PCR-SSCP技术检测细菌16SrRNA基因以快速鉴定葡萄球菌

目的:利用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测细菌16SrRNA基因以快速鉴定葡萄球菌.方法:采用细菌共有的16 SrRNA基因的保守区引物作为通用引物,对葡萄球菌属常见的几种细菌进行PCR扩增,产物进行单链构象多态性分析.结果:采用一对引物的SSCP图谱各细菌之间难以区别;采用两对引物的SSCP图谱条带相对迁移率及条带之间的间距差异较大,可相互区别;金黄色葡萄球菌的标准株和临床株的图谱完全一致.结论:PCR-SSCP技术可方便快捷地检测葡萄球菌.     

通用引物PCR-SSCP技术分析16SrRNA基因特征快速鉴定细菌

目的探讨通用引物聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)技术在细菌检测中的应用。方法选取9种常见的细菌，采用通用引物对细菌的16SrRNA基因进行PCR扩增，产物进行单链构象多态性分析，并以标准菌株为对照。结果一对引物扩增产物SSCF，图谱各细菌之间难以区别；两对引物扩增产物SSCP图谱条带数日、相对迁移率及条带之间的间距存在明显，可相互区别；3种细菌的标准菌株和临床菌株的SSCP图谱完全一致。结论采用针对16SrRNA的通用引物PCR-SSCP技术以标准菌株为对照可方便快捷地检测细菌。     

通用引物PCR-SSCP技术分析16Sr RNA基因特征快速鉴定细菌

目的探讨通用引物聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术在细菌检测中的应用.方法选取9种常见的细菌,采用通用引物对细菌的16SrRNA基因进行PCR扩增,产物进行单链构象多态性分析,并以标准菌株为对照.结果一对引物扩增产物SSCP图谱各细菌之间难以区别;两对引物扩增产物SSCP图谱条带数目、相对迁移率及条带之间的间距存在明显,可相互区别;3种细菌的标准菌株和临床菌株的SSCP图谱完全一致.结论采用针对16SrRNA的通用引物PCR-SSCP技术以标准菌株为对照可方便快捷地检测细菌.     

脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

目的 初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法 根据病脊液标本中常见病原菌16SrRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物,制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针,以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针,将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增．扩增过程中用生物素标记;将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交．检测脑脊液中细菌的感染情况。结果 所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。     

常见食源性感染致病菌属、种用PCR-RFLP及PCR-SSCP技术鉴定探讨

[目的]探讨运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)进行食源性感染常见致病菌属种鉴定的可行性.[方法]选择细菌23S rDNA基因作为鉴别细菌属的靶基因,通过设计合适的通用引物进行PCR扩增,并对13属食源性感染常见致病菌和5种不同血清型大肠杆菌扩增产物的酶切片段进行RFLP分析和SSCP分析.[结果]运用通用引物可以扩增出13属食源性感染常见致病菌的23S rDNA基因HpaⅡ酶切产物的RFLP分析表明,不同种属的致病菌表现出不同的RFLP图谱,利于进行细菌属的鉴定.不同种属食源性感染常见致病菌SSCP图谱变异性更大,不利于进行种属间鉴别.对5种不同血清型大肠杆菌的23S rDNA基因扩增产物的RFLP和SSCP分析表明,不同血清型大肠杆菌表现出相似的RFLP图谱,SSCP图谱的变异性较大,这有利于进行血清型间鉴别甚至株间的鉴别.[结论]PCR-RFLP和PCR-SSCP具有应用于食源性感染常见致病菌种、属鉴别诊断的潜力.     

常见食源性感染致病菌属、种用PCR-RFLP及PCR-SSCP技术鉴定探讨

[目的]探讨运用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性分析(IZCR-RFLP)和聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR-SSCP)进行食源性感染常见致病菌属种鉴定的可行性。[方法]选择细菌23S rDNA基因作为鉴别细菌属的靶基因，通过设计合适的通用引物进行PCR扩增，并对13属食源性感染常见致病菌和5种不同血清型大肠杆菌扩增产物的酶切片段进行RFLP分析和SSCF，分析。[结果]运用通用引物可以扩增出13属食源性感染常见致病菌的23S rDNA基因Hpa Ⅱ酶切产物的RFLP分析表明，不同种属的致病菌表现出不同的RFLP图谱，利于进行细菌属的鉴定。不同种属食源性感染常见致病菌SSCF，图谱变异性更大，不利于进行种属间鉴别。对5种不同血清型大肠杆菌的23S rDNA基因扩增产物的RFLP和SSCP分析表明，不同血清型大肠杆菌表现出相似的RFLP图谱，SSCP图谱的变异性较大，这有利于进行血清型间鉴别甚至株间的鉴别。[结论]PCR-RFLP和PCR-SSCP具有应用于食源性感染常见致病菌种、属鉴别诊断的潜力。     

特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立和优化

目的以16S rRNA编码序列为靶基因,建立特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法并优化。方法以类鼻疽伯克霍尔德菌标准菌株K96243的16S rRNA编码序列为靶序列,通过Primer Premier 5软件搜索特异的引物,以该菌为模板,优化特异引物PCR的退火温度、退火时间和反应循环数等条件。得到最优PCR反应条件后,将该方法用于检测临床分离的类鼻疽伯克霍尔德菌菌株和常见细菌感染病原体(大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型链球菌和乙型链球菌),评价该方法的有效性和特异性。结果共设计3对引物,分别扩增16S rRNA编码序列283～672、760～1 061、771～1 193片段,优化后PCR反应条件为:94℃预变性4 min,94℃变性40 s,54.5℃退火20 s,72℃延伸40 s,24个循环,最后延伸1 min;特异性分析发现此方法能将类鼻疽伯克霍尔德菌与其他常见感染病原菌进行有效地鉴别诊断。结论成功建立并优化一种快速鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的方法,通过此方法能有效的从单个菌落中和基因组水平鉴定临床分离的8株类鼻疽伯克霍尔德菌。     

奇异变形杆菌、洛菲氏不动杆菌16s rRNA 3'-23s rRNA 5'间序列的克隆及测序

目的：对奇异变形杆菌、洛菲氏不动杆菌16s rRNA3’～23s rRNA 5’间序列（16S～23S rRNA intergenic spacer region，ISR）进行克隆测序，为分子探针技术鉴定两菌奠定基础。方法：针对临床常见致病菌16s rRNA3’～23s rRNA5’间序列两端的16S及23SrRNA保守序列设计PCR扩增的通用引物，对两菌进行扩增，利用PMD-18 T Vector质粒对两菌的PCR产物进行T载体克隆构建，测序后申报Genbank。结果：两菌的通用引物扩增产物构建的T载体克隆，测序结果经Blast分析，确定为两菌的ISR序列，申报Genbank获得接收。结论：成功的对奇异变形杆菌、洛菲氏不动杆菌ISR序列进行了克隆测序，该序列可以用于两种菌的通用引物PCR扩增技术鉴定。     

儿童血流感染多重PCR检测方法的建立

目的：探索建立一种可快速鉴定儿童血流感染常见病原菌的多重PCR体系。方法通过16S rD－NA－PCR筛选出7种引起血流感染的常见病原菌,并针对这些病原菌设计特异性引物组合成多重PCR系统,检测该系统的特异性和敏感性;将该体系的检测结果与血培养及16S rDNA－PCR比较。结果该体系可以扩增出7种病原菌的特异性基因片段,病原菌检出率高于血培养且与16S rDNA－PCR差异无统计学意义,敏感性和特异性良好。结论本研究建立的多重PCR方法可快速、准确地鉴定引起儿童血流感染的常见病原菌,可作为快速检测方法在临床实验室中应用。     

基于16S rRNA序列鉴定临床不常见细菌

目的以16S rRNA基因为靶序列,建立核糖体测序方法鉴定临床不常见细菌。方法利用通用引物聚合酶链反应(PCR)扩增细菌16S rRNA基因,对PCR产物进行测序,在GenBank中对测序结果进行Blastn分析。结果10株临床常见细菌测序结果与表型鉴定符合,检测出4株临床不常见细菌。结论 16S rRNA基因测序可以作为鉴定临床不常见细菌的重要方法之一。     

2008-2010年血培养细菌分布与耐药性变迁

目的了解我院2008-2010年血培养细菌的菌种分布、科室分布及耐药变迁特点,为临床合理使用抗生素提供依据。方法患者血液培养标本经BACTEC9050血培养仪培养,分离所得菌株用美国德灵公司Microscan-walkaway96全自动微生物鉴定仪进行菌株鉴定和药敏实验。结果连续三年凝固酶阴性葡萄球菌分离率居首位,大肠埃希氏菌居第二位,肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼/溶血不动杆菌、铜绿假单胞菌是导致血液感染的主要病原菌;大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南100%敏感,对哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星较敏感,但对两药耐药率呈逐年上升趋势;各类抗菌药物对鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌耐药率较高,呈逐年上升趋势,且出现泛耐药菌株;血培养阳性球菌中未发现耐万古霉素和利奈唑胺的金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌。结论血液培养的细菌种类多样,且分离率居前几位细菌的耐药率较高。临床和实验室应加强血流感染细菌的耐药性监测。     

311例新生儿败血症病原体分离及其耐药性分析

目的分析新生儿重症监护病房新生儿败血症的病原体分布、临床特点、细菌耐药情况及治疗效果。方法回顾性分析新生儿重症监护病房新生儿败血症311例患儿的临床资料。结果早发型败血症患者中,病原菌依次为凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、B族溶血性链球菌、屎肠球菌等;晚发型败血症患者中,依次为凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等。早发型和晚发型败血症中都是凝固酶阴性葡萄球菌败血症发生率最高,且耐药率很高。肺炎克雷伯菌和大肠杆菌中产超广谱β-内酰胺酶高,感染致败血症病情危重。肺炎克雷伯菌是医院感染的主要致病菌,占50%。结论凝固酶阴性葡萄球菌已成为新生儿血培养的首位菌,其耐药性日渐严重。肺炎克雷伯菌是新生儿重症监护病房内医院感染的重要致病菌,它和大肠杆菌败血症的病情均凶险,病死率高。     

3 063株病原菌分布及耐药性监测分析

目的 监测我院3年间主要病原菌分布及耐药性．指导临床合理使用抗生素。方法 从2000年1月～2002年12月我院患者血液、尿液和痰标本中分离的病原菌．采用纸片扩散法监测抗生素耐药性。结果 3年间从主要标本中共分离3063株病原菌,革兰阳性球菌27．0%,革兰阴性杆菌56．7％,真菌4．8％;病原菌列前8位的菌种依次为大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistance staphylococcus aureus,MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRS epidermidis,MRSE)分离率分别为58．3％、62．9％．葡萄球菌对万古霉素敏感性最好．其次是头孢哌酮／舒巴坦、头孢唑啉、头孢他啶．耐药率依次为3．9％、23．4％、26．5％;大肠埃希菌对亚胺培南的耐药率最低2．1％,对其他抗生素耐药率较低的依次有头孢哌酮舒巴坦、头孢曲松、头孢他啶。耐药率分别为15．0％、21．9％、26．8%,大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶株(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)分离率为26．0％．铜绿假单胞菌中多重耐药株明显增多,对亚胺培南的耐药性持续增高．已达29．9％。结论 临床医师应密切关注本地区的病原菌分布及耐药性特点．合理应用抗生素。     

2012年成都市第三人民医院细菌耐药性监测数据分析

目的了解2012年度医院临床分离病原菌的分布和耐药情况,为指导合理用药,控制医院感染提供参考依据。方法采用德灵Microscan96全自动生化鉴定系统对临床分离细菌进行药物敏感试验,依据CLSI2012年标准,采用WHONET5．6软件对数据进行统计分析。结果共分离出病原菌株5854株,前10位病原菌依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、肺炎链球菌、副流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、屎肠球菌。未检测到对万古霉素耐药的葡萄球菌;屎肠球菌对万古霉素耐药率为5．8％;大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌产超广谱B内酰胺酶检出率分别为47．7％和33．8％;铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌对亚胺培南耐药率分别为30．0％和37．5％。结论病原菌耐药形势严峻,应定期进行细菌耐药监测,及时掌握细菌耐药性变化,为指导临床合理使用抗生素提供依据。     

败血症患者血液中病原菌分布、耐药性及感染危险因素调查

目的 对某院近6年败血症患者血液中细菌念珠菌分布、耐药性及感染危险因素进行调查,为败血症防治提供依据.方法 大多数分离细菌的鉴定和药敏试验利用BD Phoenix仪,少数利用手工鉴定和K-B法.念珠菌利用显色平板分离和鉴定,K-B法药敏.数据分析用WHONET5.4软件.结果 血液中病原菌主要种类为大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌.G-杆菌中耐药率较低的头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦和头孢他啶,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶比例为33.3%～34.9%和32.9%～36.0%.G+球菌万古霉素敏感率为100.0%.其他抗生素耐药率较低的为阿米卡星和氯霉素,金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌甲氧西林耐药率为26.9%～35.5%和72.7%～74.3%.败血症感染危险因素主要包括住院天数>5 d、动静脉插管、手术、穿刺、吸氧、泌尿道插管和化疗.结论 应重视对疑为败血症患者进行血液培养,根据培养鉴定和药敏结果合理使用抗生素.     

南充地区新生儿败血症的病原菌及耐药性分析

目的了解近2年新生儿败血症的病原菌分布及其耐药状况。方法对2005年1月～2006年11月我院新生儿血培养结果进行分析和总结。结果69株阳性标本中表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和金黄色葡萄球菌分别占26．08％、15．94％和13．04％，对多种抗生素耐药，青霉素、苯唑西林的耐药率分别为100．ooA、94．4％及88．88％，均对万古霉素敏感，仅1株溶血葡萄球菌耐药；革兰阴性菌中大肠埃希菌占首位，其次为肺炎克雷伯菌、假单胞菌属、肠杆菌属，对氨苄头孢唑林、青霉素耐药率均为100％；抗菌活性较好的药物是亚胺培南、环丙沙星、头孢噻肟、氯霉素和庆大霉素。结论葡萄球菌是新生儿败血症的主要病原菌；新生儿败血症的病原菌具有多重耐药性，应积极防治。     

血培养常见病原菌分布及耐药性分析

目的 了解我院5年血培养中分离菌株的分布构成比及耐药情况.方法 血培养标本经BD 9050血培养仪培养,分离所得菌株用法国生物梅里埃ATB Expression细菌鉴定/药敏系统进行鉴定和药敏试验,同时根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI/NCCLS)标准,检测大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的超广谱β-内酰胺酶(ESBL...     

小儿急性下呼吸道感染病原菌检测及药敏分析

目的调查本院收治的小儿下呼吸道感染中的常见细菌在各年龄组的分布及药物敏感性,以指导临床用药。方法对本院2008~2009年儿科收治的856例急性下呼吸道感染痰培养阳性者应用K-B法进行药敏试验。结果明确有细菌感染的为415份,阳性率48.5%,共获病原菌439株,其中革兰氏阴性菌308株。所获取的病原依次为大肠埃希氏菌98株,肺炎克雷伯菌84株,金黄色葡萄球菌72株,副流感嗜血杆菌63株,铜绿假单胞菌35株,肺炎链球菌22株,流感嗜血杆菌17株,其他48株;肺炎链球菌、流感嗜血杆菌随年龄增长而感染率逐渐升高,肺炎链球菌感染率在〉1岁患儿与〈1岁患儿之间差异有非常显著性（χ2=35.10,P〈0.001）。大肠埃希氏菌感染率在〈1岁与〉1岁患儿之间差异有非常显著性（χ2=11.02,P〈0.005）。大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南、哌拉西林/舒巴坦、头孢吡肟、头孢曲松、头孢他啶的敏感率高;金黄色葡萄球菌对万古霉素、头孢唑啉敏感率高;而肺炎链球菌对万古霉素、头孢唑啉、苯唑西林、青霉素、克林霉素的敏感率高。结论衡阳地区小儿下呼吸道感染的主要病原菌为革兰阴性杆菌,其中尤以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌多见,不同菌种对抗生素药物敏感性和耐药性均存在差异。应根据药敏试验合理选用抗生素治疗。     

2009-2011年我院感染主要细菌的分布及耐药监测

目的了解近3年医院感染的主要细菌分布及其对抗菌药物敏感性情况。方法对本院2009年1月-2011年12月住院患者的15 868例标本进行细菌培养,分离出的细菌用美国德灵公司Microscan-walkaway 96全自动细菌鉴定仪进行鉴定和药敏分析。结果共分离出细菌142类,1 783株,其中G-菌1 443株（80.93%）,G＋菌340株（19.07%）。常见菌种分布依次为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍氏/溶血不动杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌。1 783株细菌在各类标本中的分布以痰液最多,其次是尿液、血液、咽拭子、脑脊液、脓液等;常见菌种对多种抗菌药物的敏感性较低,各种肠杆菌属细菌对亚胺培南最为敏感,G＋菌对万古霉素最为敏感。结论近3年医院感染的细菌仍以G-菌为主,并主要存在于下呼吸道,且耐药严重。     

临床分离菌细菌谱及耐药性分析

目的 了解病原菌分布及耐药性变迁，给疾病诊断和合理使用抗生素提供帮助。方法 对1999～2001年临床送检的各类标本，用Microscan A／S-4自动细菌鉴定及药敏测试仪进行鉴定和药敏试验并对其结果进行分析。结果 分离出病原菌45种，位居前10位的细菌依次是大肠杆菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、溶血性葡萄球菌、志贺氏菌、落菲不动杆菌、阴沟杆菌、鲍曼不动杆菌。葡萄球菌对青霉素、氨苄青霉素已普遍耐药，耐药率大于93％，革兰氏阳性球菌对亚胺培南、呋喃坦啶高度敏感，耐药率小于13％，对头孢唑啉、头孢呋肟、美洛培南敏感，耐药率小于30％。革兰氏阴性杆菌(落菲不动杆菌除外)对氨苄青霉素耐药率大于79％。结论 病原菌种类多，球杆菌比逐年下降。条件致病菌和人体正常菌分离率越来越高。头孢类药物耐药率存在第1代、第2代、第3代、第4代依次下降和逐年增加的趋势。阴沟杆菌等多种细菌多重耐药现象严重。