gp96多肽复合物对树突状细胞成熟的影响

目的研究热休克蛋白gp96多肽复合物与小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）成熟的关系。方法采用GM-CSF、IL-4刺激培养小鼠骨髓细胞，增殖产生大量DC；从小鼠肝癌细胞株H22细胞中提取gp96肽复合物，体外修饰DC；通过流式细胞仪检测上清液IL-12、TNF-α细胞因子含量和DC表面主要组织相容性Ⅱ类抗原、CD40、CD80等分子表达；DC与小鼠脾淋巴细胞共同培育后，检测CD4、CD8和IFN-γ、IL-10双阳性细胞比例；以^51Cr释放法测定细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性。结果gp96多肽复合物修饰的DC大量分泌IL-12、TNF-α等细胞因子，高表达MHCⅡ类抗原、CD40、CD80等分子；并且能激活小鼠脾淋巴细胞，CD8^＋-IFN-γ^＋和CD4^＋-IFN-γ^＋双阳性细胞比例显著升高；能够特异性的杀伤H22癌细胞。结论gp96多肽复合物能够诱导DC成熟，体外产生特异性CTL反应。     

热休克蛋白-多肽复合物/树突状细胞疫苗的研究

目的　探讨从肺癌组织中提取的热休克蛋白GP96 多肽复合物 (GP96)负载树突状细胞 (DC)疫苗在小鼠体内的抗肿瘤作用。方法　自小鼠肺腺癌LA795肿瘤组织中提取GP96,自615小鼠外周血中提取单个核细胞体外培养DC ,共孵育制备疫苗 ,分别以GP96(5 μg/只 )、DC(5×10 5个 /只 )和GP96/DC(DC5× 10 5个 /只 ,培养时加入 5 μgGP96)免疫小鼠后接种肿瘤 ,与未免疫组比较成瘤率、肿瘤体积及生存时间。同时以联合免疫缺陷小鼠 (SCID )进行类似实验 ,肿瘤组织为人肺腺癌PAa ,DC来源于人外周血 ,分组剂量同上。结果　 615组小鼠成瘤率分别为 10 0 %、10 0 %、10 0 %和 75 % ,肿瘤体积为 (6.46± 1.47)cm3 ,(0 .70± 0 .62 )cm3 ,(0 .64± 0 .49)cm3 和(0 .3 2± 0 .3 0 )cm3 ,生存时间为 5 2、5 1.5、5 8.5和 77d ,SCID组小鼠成瘤率分别为 10 0 %、10 0 %、10 0 %和 87.5 % ,肿瘤体积为 (0 .75± 0 .3 0 )cm3 ,(0 .17± 0 .0 6)cm3 ,(0 .15± 0 .0 8)cm3 和 (0 .0 8±0 .0 3 )cm3 ,生存时间为 3 7、5 2、5 2 .5和 77d。结论　GP96/DC疫苗有更明显的抑制肿瘤生长的作用。     

BALB/C小鼠4T1乳腺癌细胞混合肽诱导特异性免疫应答的研究

本研究采用细胞冻融法获取BALB/C小鼠4T1乳腺癌细胞抗原肽,在体外构建热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）抗原肽复合物（HSP70-peptids complex,HSP70-PC）并观察该复合物对BABL/C小鼠脾细胞的激活与增殖作用及增殖后脾细胞对4T1细胞的杀伤作用;并进行体内实验观察HSP70-PC对BALB/C小鼠的免疫保护作用.目的在于为乳腺癌的免疫治疗探索一条新途径.     

神经胶质瘤细胞热休克蛋白抗原肽复合物的研究

目的 探讨从神经胶质瘤细胞中提取热休克蛋白抗原肽复合物(IIAC)的方法。方法 采用免疫亲和层析技术提取神经胶质瘤细胞中热休克蛋白抗原肽复合物，采用Westenblot方法对提取物进行鉴定。结果 采用免疫亲和层析方法成功提取了神经胶质瘤细胞中热休克蛋白抗原肽复合物，并经过Westenblot方法鉴定。结论 采用亲和层析方法可有效的提取神经胶质瘤细胞中的热休克蛋白抗原肽复合物。     

人肾癌组织中热休克蛋白gp96-肽复合物提取、纯化及体外的免疫效应

目的建立从人肾癌组织中提取、纯化热休克蛋白(HSP)gp96肽复合物的方法,并检测其体外免疫效应。方法采取三步蛋白纯化法从人肾癌患者肿瘤组织中提取、纯化HSPgp96肽复合物,SDSPAGE、Westernblot鉴定HSPgp96肽复合物。应用酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测HSPgp96肽复合物、单纯多肽产生γ-干扰素效应T细胞频数的体外免疫活性。结果应用该方法提取的蛋白质经SDSPAGE和Westernblot特异性鉴定,证实是HSPgp96肽复合物;蛋白得率为每g湿重肾癌组织可纯化HSPgp96肽复合物40～60μg。γ-干扰素ELISPOT检测,HSPgp96肽复合物组产生γ-干扰素效应T细胞频数最高(287.50±22.34),以后依次为单纯多肽组(135.25±12.80)、阳性对照组组(102.25±14.76)、阴性对照组(35.50±11.10),各组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);HSPgp96肽复合物组与单纯多肽组、阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);单纯多肽组与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论三步蛋白纯化法不仅操作简便、重复性高,而且提取的HSPgp96肽复合物具有高获率、高纯度、高特异性及高免疫效应等优点。     

胎儿来源的树突状细胞体外诱导抗前列腺癌效应的实验研究

目的研究胎儿来源树突状细胞(DC)体外诱导抗前列腺癌的特异性细胞免疫效果。方法从胎儿骨髓、肝脏获得单个核细胞,经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)和重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)诱导产生DC。50%~70%硫酸铵饱和沉淀法获取前列腺癌细胞DU145含热休克蛋白(HSP)成分的细胞溶解物,以该抗原负载DC,激活胎脾细胞产生肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。MTT法检测CTL对DU145、PC3和EJ细胞的杀伤效应。结果胎儿骨髓、肝脏可诱导出功能成熟的DC,高表达CD1 a、CD86、HLA-DR和CD83。负载DU145抗原的DC可诱导产生CD8+CTL。CD8+T细胞表型由转化前的(14.09±2.46)%变为转化后的(62.76±2.64)%。对DU145细胞有明显细胞毒作用,显著高于对EJ细胞杀伤效应(P<0.01)。结论含HSP成分的肿瘤细胞溶解物负载胎儿来源DC,体外可诱导出特异性抗肿瘤免疫应答。     

肝癌病人树突状细胞诱导高效而特异的抗肝癌免疫

目的 以肝癌病人树突状细胞（ＤＣ）体外诱导抗肝癌免疫。方法 自肝癌病人外周血中分离出单个核细胞（ＰＢＭＣ０;以人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２肿瘤细胞的肿瘤相关抗原（ＴＡＡ）激活ＤＣ;以粒／巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及白介素４（ＩＬ－４）联合刺激ＰＢＭＣ中ＤＣ;ＤＣ诱导自体Ｔ淋巴细胞增殖,分化为细胞毒性Ｔ细胞（ＣＴＬ）;检测ＣＴＬ及其上清液对ＨｅｐＧ２,ＢＥＬ－７４０２,ＬＯＶＯｅｙ ＨＯＳ－８６     

微波消融灭瘤联合瘤内接种树突状细胞诱导特异性抗肝癌免疫

目的 探讨微波消融(MWA)灭瘤联合瘤内接种树突状细胞(DCs)诱导特异性抗肝癌免疫的效能.方法 采用GM-CSF联合IL-4体外培养C57BL/6小鼠骨髓来源的DCs,于第6天收集使用.建立C57BL/6小鼠皮下Hepa1-6肝癌模型,随机分为对照组、瘤内接种DCs组(DC组)、肿瘤微波消融组(MWA组)及肿瘤微波消融+瘤内接种DCs组(MWA+DC组).免疫组织化学法检测肿瘤组织内CD4+和CD8+T细胞的浸润,MTT法检测小鼠脾脏细胞对Hepa1-6的特异性杀伤活性,观测各组小鼠肿瘤生长情况.结果 免疫组织化学法检测显示MWA+DC组肿瘤组织内有大量的CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润,显著高于其它组(P<0.05).MwA+DC组脾细胞对Hepa1-6细胞有特异性杀伤效能,在E/T=40和100时,MWA+DC组脾细胞对Hepa1-6细胞的特异性杀伤力显著高于对照组、DC组及MWA组(P<0.05).MWA+DC组小鼠肿瘤完全消退率显著高于其它各组(P<0.05).结论 MWA联合瘤内接种DCs可有效诱导机体产生特异性抗肝癌免疫,是预防MwA治疗后肝瘤复发的一种有效方法 .     

树突状细胞激活的肿瘤浸润性淋巴细胞体外特异性抗小鼠肝癌研究

目的树突状细胞(DC)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(APC),可以向包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)在内的T淋巴细胞提呈抗原,并诱发细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。本文旨在探讨H22细胞和B16细胞全细胞性抗原致敏的树突状细胞激活的肿瘤浸润性淋巴细胞体外抗小鼠肝癌活性。方法从小鼠四肢长骨骨髓中获取DC,应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和肿瘤全细胞性抗原致敏DC,然后用DC激活TIL,观察TIL在体外对H22细胞、Hepal-6细胞和B16细胞的杀伤活性。结果经H22细胞全细胞性抗原致敏的DC激活的TIL具有很高的对H22细胞杀伤活性,杀伤率为(71·31±3·11)%,明显高于其对Hepal-6和B16细胞的杀伤活性[杀伤率分别为(50·11±3·03)%,(30·31±2·89)%];也明显高于未经H22细胞全细胞性抗原致敏的DC激活的TIL、DC激活的脾淋巴细胞和未经DC激活的脾淋巴细胞对H22细胞杀伤活性[杀伤率分别为(49·80±3·21)%,(48·76±3·60)%和(19·23±2·71)%]和对Hepal-6细胞杀伤活性[杀伤率分别为(39·4±3·21)%,(38·62±2·87)%和(18·73±2·40)%]以及对B16细胞杀伤活性[杀伤率分别为(26·38±2·51)%,(25·82±2·70)%和(18·34±3·01)%],同时经B16细胞全细胞性抗原致敏的DC激活的TIL(来源于H22瘤体)也可诱导相对较低的对B16细胞的特异性细胞杀伤活性。结论来源于H22瘤体的TIL经H22细胞全细胞性抗原致敏的DC激活后可产生很强的针对H22细胞的特异性杀伤活性,明显高于其他各组,说明DC能诱导TIL产生高效而特异的体外抗小鼠肝癌免疫。     

B7反义肽预处理的受体树突状细胞诱导供体特异性的免疫低反应

目的 探讨负载供体抗原的受体耐受性树突状细胞（DC）在器官移植慢性排异中的作用，为抗移植慢性排异提供新的途径。方法 利用B7反义肽与负载供体抗原的成熟DC体外孵育，封闭表面B7分子，模拟不成熟DC，建立体外供体间接识别途径反应体系，观察其体外抑制受体T细胞增殖作用，收集两者反应后的受体T细胞与负载供体抗原或无关供体抗原的DC作混合淋巴细胞反应；或者通过以B7反义肽封闭的负载供体抗原的受体DC对受体小鼠预处理，3d后取脾脏分离T细胞，与负载供体抗原或无关供体抗原的DC作混合淋巴细胞反应。结果 B7反义肽封闭的DC具有抑制T细胞增殖的作用（P〈0．01），同时反应体系中抑制作用在B7反义肽终浓度处于10mg／L与1mg／L之间出现突变。与B7反义肽封闭的负载供体抗原的DC反应后的T细胞，产生对间接途径呈递的供体抗原的低反应性。结论 B7反义肽封闭的DC可以抑制T细胞增殖，以此诱导针对间接途径呈递的供体抗原的特异性低反应性，从而抑制移植物慢性排异反应。     

反义IDO-AFP基因融合修饰树突状细胞抗肝癌免疫作用

目的探讨反义IDO-AFP基因融合修饰树突状细胞(DC)后,DC通过调控色氨酸代谢达到高效、特异性抗肝癌作用。方法采用细胞培养方法,从小鼠骨髓中获得DC,用反义IDO核酸和AFP基因融合的载体,转染入DC内,检测转染入融合基因DC的对T细胞增殖的影响和体外对肝细胞癌的免疫应答的改变。以~(51)Cr释放法测定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。制作小鼠肝癌模型,分别予以反义IDO-AFP修饰的DC、单纯DC、空白对照组进行治疗,检测血清中自细胞介素(IL)-10、干扰素(IFN)-7水平；CD4、CD8和IFN-7和IL-10双阳性细胞比例,观察其抑制肿瘤的效果。结果反义IDO-AFP修饰的DC可激活小鼠脾淋巴细胞；能对肝癌细胞株H22细胞进行特异性杀伤,杀伤率为89．3%,显著高于单纯DC、生理盐水(空白对照组)组的34．7%和8．9% (P均＜0．01)而对艾氏腹水瘤细胞无效；反义IDO-AFP修饰DC组色氨酸含量为(17．8±1．2)μm,而单纯DC组和空白对照组的色氨酸为(6．2±0．6),um和(5．2±1．2)μm,表明反义IDO-AFP修饰DC可明显增加培养液中的色氨酸。使Thl细胞比例上升,抑制体内肿瘤的生长。结论反义IDO-AFP基因融合修饰树突状细胞后,DC通过调控色氨酸代谢达到高效、特异性抗肝癌的目的,可成为一种有效的瘤苗。     

胆管癌抗原肽对转染全长野生型p53的树突状细胞免疫功能的影响

目的　研究胆管癌抗原肽对转染全长野生型 p5 3的树突状细胞 (wtp5 3DC)免疫功能的影响。方法　将全长野生型 p5 3导入脂质体内并转染小鼠骨髓来源的DC ,然后用胆管癌抗原肽修饰wtp5 3DC ,检测这种树突状细胞的抗原提呈功能。结果　抗原肽修饰的wtp5 3DC和单纯DC这 4种上清 3种细胞因子含量明显增加为 :( 5 45 .2± 12 .1)ng/L ,( 5 11.1± 13 .3 )ng/L ,( 5 3 7.1±11.1)ng/L ;wtp5 3DC刺激小鼠脾脏T细胞增殖水平明显高于对照组 (P <0 .0 1) ;该细胞高表达B7 1、B7 2、MCH Ⅰ、MCH Ⅱ (P <0 .0 5 ) ;能够特异性地杀伤胆管癌细胞 ,杀伤率为 81.6%。结论全长野生型 p5 3基因转染与胆管癌抗原肽联合修饰树突状细胞能诱导小鼠细胞毒性T淋巴细胞的特异性。     

树突状细胞疫苗诱导免疫效应细胞对PC3生长的抑制作用

耳的体内外观察多种细胞因子及肿瘤相关抗原（TAA）体外培养的树突状细胞（DC）诱导免疫效应细胞对PC3的抑制。方法用淋巴细胞分离液分离抗凝新鲜全血以获得单核细胞（PBMC），用贴壁法获取DC和去DC的单核细胞（免疫效应细胞），并分别用粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、人白细胞介素（IL）-4、肿瘤坏死因子（TNF）-α、PC3肿瘤相关抗原（PC3TAA）和人白介素2（IL-2）培养正常人DC和免疫效应细胞，5．6d后将DC和免疫效应细胞混合培养1-2d。观察DC，免疫效应细胞生长状况。酶法检测DC诱导免疫效应细胞对PC3的毒性作用。体内观察DC诱导免疫效应细胞和DC培养上清液对裸鼠PC3移植瘤的生长抑制作用。结果体外多种细胞因子和肿瘤相关抗原能有效引起DC增殖。DC疫苗诱导免疫效应细胞对PC3的最大杀伤效率为62．4％。体内实验见：阴性对照组Ⅰ，单纯细胞治疗组Ⅲ及其联合培养上清液治疗组Ⅳ裸鼠均于第12天发生移植瘤；预防治疗组Ⅱ，观察30d时，6例只有2例发生移植瘤；于移植瘤产生后的第45天处死所有裸鼠并称瘤体的重量，各组比较差异有统计学意义（P〈0．05），两两比较。组Ⅰ分别与组Ⅱ、Ⅲ比较差异有统计学意义（P〈0．001），组Ⅰ与组Ⅳ、组Ⅱ与组Ⅲ比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论DC疫苗在抗恶性肿瘤中有重要作用。     

转Survivin基因树突状细胞抗消化道肿瘤的免疫效应研究

目的　研究转染Survivin的树突状细胞 (DC)在体外诱导高效而特异的抗消化道肿瘤免疫效应。方法　用脂质体作为介质 ,将Survivin基因转染入DC ,用Westernblot法检测培养上清Survivin的表达 ,检测这种DC分泌细胞因子白介素 (IL 12 )、肿瘤坏死因子 (TNF) α的功能 ,以及表面分子CD1a、CD83、MHcⅡ、CD80、CD86表达的高低 ,用MTT法诱导人特异的细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs)的能力。结果　培养上清中均可以检测到Survivin表达 ;转基因DC的上清IL 12、TNF α两种细胞因子含量为 (2 65 .2± 3 2 .7)ng/L和(4 3 7.1± 83 .5 )ng/L明显比单纯DC组高(P <0 .0 5 ) ;转基因DC表面高表达CD1a、CD83、MHCⅡ、CD80、CD86;转基因的DC提呈的T细胞对胃癌细胞、结肠癌细胞、胆管癌细胞杀伤率分别为 :65 %、77%、85 % ,而未修饰的单纯DC杀伤作用较低。结论　Survivin基因转染修饰的DC能诱导细胞毒性T淋巴细胞的特异性 ,显著地提高DC的抗原提呈功能 ,体外能诱导高效而特异的抗癌免疫效应。     

Immunoprotection against murine bladder carcinoma by octaarginine‐modified liposomes incorporating cell wall of Mycobacterium bovis bacillus Calmette‐Guérin

OBJECTIVE

To develop a prototype of a non‐live bacterial agent that consists of a cell wall (CW) preparation from heat‐killed bacillus Calmette‐Guérin (BCG‐CW) incorporated into octaarginine‐modified cationized liposomes as a vector (R8‐liposome‐BCG‐CW), and to evaluate its immunoprotective potentiation in mice, as although BCG is an established effective immunotherapy for nonmuscle‐invasive bladder cancer, more active and less toxic treatments are needed.

MATERIALS AND METHODS

The cellular interaction of R8‐liposome‐BCG‐CW co‐cultured with mouse bladder cancer cell line (MBT‐2) was examined by confocal laser scanning microscopy. MBT‐2 cells (7 × 10⁵) were subcutaneously inoculated with 1 mg BCG, 0.1 mg or 1 mg BCG‐CW, 0.1 mg or 1 mg R8‐liposome‐BCG‐CW in female C3H/HeN mice. The MBT‐2 cells pretreated with BCG or R8‐liposome‐BCG‐CW were re‐challenged at 6 weeks. The sizes of the primary and re‐challenged tumours were evaluated at 4 and 10 weeks, respectively.

RESULTS

Confocal laser scanning microscopy showed the enhanced incorporation of R8‐liposome‐BCG‐CW into MBT‐2 cells after 1 h of co‐incubation. 0.1 mg R8‐liposome‐BCG‐CW completely inhibited the growth of MBT‐2 tumours while 0.1 mg BCG‐CW alone did not (P = 0.002). Mice vaccinated with a mixture of MBT‐2 cells and R8‐liposome‐BCG‐CW inhibited the growth of re‐challenged tumour of MBT‐2 cells pretreated with BCG or R8‐liposome‐BCG‐CW but did not inhibit that of MBT‐2 cells with no pretreatment at 10 weeks, with mean (sd ) tumours sizes of 54 (60) mm² (P < 0.001) or 69 (43) mm² (P = 0.003) compared with 309 (125) mm², respectively.

CONCLUSION

The immunotherapeutic potential of BCG‐CW was enhanced by improving cellular association using the R8‐liposomes delivery system. Development of this non‐live bacterial agent may contribute to providing a more active and less toxic tool as a substitute for live BCG as immunotherapy against nonmuscle‐invasive bladder cancer in the future.     

RNA干扰树突细胞主要组织相容性复合物1表达后诱导抑制性T细胞对小肠移植耐受的影响

目的探讨RNA干扰树突细胞（Dc）组织相容性复合物1（MHC-1）表达后获得的CD8＋CD28-抑制性T细胞（Ts）对小肠移植免疫耐受的的影响。方法通过siRNA干扰DC MHC—I表达后,诱导获得CD8^＋CD28^-Ts。建立由Wistar大鼠移植到SD大鼠的小肠移植模型36例,随机分为A组（转染实验组）、B组（未转染组,注射普通T细胞）和C组（移植对照组,注射生理盐水）。术后14d,每组各随机挑选6例,取移植大鼠小肠和血液标本行移植小肠组织病理学检查．并检测移植大鼠血清TGF-β、IFN-γ水平及回肠黏膜Na^＋-K^＋-ATP酶活性,观察移植大鼠的存活时间。结果术后第14天,A组移植大鼠血清中TGF—β和IFN-γ表达水平高于B、C组（P〈0．05）。A组大鼠肠黏膜Na^＋-K^＋-ATP酶活性为（6．3±1．0）kU／g,明显高于B组的（3．6±0．9）kU／g和C组的（2．9±1．3）kU／g（P〈0．05）。A组移植小肠病理Parks评分分级明显低于B组和C组（P〈0．05）。A、B和C组移植后大鼠中位生存时间分别为32．0、17．5和21．0d,A组存活时间明显优于B组和C组（P〈0．05）。结论将RNA干扰DCMHC—I表达所获得的CD8^＋CD28^-Ts过继小肠移植大鼠．可以减轻移植大鼠的损伤程度．抑制免疫排斥反应．     

磁转染MUC1/Y基因入树突状细胞抗膀胱肿瘤的免疫效应研究

目的：研究体外磁转染人MUC1/Y基因至人树突状细胞（DC）的可行性,以及在体外诱导特异忡抗MUC1／Y膀胱癌的免疫效应。方法：以葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）作为载体,在多聚赖氨酸（PLL）的辅助下,通过静电作用结合MUC1／Y基因的真核表达载体pEGFP-C1—MUC1／Y．在铜-硼-锡磁块的固定磁场作用下转染至人DC中,荧光显做镜下以及流式细胞仪观察其转染效率;再将这种转基因DC与自体T细胞共培养,观察其致敏的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对MUC1／Y特异性抗膀胱癌（膀胱肿瘤BIU87细胞系）的杀伤活性,即分别用LDH释放法检测CTL杀伤活性和透射电镜观察CTL诱导靶细胞凋亡情况：ELISA法测定基冈修饰后的DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ了的能力。结果：pEGFP-C1／-MUC1／Y转染效率为15％左右,荧光显微镜下可观察到明显绿色荧光蛋白的表达;与自体T细胞混合培养后能诱导出湿著的MUC1/Y特异性的CTL对BIU87细胞的杀伤实验表明T-DC-MUC1的杀伤活性约为52％,显著高于埘照组T-DC诱导的CTL;住透射电镜下也可以清楚的观察到部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失,染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现;基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平的IFN-γ,与未转染的DC相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）在固定磁场的作用下成功将MUC1/Y基因转入DC,并可有效诱导出特异性的抗MUC1/Y膀胱癌的免疫效应。