呼吸内胚层及第二生心区与小鼠胚胎心动脉端发育关系

目的:探讨呼吸内胚层及第二生心区与小鼠胚胎心动脉端发育的关系。方法:对35例胚龄9~13 d小鼠胚胎心连续石蜡切片应用抗音猬因子(Shh)、抗Ptc1、抗Smo、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗胰岛因子(ISL-1)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行免疫组织化学和免疫荧光化学染色。结果:胚龄9~11 d,呼吸内胚层开始发育,其腹侧形成Ptc1阳性的内胚层细胞索,与紧邻的第二生心区咽前ISL-1阳性间充质细胞形成对称的锥体形结构,顶端突入动脉囊腔。胚龄12~13 d,随内胚层细胞索消失,气管腹侧ISL-1阳性间充质细胞数量明显减少,心包内主动脉和肺动脉分离。结论:发育中的呼吸内胚层可能通过Shh信号通路为第二生心区咽前ISL-1阳性间充质细胞的发育聚集提供位置信息,参与小鼠胚胎心流出道的正常形态发生。     

胚胎中胚层间充质细胞参与小鼠胚胎原始心管的形成

目的 探讨小鼠胚胎早期原始心管发育. 方法 对胎龄7.5-9 d小鼠胚胎心脏进行石蜡连续切片,连续切片进行HE染色,并用抗转录因子GATA4和抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体进行免疫组织化学染色. 结果 头端中胚层间充质细胞与小鼠胚胎原始心管及心包腔脏壁中胚层相延续;心肌早期分化标志蛋白转录因子GATA4和α-SMA在原始心管部位高表达. 结论 位于神经沟和原肠之间的胚胎中胚层间充质细胞参与原始心管和心包腔脏壁中胚层的形成;原始心管和心包腔脏壁中胚层细胞的迁移和分化机制不同.     

小鼠胚胎近端流出道隔的融合与心肌化研究

目的探讨心脏近端流出道隔的融合和心肌化过程及其机制。方法选用胚胎(embryonicday,ED)11.5至出生后1dC57BL6小鼠(简称C57小鼠)。采用免疫组化法测定横纹肌肌动蛋白αSCA,神经嵴细胞的标记物AP2及HNK1,凋亡相关分子activecaspase3的表达;采用TUNEL法原位检测细胞的凋亡程度。结果①近端流出道隔的融合及心肌化的时空模式:近端流出道心内膜垫于ED11.5开始融合,ED13.5基本完成融合;心肌化约从ED12.5开始,至ED15.5基本完成。整个心肌化过程呈现心肌从流出道隔由外向内的内向性生长趋势。②近端流出道隔HNK1的表达:从ED11.5到生后1d近端流出道隔极少或几乎无HNK1表达。③近端流出道隔AP2的表达:ED11.5几乎无表达,ED12.5、ED13.5可见少量表达,从ED14.5以后消失。④近端流出道隔细胞的凋亡:TUNEL和caspase3的检测均表明近端流出道隔的凋亡集中出现在ED12.5和ED13.5,一部分凋亡细胞可能为AP2阳性的神经嵴源性细胞。结论C57小鼠心脏近端流出道隔在胚胎发育早中期开始融合,并逐渐完成心肌化过程,心脏神经嵴细胞可能通过凋亡途径参与了该过程。     

小鼠胚胎心动脉囊的发生发育

目的:探讨小鼠胚胎动脉囊的发生发育及其与第二生心区的关系。方法:对胚龄9~13 d(ED9~13)小鼠头胸部切片做HE和免疫组织化学PAP法染色。结果:ED10,动脉囊出现于心流出道远端,管壁主要由胰岛素增强子结合蛋白-1(ISL1)阳性内皮和间充质细胞构成,可见第二生心区、原始咽腹侧壁内胚层的ISL1阳性细胞增生并迁移至动脉囊壁。ED11~12,心动脉端向尾端移位、心包腔向头端及背侧扩展及ISL1阳性细胞的添加使动脉囊大部降入心包腔。ED12~13,含有ISL1阳性细胞的主肺动脉隔与流出道嵴愈合,将心包内动脉囊分隔为升主动脉和肺动脉干;动脉囊壁ISL1阳性细胞分化为大动脉相邻及游离壁的平滑肌细胞。结论:小鼠胚胎动脉囊是第二生心区细胞添加在流出道远端形成的。动脉囊壁ISL1阳性细胞分化为流出道心肌和主肺动脉干的平滑肌。     

Cx43基因剔除小鼠心脏锥干部的异常发育

目的探讨Cx43基因缺陷小鼠心脏锥干部发育异常。方法选用胚胎（embryonic day,E）11．5d至出生后1dC57／BL6小鼠作为研究对象,根据基因型分为Cx43基因剔除纯合子（Cx43-／-）、杂合子（Cx43＋／-）及野生型（Cx43＋／＋）,采用聚合酶链反应方法鉴定基因型。免疫组化法测定横纹肌肌动蛋白α-SCA、平滑肌肌动蛋白α-SMA、神经嵴细胞的标志物AP-2α的表达;原位杂交方法检测AP-2α mRNA的表达。结果Cx43-/-出生后24h内即死亡。大体解剖见明显的右室流出道圆锥部异常膨隆。HE染色示右心室流出道壁大量异常小梁状组织增生突起,右室流出道腔明显狭窄。Cx43＋／-无明显异常。Cx43-／-近端流出道隔中央区域α-SCA的表达明显滞后。Cx43＋／-与Cx43-／-小鼠右室流出道与Cx43＋／＋比较可见比较强的α-SMA的表达,主要位于右侧锥干部的异常增生部位。Cx43-/-小鼠在E13．5流出道隔AP-2α蛋白及其mRNA水平表达均增多,且表达位置异常。结论Cx43 KO小鼠以右室流出道异常增生引起的梗阻性畸形为主要特征。Cx43 KO小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化迟滞。Cx43 KO小鼠锥干部α-SMA的表达不能正常消退,心肌细胞发育不成熟。神经嵴细胞的发育异常可能参与了Cx43基因缺陷小鼠锥干部畸形的发病机制。     

小鼠胚胎心脏各部分化发育成熟差异研究

目的 探讨α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和中间丝结蛋白与小鼠胚胎心脏分化发育成熟的关系. 方法 用免疫组化方法对胎龄9-19 d小鼠胚胎心脏连续切片进行染色. 结果 胎龄9 d,原始心室和流出道α-SCA、a-SMA表达较强,而结蛋白表达较弱.心房α-SCA、a-SMA的表达限于背侧壁和腹侧壁,静脉窦仅见少许α-SCA弱阳性细胞.心房和静脉窦则无结蛋白表达.胎龄10 d,心房和心室膨出,心脏各部均表达较强的α-SCA、α-SMA和结蛋白.α-SCA、α-SMA和结蛋白的表达于胎龄12 d达高峰.之后,α-SMA和结蛋白表达逐渐下降,但在右心室和流出道表达持续时间较长. 结论 α-SCA、α-SMA和结蛋白在小鼠胚胎心脏表达的时空特征表明小鼠胚胎心脏不同部位心肌分化发育成熟不同步.     

内皮间充质转化与急性病毒性心肌炎早期心肌纤维化的关系

目的:探讨心脏内皮间充质转化(EndMT)与急性病毒性心肌炎心肌纤维化形成的关系。方法:28只Balb/c小鼠随机分为对照组(n=8)、心肌炎组(n=10)和心肌炎+重组人骨形成蛋白7(rh-BMP7)干预组(干预组,n=10)。心肌炎组和干预组小鼠1次性腹腔接种柯萨奇病毒B3(CVB3),对照组小鼠腹腔注射等量病毒培养液,对照组和心肌炎组小鼠次日一次性腹腔注射生理盐水0.1 ml,干预组小鼠腹腔注射等量rh-BMP7(300μg/kg)以抑制转化生长因子(TGF-β1);7 d后处死小鼠取心脏,以苦味酸天狼星红染色后计算心脏胶原容积积分(CVF),实时RT-PCR法和Western blot方法检测小鼠心脏中TGF-β1、内皮细胞标志物(CD31和VE-cadherin)、成纤维细胞特异蛋白(FSP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原(Col1α1)的基因和蛋白表达情况。结果:与对照组比较,心肌炎组小鼠心肌坏死区出现明显心肌纤维化,也出现了以内皮细胞表型(CD31、VE-cadherin)丢失、间充质细胞表型蛋白(FSP-1、α-SMA)和胶原Col1α1增多为特征的EndMT现象;同时,TGF-β1表达明显增高;抑制TGF-β1可以同时逆转EndMT和心肌纤维化。结论:EndMT参与急性病毒性心肌炎心肌纤维化的形成,TGF-β1是重要介导因子。     

两种来源小鼠胚胎干细胞的分离与培养

从小鼠早期胚胎和原始生殖细胞中分离和培养胚胎干细胞(ES细胞).方法:取小鼠3.5天胚龄的囊胚,培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,3 ～4天后分离出内细胞团再培养;取13.5天胚龄胚胎的生殖嵴组织,分离出原始生殖细胞,在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养;观察两种来源的细胞集落生长行为,并用AK P染色鉴定细胞集落.结果:两种来源的细胞集落均具有ES细胞鸟巢状典型特征,AKP染色阳性.结论:两种来源的小鼠胚胎干细胞均可分离和培养.     

大鼠胚胎视杯干细胞的分布研究

目的　探索视杯干细胞在大鼠胚胎视杯内的分布及分化特点。方法　对胚龄11～15d的大鼠胚胎视杯组 织做连续水平位冰冻切片,特异的抗CHX10及视网膜细胞标志蛋白免疫组化染色。结果　12.5d龄胚胎的CHX10阳性细 胞主要集中视杯的内外层,多呈复层上皮样排列,在视杯边缘层呈簇状分布;13.5d龄胚胎中,视杯外层细胞内出现色素, 内层玻璃体侧细胞出现Thy1.1阳性细胞,14.5d龄,内层Thy1.1阳性细胞明显增加。结论　视杯干细胞分布在胚胎视杯 内外层和边缘层,12.5d龄胚胎的视杯中干细胞丰富,未见分化细胞出现。     

发育期小鼠肾脏的细胞凋亡

目的研究小鼠肾脏在发育过程中细胞凋亡的变化规律。方法选择不同胚龄和出生后小鼠肾脏做常规光镜标本,进行原位末端标记法（TUNEL）染色后通过光镜、荧光显微镜进行观察。结果胚龄12d小鼠肾脏输尿管芽中可见细胞凋亡,皮质中的肾小体凋亡高峰出现在胚龄18d,而肾小管、髓放线以及髓质的凋亡高峰均出现在生后7d。结论凋亡现象在后肾开始形成时就存在,与输尿管芽的改建有关;生肾区的细胞凋亡主要与肾小体的完善有关;髓质中的细胞凋亡则与肾小管和集合管的改建、完善有关。     

小鼠胚胎腭突间充质细胞的分离与体外培养方法研究

目的改进小鼠胚胎腭突取材方法,原代培养C57BL／6J小鼠胚胎腭突间充质细胞并加以纯化。方法通过改良方法在显微镜下切取胚胎腭突,然后应用Dispase酶消化离体腭突,纯化腭突胚胎间充质细胞,免疫荧光染色法鉴定腭突间充质细胞生物学特性。结果改良的取材方法使小鼠胚胎腭突取材更精确,操作更简单;纯化后的原代间充质细胞几乎不含上皮细胞;免疫荧光显示细胞HNK-1、S-100、波形蛋白标记阳性,角蛋白标记阴性。结论建立了一种小鼠胚胎腭突精确取材及纯化腭突外胚间充质细胞的方法,为下一步研究工作打下基础。     

层粘连蛋白及生长抑素在高温致神经管畸形发生中的作用

目的：探讨高温致畸中细胞凋亡的发生与层粘连蛋白（LN）及生长抑素（SS）的相关性，研究高温致畸的机理。方法：在高温致神经管畸形的动物模型上,用原位末端标记方法对畸形发生过程中细胞凋亡的时空分布进行定量分析,并用免疫组织化学方法，对各期鼠胚神经上皮和周围间充质的LN和SS表达进行定性、定位和相对定量分析。结果：LN主要位于神经上皮的基底膜,与神经管形成过程中的细胞凋亡呈负相关关系；SS位于神经上皮和周围间充质细胞的胞质内，其含量与神经管形成过程中的细胞凋亡呈明显正相关关系。高温后8～24 h胚胎神经上皮基膜LN含量明显低于对照组。高温后各期胚胎神经上皮和周围间充质细胞SS的含量均不同程度地高于对照组。结论：高温可促进胚胎SS的表达、短暂抑制LN的合成,从而诱导神经上皮和周围间充质细胞凋亡的发生，引起神经管畸形。     

大鼠胚胎心脏的发育过程及基因HCY-2在大鼠胚胎心脏内的表达

目的 研究大鼠胚胎心脏的发育过程和同型半胱氨酸诱导基因(HCY-2)在大鼠胚胎心脏上的表达，为进一步探讨该基因与心血管疾病之间的关系奠定形态学基础。方法 分别于大鼠妊娠11～19d取胚胎，用组织学和免疫组织化学方法，观察大鼠胚胎心脏的发育过程和Hcy-2基因的表达并进行图像分析。结果 大鼠胚胎心脏11d出现第一房间隔，13d出现第二房间隔，14d心房不完全分隔完成；12d出现室间隔肌部，16d心室巳分隔完成。Hcy-2在大鼠胚胎心脏不同发育时期表达不同，11、12d表达强，13d表达减弱，14、15、16d表达又逐渐增强，17、18、19d表达强。结论 大鼠胚胎心脏内部分隔晚于小鼠；基因Hcy-2与心脏发育密切相关。     

BMP4mRNA在大鼠牙胚发育中的表达

目的 研究BMP4mRNA在胚胎SD大鼠牙胚中的表达,探讨BMP4mRNA在牙胚发育中的调控作用和意义.方法 建立和制备sD大鼠胚胎时期13～19 d等多时间点的牙胚发育模型,用HE染色对牙胚发育的时空变化进行组织学观察以确定牙胚发育的时期,再用原位分子杂交检测BMP4 mRNA在牙胚发育中的表达.结果 BMP4 mRNA阳性细胞在SD大鼠牙胚发育的不同时期均有表达,而且规律性地出现在牙上皮和牙乳头的外胚间充质细胞中.结论 BMP4在牙胚发育中的表达特点表明,BMP4可能参与诱导外胚间充质细胞聚集,诱导细胞增殖、分化,诱导成牙本质细胞分泌基质.     

小鼠不同发育阶段肾小体细胞凋亡的实验研究

目的　研究小鼠不同发育阶段肾小体细胞凋亡的规律并探讨其作用。方法　选择不同胚龄和出生后小鼠肾脏做常规光镜标本 ,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记法进行末端标记。结果　TUNEL阳性细胞主要在Ⅲ、Ⅳ期肾小体内表达 ,而Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ期肾小体TUNEL阳性细胞少见。结论　细胞凋亡在小鼠不同发育阶段肾小体内均有不同程度的表达。细胞凋亡在肾小体发育、形成中有着重要的作用。     

鸡胚心肌内移植入人干细胞的动物模型的建立

目的　建立人干细胞移植到鸡胚心肌中的动物模型。方法　通过显微注射的方法 ,将Hoechsst 332 5 8标记的人胚胎生殖嵴细胞 (humanprimordialgermcells ,hPGC)注射到孵化 3～ 4d的鸡胚心脏中 ,先运用人特异性的DNA探针对活鸡胚心脏切片进行原位杂交 ,以检测心肌中移植细胞的存在 ,再运用人心肌特异性抗体肌钙蛋白T(cTnT)对相邻的心肌切片进行免疫组织化学染色 ,以观察有无人心肌细胞分化 ,并统计移植成功率。结果　原位杂交显示 ,在术后 10d鸡胚的心肌中观察到有人的细胞 ,呈心肌纤维样并与鸡胚心肌细胞发生嵌合。免疫组织化学观察到鸡胚心肌中有人心肌特异性的标记物cTnT表达。移植成功率为 15 .3%± 2 .4 %。结论　在鸡胚的心肌内建立一个人干细胞移植的模型是可行的。     

GATA-4在心肌损伤修复中的作用机制研究进展

GATA-4是调控心脏基因表达的重要转录因子,参与了心脏正常发育、功能基因表达和心肌肥大的病理过程。GATA-4在心脏发育的早期起重要作用,抑制胚胎干细胞中GATA-4的表达可阻断胚胎干细胞向心肌细胞分化,增强GATA-4的表达则增加胚胎干细胞向心肌细胞分化。并且GATA-4还具有抗细胞凋亡的作用,GATA-4在心肌肥大期间成体心肌细胞的凋亡过程中具有重要的作用。通过增加促存活基因的表达,可改善细胞的存活。其在心肌损伤修复、缺血性心脏病治疗等方面成为目前研究的热点。     

小鼠心脏神经嵴细胞的体外培养及其生物学特性

目的体外培养和鉴定心脏神经嵴细胞,探讨其生物学特性。方法取8·5d小鼠胚胎枕中部至第3体节神经管,组织块法无血清条件培养获心脏神经嵴细胞,采用转录激活因子2α(AP-2α)作为其生物学标记物,观察其迁移、分化等生物学特性。结果从胎鼠神经管中分离培养的细胞AP-2α表达阳性,具有迁移特性,传代后以含血清培养基培养后能自然分化成神经元和神经胶质细胞。结论体外培养可成功获得心脏神经嵴细胞,且具有迁移特性和多向潜能分化能力。     

以间充质干细胞为饲养层分离培养昆明小鼠胚胎干细胞

目的:探讨以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的方法.方法:以鼠间充质干细胞作为饲养层,收集受孕3.5～4 d昆明小鼠的囊胚和桑椹胚进行培养,筛选纯化细胞集落,使其稳定传代后,采用光镜,碱性磷酸酶染色及Oct-4染色对其形态学和生物学性状进行初步鉴定.结果:以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养的昆明小鼠ES有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES细胞碱性磷酸酶进行检测,末分化的Es细胞显微镜下为黄褐色,分化的不着色;Oct-4染色阳性.结论:以间充质下细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞可行,得到的胚胎干细胞能保持特殊的形态和未分化状态.