度和重现性。结果 该检测方法特异性好,检测的最低拷贝数可达到2个拷贝,线性范围为2×10⁰~2×10⁸拷贝/反应,是普通PCR敏感度的10³倍。该检测方法组间和组内变异系数均低于5%,说明该检测方法具有良好稳定性。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法用于检测痕量HSV-2 DNA具有特异、敏感、定量和重现性好的优点。     

用中性红释放试验研究NK细胞在体外杀伤HSV-1感染的靶细胞的作用

本文报道用中性红释放试验检测自然杀伤细胞(NK细胞)体外杀伤单纯疱疹病毒-Ⅰ型(HSV-1)感染的靶细胞,并同时与~(51)Cr释放试验作比较。结果表明,中性红释放试验检测NK细胞的最适条件:以0.1％中性红标志L929细胞(1×105个/ml);4个空斑形成单位(PFU)PISV-1(KOS株)体外感染L929细胞2h,可得到较好结果。每项实验均同时进行常规的~(51)Cr标志释放试验。结果显示两法具有较好一致性。     

Detection of herpes simplex virus type 1 in rheumatic valvular tissue

Background Rheumatic heart disease (RHD) is the most important sequela of rheumatic fever (RF):evidence that streptococcal infection is aetiological is prominent, but sometimes contradictory. Acute HSV-1 infection in mouse leads to carditis and valvulitis whereas recurrent infection results in inflammatory granulomatous lesions that resemble Aschoff bodies. Cells containing HSV-1 inclusions or virus infected giant cells appear similar to Anitschkow cells or Asehoff cells respectively. We hypothesized that HSV-1 infection also may be involved in RHD.Methods Formalin-fixed, paraMn-embedded valvular tissue samples from 32 patients with RHD were investigated for evidence of HSV-1 infection. HSV-1 antigen was detected by immunohistoehemistry, using HSV-1-specific monoclonal and polyclonal antibodies. HSV-1 glyeoprotein D gene sequences were amplified by nPCR,using β-globin gene amplification in the same samples as internal control. Valvular tissue from 5 cases of sudden death and 3 cases died of neisseria meningitis without a history of valvular disease was used for comparison. HSV-1-infected lung tissue was used as positive control.Results HSV-I antigens were detected in valvular tissues from 21 of 32 (65.6%) patients. Fifteen of these 21 (46.9% of cases), but no antigen-negative sample, were positive also for HSV DNA. Nueleotide sequence of PCR products was homologous to the targeted region of the HSV-1 glycoprotein D gene. HSV-1 antigen was present also in one case of sudden death but viral DNA was not found in any tissue sample from tile comparison group. Results from reagent and positive controls were as anticipated.Conclusions This is the first study to show the presence of HSV-1 antigen and genomic DNA in valvular tissues from patients with RHD and provides evidence for an association of HSV-1 infection with some cases of rheumatic valvular disease.