人VEGF165基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的 探讨人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因转染兔骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)及对EPCs增殖的影响.方法 体外分离、培养、扩增并鉴定EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白标记的VEGF165质粒、空白质粒,同时经ELISA法检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,并采用CCK-8法检测对其增殖的影响.结果 FITC标记荆豆凝集素Ⅰ和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白荧光双染证实正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实VEGF受体2 FLk-1和Ⅷ因子的表达;VEGF165质粒转染组EPCs上清液中表达VEGF165,VEGF165转染EPCs的转染率约22.5%;hVEGF165基因转染促进EPCs增殖.结论 hVEGF165基因可成功转染EPCs,且可促进EPCs的增殖,为基因治疗血管性疾病提供了动物实验基础.     

人VEGF 165基因转染大鼠内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组。ELISA检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响。结果FITC-UEA-Ⅰ和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且可促进EPCs的增殖,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

人VEGF166基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染兔骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、扩增并鉴定EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白标记的VEGF166质粒、空白质粒,同时经ELISA法检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,并采用CCK-8法检测对其增殖的影响。结果FITC标记剂豆凝集素I和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白荧光双染证实正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实VEGF受体2FLk-1和VIII因子的表达;VEGF165质粒转染组EPCs上清液中表达VEGF166,VEGF165转染EPCs的转染率约22．5％;hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,且可促进EPCs的增殖,为基因治疗血管性疾病提供了动物实验基础。     

VEGF165转染内皮祖细胞移植对大鼠肾脏缺血再灌注的保护作用

目的：评估VEGF165基因转染的内源性内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）移植治疗肾脏缺血再灌注损伤（ischemia?reperfusion injury,IRI）的作用,进一步阐明EPCs对肾脏IRI产生保护作用的旁分泌机制。方法：40只成年雄性SD大鼠被随机分成4组,其中包括假手术组、缺血再灌注组、EPC移植组、携带VEGF165基因转染组。利用重组腺病毒载体Ad?VEGF165感染EPCs,并进行转染效率鉴定。并进一步移植治疗大鼠肾脏IRI,术后24 h和72 h分别评估血清肌酐及尿素氮水平;组织病理学检查评估各组大鼠术后肾损伤程度;免疫组化染色评估CD31表达情况;Western blot检测大鼠肾脏IRI中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、血管生成素?1（Ang?1）及血管生成素?2（Ang?2）表达情况。结果：研究发现利用重组腺病毒载体Ad?VEGF165转染的EPCs移植治疗后,大鼠肾脏血清肌酐、尿素氮水平和肾脏组织病理学明显改善,术后72 h检测大鼠患肾,其CD31、VEGF、Ang?1以及Ang?2表达水平均明显提升。结论：VEGF165基因转染的EPCs移植治疗可以有效治疗大鼠肾脏IRI,其作用机制可能与EPCs归巢后旁分泌过量VEGF并进一步促进Ang?1、Ang?2等血管新生因子表达,从而促使肾脏血管新生有关。     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对其影响。方法体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓EPCs,ELISA检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测对其增殖的影响。结果FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖,注射转基因EPCs的大鼠皮下局部血管增加。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,并且具有血管内皮增殖刺激活性,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

VEGF165基因转染的内皮祖细胞移植对大鼠肾脏缺血再灌注后的保护作用

评估VEGF165基因转染的内源性内皮祖细胞(EPCs)移植治疗肾脏缺血再灌注损伤(IRI)的作用,进一步完善EPCs对肾脏IRI产生保护作用的旁分泌机制。利用重组腺病毒载体Ad-VEGF165感染EPCs,并进行转染效率鉴定。并进一步移植治疗大鼠肾脏IRI,术后24h和72h分别评估血清肌酐及尿素氮水平;组织病理学检查评估各组大鼠术后肾损伤程度;Western blot检测大鼠肾脏IRI中血管内皮生长因子 (VEGF)、血管生成素-1 (Ang-1)及血管生成素-2 (Ang-2) 表达情况。结果发现利用重组腺病毒载体Ad-VEGF165转染的EPCs移植治疗后,大鼠肾脏功能明显改善,术后72h检测大鼠患肾,其内VEGF、Ang-1以及Ang-2表达水平均明显提升。因此,VEGF165基因转染的EPCs移植治疗可以有效的治疗大鼠肾脏IRI,其作用机制可能与EPCs归巢后旁分泌过量VEGF并进一步促进Ang-1、Ang-2等血管新生因子表达,从而促使肾脏血管新生有关。     

脂质体介导质粒pcDNA3.1/ KDRn3基因在转染小鼠视网膜组织中的表达及定位

目的：将真核表达质粒pcDNA3.1/ KDRn3以脂质体介导转染C57BL/6J小鼠视网膜组织,观察其表达及定位。方法：首先对真核表达质粒pcDNA3.1/KDRn3进行扩增和酶切鉴定,然后将20只健康C57BL/6J小鼠随机分成对照组及玻璃体腔注射后2、5、7和14 d组,每组4只鼠8眼。注射组每眼玻璃体腔注射脂质体pcDNA3.1/ KDRn3复合物1 μL,分别于注射后2、5、7及14 d摘除眼球,制成石蜡切片,用KDRn3蛋白免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察KDRn3蛋白表达及定位。结果：Xho Ⅰ和BamHⅠ进行双酶切,切下900 bp大小片段,与目的片段大小一致,表明该质粒确实为KDRn3。注射后2 d在视网膜神经节细胞层细胞胞浆内可见红色荧光信号,注射后5和7 d组视网膜神经节细胞层、内核层部分细胞胞浆内可见红色荧光信号;注射后14 d视网膜神经节细胞层、部分内核层细胞胞浆内可见红色荧光信号,但发出红色荧光信号的细胞数明显减少。　结论：阳离子脂质体可有效将pcDNA3.1/ KDRn3基因转染小鼠视网膜组织,并得到持续表达。     

超声辅助VEGF165转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法：采用超声辅助电穿法，将VEGF165基因的质粒PEGFP—Cl转染至骨髓间充质干细胞，转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果：超声辅助转染5h后可见细胞内有GFP表达，10h后可达高峰。结论：VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞内有GFP表达，提示细胞转染成功，骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

血管内皮生长因子基因修饰内皮祖细胞对内膜损伤血管修复的影响

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)及对EPCs增殖的影响,在体研究VEGF基因修饰EPCs对内膜损伤血管再内皮化的影响.方法 体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组.ELISA法检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响.基因修饰EPCs移植到内膜损伤血管模型中,观察基因修饰对EPCs修复内膜损伤的效应.结果 FITC-UEA-Ⅰ和DiⅠ-acLDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs迁移、黏附和增殖.基因修饰EPCs促进损伤内膜修复.结论 EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且促进EPCs的迁移、黏附和增殖,增强EPCs对损伤内膜修复的能力.     

血管内皮生长因子对大鼠骨髓内皮祖细胞生物学特性的影响

目的 观察内皮祖细胞(EPC)在不同浓度血管内皮生长因子(VEGF)作用下的生物学特性,探讨VEGF对EPC生物学特性的影响.方法 采用密度梯度离心法获取鼠骨髓单个核细胞,培养7 d后收集贴壁细胞鉴定EPC,用含不同浓度VEGF(0、10、50 ng/ml)的培养基继续培养.采用MTT比色法、Transwell小室实验观察EPC的增殖和迁移能力,应用纤维蛋白凝胶观察EPC体外血管形成能力,流式细胞术检测EPC的分化能力.结果 培养7 d的细胞CD133和CD34阳性率分别为69.44%和81.05%.MTT实验显示,10 ng/ml组细胞的吸光值明显大于0 ng/ml组和50 ng/ml组,0 ng/ml组的吸光值明显大于50 ng/ml组(P＜0.05);迁移实验、体外血管形成实验及诱导分化实验显示,50 ng/ml组和10 ng/ml组较0 ng/ml组更能促进EPC的迁移、体外血管形成及诱导分化,且50 ng/ml组强于10 ng/ml组(P＜0.05).结论 VEGF能够提高EPC迁移能力、体外血管形成能力及促进诱导分化,且随着VEGF浓度的升高而增强.VEGF能够提高EPC增殖能力,但随着浓度的升高而减弱.     

Effect of pcDNA3.1- vascular endothelial growth factor 165 recombined vector on vascular buds in rabbit vertebral cartilage endplate

Background  This study aimed to investigate the effect of pcDNA3.1-vascular endothelial growth factor (VEGF)165 vector on vertebral cartilage endplate vascular buds and intervertebral discs.

Methods  Rabbits were randomly assigned to the control and experimental groups with 10 in each. In the experimental group, we anesthetized the rabbits and exposed the front vertebral body. Using the mark of the longitudinal ossature of the front vertebral body of the lumbar vertebrae, we advanced a needle at the central point of the front fourth and fifth lumbar intervertebral discs and injected 20 µl pcDNA3.1-VEGF165. Similarly, in the control group, we injected 20 µl pcDNA3.1. At 4 and 8 weeks post-injection, we examined the changes of the vertebral cartilage endplate using X-ray radiograph, histology, and scanning electron microscopy.

Results  The vertebral cartilage endplate calcification and degeneration in the experimental group were less than those in the control group at 8 weeks post-operation. The average number and diameter of vascular buds obviously increased in the experimental group at 4 and 8 weeks post-operation. The number of vascular buds and the diameter in the region of the inner annulus increased when compared to those in the area near the nucleus pulposus.

Conclusions  The pcDNA3.1-VEGF165 plasmid can increase the average number and diameter of vascular buds and decelerate intervertebral disc degeneration.

     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的 了解大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)线粒体DNA的突变,克隆突变的大肠癌线粒体DNA(mtDNA)基因,构建pcDNA3.I(+)-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞,以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法 提取大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)mtDNA,扩增D-LOOP区,产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3.1(+),并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果 检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD-LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD-LOOP区至表达质粒pcDNA3.1(+),并导入NIH3T3细胞中。结论 线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域,在大肠癌细胞株中突变率较高。     

VEGF165基因转染EPCs移植对大鼠阿霉素肾病组织学的影响

目的 构建含血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒(Ad-VEGF165),转染血管内皮祖细胞(EPCs)后,观察其对阿霉素肾病大鼠肾脏组织学的影响.方法 用细菌内同源重组法构建含VEGF165基因的重组腺病毒Ad-VEGF165,通过PCR和Western blot鉴定所构建的腺病毒.贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs,Ad-VEGF165体外转染EPCs,检测转染后目的基因的蛋白表达.大鼠阿霉素肾病模型形成过程中,尾静脉注射转染Ad-VEGF165的EPCs,在第16周时观察肾脏组织学变化.结果 PCR和Western blot证实构建的重组腺病毒含有目的基因,滴度为1.4×1010PFU/ml;培养第6天的EPCs用于Ad-VEGF165转染,转染后24 h,培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加.转染了VEGF165基因的EPCs移植后第12周(切肾术后16周),转染组的肾小球硬化和肾小管间质纤维化的程度明显较肾病组轻.结论 转染了VEGF165基因的EPCs可以减轻阿霉素肾病的肾小球和肾小管的损伤程度,为VEGF在慢性肾脏病治疗提供了实验基础.     

LHR真核表达载体构建及表达

目的构建黄体生成素受体（LHR）真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株。方法KpnI／Hpa工双酶切LHR-cDNA质粒载体获得目的基因,定向克隆构建pcDNA3．1（4-）真核表达载体,酶切图谱和序列分析鉴定;重组质粒载体经脂质体转染MCF-7乳腺癌细胞,G418筛选,RT-PCR、细胞内cAMP测定,筛选鉴定高表达LHRMCF-7细胞。结果重组质粒pcDNA3．1（4-）-LHR酶切图谱分析结果、序列分析证明pcDNA3．1（4-）-LHR载体中LHR序列与GenBank的LHR基因序列完全相符。RT-PCR检测MCF-7细胞LHRmRNA,MCF-7细胞内cAMP浓度测定,证实MCF-7细胞高表达LHR。结论构建并转染pcDNA3．1（4-）-LHR真核表达载体,在MCF-7细胞中稳定表达,为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的了解大肠癌细胞株（SW480，LoVo，HT29）线粒体DNA的突变，克隆突变的大肠癌线粒体DNA（mtDNA）基因，构建pcDNA3．1（＋）-mtDNA真核表达重组体，并导入NIH3T3细胞，以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法提取大肠癌细胞株（SW480，LoVo，HT29）mtDNA，扩增D-LOOP区，产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3．1（＋），并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD—LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD—LOOP区至表达质粒pcDNA3．1（＋），并导入NIH3T3细胞中。结论线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域，在大肠癌细胞株中突变率较高。     

结核分枝杆菌新抗原Mtb8.4基因的克隆及真核表达载体的构建

目的 克隆结核杆菌新抗原Mtb8.4基因，并构建真核表达载体pcDNA3.1( )—mtb8.4。方法 提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增，获得mtb8．4目的基因后，与pcDNA3．1( )载体进行连接重组。结果 pcDNA3．1( )—mdt8.4真核表达栽体构建完成后，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定，证实其构建成功。结论 pcDNA3.1( )—mtb8．4真核表达质粒的成功构建，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1( )—mtb8.4DNA疫苗奠定了基础。     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.