联合反义存活素、血管内皮生长因子治疗裸鼠骨肉瘤

目的探讨存活素（Survivin，SVV）、血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ASODN）联合治疗裸鼠骨肉瘤。方法构建荷骨肉瘤裸鼠模型，采用瘤内注射给药方式（5mg,／kg体重），以反义SVV、反义VEGF对瘤鼠进行联合干预治疗1周，并与各单药组和空白对照组进行比较，观测各组裸鼠肿瘤生长情况、评估瘤体病理形态，免疫组织化学法检测移植瘤组织SVV、VEGF蛋白表达，DNA末端原位标记法（TUNEL法）检测肿瘤细胞凋亡水平。结果与对照组比较，各治疗组肿瘤生长均不同程度受抑，以联合组最为显著，瘤重仅为（0．52±0．01）g，抑瘤率IR为（42．80±0．88）％；各治疗组肿瘤细胞中SVV、VEGF蛋白表达有所减低，肿瘤细胞出现凋亡坏死改变，其中联合组细胞凋亡指数AI[（27．90±3．66）％]显著高于对照组[（7．10±2．05）％，Χ^2=46．27，P〈0．01]。结论联合应用SVV与VEGFASODN将对裸鼠荷骨肉瘤发挥更强的抗瘤效应。     

MMP-2反义寡核苷酸抑制人膀胱癌裸鼠异体移植瘤生长的实验研究

目的：探讨基质金属蛋白酶2（MMP2）反义寡核苷酸对人膀胱癌裸鼠异体移植瘤生长的抑制作用。方法：制备膀胱癌裸鼠移植瘤模型18只,随机分为3组：MMP2反义寡核苷酸（ASODN）治疗组、MMP2正义寡核苷酸（SODN）治疗组及对照组,每组6只。待瘤结节直径≥5mm后,分别在肿瘤细胞接种部位周围及中心皮下注射反义寡核苷酸／阳离子脂质体复合物、正义寡核苷酸／阳离子脂质体复合物和生理盐水。每周2次,连续4周,断颈处死裸鼠,计算肿瘤体积,称量瘤重。常规切片,HE染色,观察组织学形态并进行病理学评估。应用免疫组织化学技术（SP法）检测各组移植瘤组织中PCNA蛋白表达。结果：与对照组瘤重（7．49±0．53）g比较,ASODN组瘤重（4．18±0．53）g明屁降低（P〈0．01）;ASODN组、正义寡核苷酸（SODN）组抑瘤率分别为44．19％、8．41％（P〈0．01）;ASODN组、对照组增殖指数（PI值）分别为27．63％、88．39％,抑制率为60．76％（P〈0．01）;ASODN组瘤体病理学特征改善。结论：MMP-2反义寡核苷酸能抑制裸鼠体内移植瘤生长,通过反义寡核苷酸下调MMP-2的表达,降低癌细胞的增殖活性,有效逆转肿瘤的恶性表型。为膀胱癌的基因治疗提供了实验依据。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制肝癌的血管形成

目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ODN）是否可以抑制人肝癌细胞系VEGF的蛋白表达,进而抑制肝癌的血管形成,探讨肝癌基因治疗的新方法。方法 人肝癌细胞系7721能表达VEGF,其培养上清液对牛主动脉内皮细胞（BAEC）的生长有促进作用。采用人工合成反义、正义ODN分别加入7721细胞培养液,比较7721细胞VEGF的表达以及各上清液刺激内皮细胞生长的受抑情况,即可了解ODN通过抑制VEGF的表达抑制肝癌的血管形成情况。结果 VEGF反义ODN明显抑制了人肝癌细胞VEGF的表达（灰度值：反义组122．6,正义组101．3,对照组106．3,P＜0．01）,且抑制率与剂量呈性关系（当剂量为1、2、5、10μmol/L时抑制率分别为：63．2％、82．4％、210．0％、287．5％）。结论 VEGF反义ODN能够抑制肝癌的血管形成,其有望成为抗肝癌的新一代基因治疗手段。     

脂质体介导增殖细胞核抗原反义寡核苷酸抑制人肝癌细胞增殖的实验研究

目的 观察脂质体介导增殖细胞核抗原（PCNA）对肝癌细胞增殖的影响。方法：根据PCNA cDNA序列设计合成与PCNAmRNA AUG起始密码子后的18位碱基序列互补的PCN反义寡核苷酸，脂质体介导转染人肝癌细胞析，通过细胞生长曲线测定，MTT比色法检测PCNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生长抑制率，比较阳离子脂质体介导转染法与直接转染法的区别。结果 PCNA反义寡核苷酸作用后的肝癌细胞、生长明显受到抑制。应用阳离子脂质体介导转染能显著提高PCNA反义寡核苷酸的抑增殖效应。结论 利用阳离子脂质体介导转染PCNA反义寡核苷酸能显著提高对人肝癌细胞增殖的抑制效应。     

Survivin反义核酸治疗人大肠癌裸鼠皮下种植瘤的实验研究

目的探讨Survivin反义寡核苷酸对裸鼠人大肠癌皮下种植瘤体生长的抑制作用及其机制。方法接种人大肠癌细胞制作裸鼠皮下大肠癌种植瘤模型,分别用Survivin反义寡核苷酸、正义核苷酸和生理盐水对皮下瘤体内直接进行注射治疗,检测肿瘤的生长状况、瘤体体积及瘤重变化,计算抑制率。病理切片免疫组化检测瘤体E-CD表达。结果经Survivin硫代反义寡核苷酸治疗组裸鼠皮下移植瘤生长受到抑制,肿瘤重量明显小于对照组,肿瘤体积明显小于对照组和正义组(P<0.05),裸鼠皮下移植瘤E-CD表达增强。结论Survivin反义核酸可以抑制大肠癌裸鼠移植瘤的生长,Survivin反义核酸抑制大肠癌裸鼠移植瘤生长的机理可能与E-CD基因表达变化有关。     

PCNA反义寡核苷酸抑制人肝癌细胞体外增殖的研究

目的 观察增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸对人肝癌细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变，方法 MTT法，集落形成试验观察PCNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生长抑制，免疫组化技术检测PCNA的蛋白表达，流式细胞仪分析细胞周期变化。结果 PCNA反义核酸作用后的肝癌细胞生长明显受到抑制，抑制效应于作用后48h最为明显，并于72h后逐渐减弱，集落形成率明显下降，PCNA蛋白表达明显下降，细胞周期中S期细胞数明显减少。结论 PCNA反义寡核苷酸能显著抑制人肝癌细胞的生长。     

表皮生长因子联合氟尿嘧啶对结直肠癌裸鼠皮下移植瘤的作用

目的观察联合应用表皮生长因子（EGF）和氟尿嘧啶（5-FU）治疗结直肠癌裸鼠皮下移植瘤的疗效,并分析可能的机制。方法建立结直肠癌（Caco-2细胞系）裸鼠移植瘤模型,观察应用EGF和5-Fu治疗后的肿瘤生长曲线并计算抑瘤率．同时观察肿瘤细胞生长情况及EGF对其他器官正常细胞的影响。结果单用5-Fu组裸鼠的抑瘤率为40．97％：EGF和5-Fu联合治疗组（联合治疗组）明显高于前者达57．05％。苏木精-伊红染色见联合治疗组肿瘤细胞形态模糊,细胞数明显减少．其他脏器组织切片未见异常。EGF组和联合治疗组PCNA指数分别达到（51．60±10．97）％和（48．00±11．66）％,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）：联合治疗组处于增殖周期的肿瘤细胞增多。结论联合应用EGF可以提高结直肠癌对5-Fu的敏感性,同时对其他器官无不良反应。其机制可能与EGF诱导静止期细胞增殖有关。     

MDA-7/IL-24和阿霉素联合治疗裸鼠肝癌的研究

目的将重组腺病毒介导的MDA-7／IL-24基因与阿霉素（ADM）联合治疗裸鼠肝癌，探讨基因治疗和化疗相结合治疗肿瘤的新方法。方法构建携带人MDA-7／IL．24的重组腺病毒载体（Ad—MDA-7），单独使用该载体或ADM以及两者联合治疗裸鼠肝癌模型，并进行组织学观察。结果成功构建重组腺病毒并实现体内表达，Ad-MDA-7＋ADM联合治疗组裸鼠平均生存时间为（83．80±4．82）d，与其他3组比较生存期明显延长（P〈0．01）；Ad-MDA-7＋ADM组裸鼠肝癌体积明显小于ADM或Ad—MDA-7组（P〈0．01）。联合治疗组少见肿瘤细胞异型性，部分细胞核染色质边集。结论MDA-7／IL-24联合阿霉素对裸鼠人肝癌转移模型有明显的协同抗肿瘤作用。     

VEGF_(121)反义核酸抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖及血管生成

目的:探讨VEGF121反义核酸对裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖及血管生成的影响,探索通过VEGF反义核酸抑制肿瘤生长.方法:将稳定转染有VEGF反义核酸pcDNA3-ASVEGF121的胰腺癌细胞系Bx-PC-3接种于裸鼠背部皮下.将实验鼠分为实验组、对照组和空白组.定期测定裸鼠移植瘤体积,免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤VEGF、Flk-1表达水平.测定裸鼠移植瘤微血管密度.结果:VEGF反义核酸转染BxPC-3细胞后,裸鼠胰腺癌移植瘤生长明显减缓.移植瘤VEGF表达明显受到抑制,Flk-1表达水平上调.裸鼠胰腺癌移植瘤微血管密度明显降低.结论:人反义核酸VEGF121能显著抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖,并能抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的血管生成.     

反义MDM2联合紫杉醇对胶质瘤细胞U251的作用及其机制

目的探讨MDM2反义寡核苷酸联合紫杉醇对U251人胶质瘤细胞株的作用。方法以Lipofectamine介导的MDM2反义寡核苷酸转染U251人胶质瘤细胞株，免疫组织化学法检测胶质瘤细胞株MDM2蛋白的改变，噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖，流式细胞仪检测凋亡，Western blot检测野型生p53（wild typ p53，wtp53）的表达，构建荷胶质瘤裸鼠模型，采用瘤内注射和腹腔给药方式，以MDM2反义寡核苷酸联合紫杉醇治疗，研究其联合抗肿瘤作用。结果脂质体介导反义MDM2 ODN转染U251人胶质瘤细胞株后，MDM2表达减少，与紫杉醇联合使用可增加细胞的凋亡率，野型生p53的表达量增加，裸鼠动物试验联合治疗组瘤重显著小于单独用药组及对照组。结论MDM2反义寡核苷酸可显著降低MDM2在U25I中的表达，引起细胞凋亡，MDM2反义寡核苷酸与紫杉醇联合作用U251人胶质瘤细胞株具有协同作用。     

脂质体生存素反义寡核苷酸抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用

目的探讨脂质体生存素反义寡核苷酸(ASODN)对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及机理。方法将24只裸鼠建立人胃癌细胞系HS-746T皮下移植瘤模型,用不同的转染液处理后随机分成6组：空白对照组,脂质体组,正义链组,100、200和400nmol／L反义链组(ASODN组)。于注射相应试剂后2,4,8,12,16,20d观测裸鼠移植瘤体积,计算抑瘤率和肿瘤缩小率,观察移植瘤细胞形态变化,免疫组化SP法检测生存素的表达,并用逆转录聚合酶链反应技术(RT—PCR)和Western blot蛋白免疫印迹法比较治疗后不同时间各组肿瘤组织中生存素mRNA和蛋白表达的变化。结果注射后20d空白组、脂质体组和正义链组裸鼠的抑瘤率无明显差异,而ASODN组移植瘤的体积随着时间和浓度的增加而减小,肿瘤缩小率则增大,抑瘤率均大于对照组,400nmol／LASODN组抑瘤率最大为93％。光镜下见ASODN组移植瘤凋亡细胞数增多,生存素表达减弱,6例(6／12)肿瘤组织有坏死液化灶。各ASODN组均能够下调移植瘤细胞生存素mRNA含量,抑制生存素蛋白表达,注射20d后400nmol／L ASODN组蛋白表达为空白对照组的36．8％。结论生存素基因反义寡核苷酸能够通过诱导人胃癌裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡,下调生存素mRNA和蛋白的表达,抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。     

9 Survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞的抑制作用

目的:探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人肝癌细胞HepG2的抑制作用。方法:采用免疫组织化学法检测肝细胞癌（HCC）组织中survivin的表达。采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2，Western blot检测细胞survivin蛋白的表达，FCM检测细胞的凋亡率，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察survivin ASODN的体内抑癌作用。 结果:（1）肝癌组织中survivin表达阳性率为75.8％(25/33)，明显高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.01);（2）survivin ASODN体外转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达，ASODN组HepG2细胞凋亡率明显高于空白对照组和SODN组(P<0.01)，ASODN组HepG2细胞在软琼脂中形成的集落数目明显少于空白对照组和SODN组(P<0.01);（3）ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(P<0.01)，ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(P<0.05)。结论:Survivin在HCC组织中高表达;survivin ASODN可以诱导HepG2细胞凋亡，在体外实验和动物实验中对HepG2细胞生长都有抑制作用。     

靶向抑制survivin基因对肝细胞癌血管生成的影响

目的研究靶向抑制survivin基因对肝细胞癌血管生成的影响,探讨survivin在血管生成中的作用机制。方法采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2,Western blot检测细胞中survivin蛋白的表达;RT-PCR检测细胞中VEGF mRNA的表达;FCM检测细胞的凋亡率;利用皮下注射法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型;采用脂质体包裹survivin ASODN直接瘤内注射,观察其对移植瘤生长情况的影响;SABC法检测移植瘤组织MVD。结果400 nmol/L survivin ASODN转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达,但不影响VEGF mRNA表达;ASODN组HepG2细胞凋亡率显著高于空白对照组和SODN组(F=428.19,P<0.01);ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(F=12.63,P<0.01);ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(F=5.90,P<0.05);ASODN组MVD较空白对照组和SODN组明显降低(F=34.29,P<0.01)。结论survivin ASODN可以抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长,其机理可能是诱导HepG2细胞自发性凋亡和抑制肿瘤血管生成。     

反应停对人肝细胞癌生长侵袭的作用

目的 观察反应停对人肝细胞癌（HCC）血管生成和肿瘤生长侵袭的干预作用。方法 建立高转移潜能人肝癌裸鼠肝原位移植模型，随机分成4组。各组模型自建立次日起分别经腹腔注射0．5％羧甲基纤维素钠（CMC）、反应停（200mg／kg体重）、紫杉醇（13mg／kg体重）、反应停（200mg／kg体重）＋紫杉醇（13mg／d）。给药第30天处死裸小鼠，观察肿瘤生长、转移情况，分别用免疫组织化学和半定量逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）的方法检测癌组织CD34和血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达并记录微血管密度（MVD）。结果 反应停组肿瘤重量、体积均与空白对照组差异无统计学意义（P〉0．05）。各药物处理组肺转移灶计数、MVD和VEGF均低于对照组，以联合用药组最为显著。结论 反应停对HCC生长无明显抑制作用，但能抑制肿瘤血管生成并降低肺转移。     

生存素反义寡核苷酸联合 P53基因抑制胃癌细胞的生长作用

目的 研究生存素（survivin）反义寡核苷酸联合抑癌基因P53对人胃癌细胞系HS-746T的抑制作用及机制。方法 用P53基因和设计合成的survivin反义寡核苷酸（ASODN）对胃癌细胞系HS-746T进行处理，分空白对照组、反义survivin转染组，P53基因组，反义survivin加P53共转染组。采用细胞计数和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力及细胞生长速度，用RT-PCR技术和Western印迹法分析survivin mRNA及蛋白质的表达情况，末端原位标记染色法（TUNEL）分析细胞凋亡指数。结果 不同时间反义survivin转染组、P53基因组和共转染组均对胃癌细胞的生长有抑制作用，且能够下凋胃癌细胞survivin mRNA和蛋白质的表达，共转染组较单独用药组效应明显增强，共转染组胃癌细胞凋亡指数高于另外两组。结论 Survivin反义寡核苷酸联合P53基因抑制人胃癌细胞的生长及诱导凋亡的作用大于单独应用一种药物。     

Survivin反义寡核苷酸对乳腺癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用研究

目的探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法30只裸鼠建立人乳腺癌MCF-7细胞移植瘤动物模型。成瘤后动物随机分3组，每组10只。分别于瘤周及瘤体注射阳离子脂质体（1ipofectin，Lip），ASODN／Lip及NODN／Lip，每5天1次，共3次。观察肿瘤抑制率、肿瘤体积和裸鼠体重的变化。用TUNEL法，透射电镜观察体内瘤体的细胞调亡情况；用Western—blot检测各组肿瘤的survivin蛋白表达情况。结果成功建立了裸鼠皮下移植瘤模型。ASODN／Lip治疗组的肿瘤体积在治疗期内减少，抑瘤率达70．10％；而NODN／Lip治疗组和Lip对照组肿瘤体积增加。各组裸鼠体重无明显变化。ASODN／Lip组细胞凋亡率为38．6％明显高于其他两组，差异有显著性（P〈0．05）。ASODN／Lip组肿瘤的survivin蛋白表达明显降低。结论survivin反义寡核苷酸可有效地抑制人乳腺癌裸鼠皮下肿瘤的生长速度，并促进诱导肿瘤细胞的凋亡。     

槲皮素联合survivin反义核苷酸对肝癌细胞凋亡协同作用的研究

目的 探讨槲皮素联合survivin反义核苷酸(ASODN)对肝癌SSMC-7721细胞株增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法 常规培养SSMC-7721细胞,用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)评价survivin ASODN联合槲皮素对肝癌细胞增殖的影响;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和细胞周期;荧光染色观察细胞形态学变化;并通过RT-PCR和免疫组化方法检测survivin基因表达变化.结果 survivin反义寡核苷酸转染SSMC-7721细胞后,可以显著抑制细胞增殖,其抑制作用具有剂量依赖性,且能诱导肝癌细胞凋亡;联合槲皮索和survivin反义寡核苷酸抑制作用更为显著(t=4.317,P<0.01);RT-PCR及免疫组化显示ASODN和槲皮素均使survivin mRNA和蛋白表达下降.结论 survivin基因反义寡核苷酸联合槲皮素能明显抑制肝癌SSMC-7721细胞增殖、诱导细胞凋亡和下调survivin基因表达;两者具有协同作用.