鸡柔嫩艾美耳球虫疫苗候选基因在大肠杆菌中的表达

目的构建柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原原核表达载体，并且在大肠杆菌中表达。方法将本室构建的pMD-Mz5-7克隆质粒酶切回收目的片段定向亚克隆到pET-28b( )载体上，构建成原核表达载体pET-28b-Mz5-7，酶切鉴定正确后，在Escherichia coli BL21(DE3)中用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果成功构建了目的抗原基因的原核重组表达质粒pET-28b-Mz5-7，IPTG诱导表达该融合蛋白，SDS-PAGE电泳表明，其能表达一分子质量约为37ku的融合蛋白，与预测分子质量相符，最佳反应条件为1mol／LIPTG诱导4h后表达量最高。薄层扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的18％，Western blotting结果显示，表达产物可被抗柔嫩艾美尔球虫的多克隆抗体识别，说明该融合蛋白具有很好的反应原性。结论在原核细胞融合表达Mz5-7成功，为鸡球虫病重组苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建结核分枝杆菌早期分泌蛋白Ag85B和MPT6 4融合基因 (AM )及其原核表达质粒并进行表达。方法　采用 geneSOEing法将ag85b和mpt6 4用疏水甘氨酸接头 (Gly4Ser) 3 融合 ,经限制性内切酶切后克隆入原核表达载体pET32a中 ,进行酶切、PCR鉴定和DNA序列测定。将重组质粒转染Ecoli BL2 1,经过IPTG诱导后其表达产物进行SDS -PAGE和免疫印迹分析。结果　AM融合基因定向克隆入 pET32a中 ,双向测序验证碱基突变率为 0 11% (2 / 170 7) ,均为无意义突变。SDS -PAGE和免疫印迹分析结果均显示在约 73kDa的位置可见明显的蛋白条带。结论　成功地构建了ag85b -mpt6 4融合基因及其原核表达质粒 ,重组质粒能够在大肠杆菌在中表达。     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

柔嫩艾美尔球虫EGF-like结构域基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达柔嫩艾美尔球虫（Eimeriatenella）微线蛋白4（EtMIc4）的EGF-like结构域。方法收集并纯化柔嫩艾美尔球虫子孢子,用Trizol法提取总RNA,并反转录成cDNA,利用RT-PCR技术扩增EtMIC4EGF-like基因;回收PCR产物,与pMDl8-T载体连接,构建重组克隆质粒pMDl8-T-EGF-like,然后亚克隆至原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-EGF-like并转化至Transetta感受态,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果成功克隆了EtMIC4EGF-like（390bp）基因,双酶切鉴定重组表达质粒pET-30a-EGF-like构建正确。SDS-PAGE分析重组EGF-like蛋白的分子质量单位约为30ku,Westernblot显示该蛋白能被鸡抗柔嫩艾美尔球虫血清识别。结论成功构建了pET-30a-EGFlike原核表达质粒,并证明其原核表达产物EGF-like蛋白具有反应原性,为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

微小隐孢子虫CP15抗原基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的　构建微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15的原核表达载体 ,并且在大肠杆菌中表达。　方法　用HindⅢ和EcoRⅠ酶分别从pET 2 8a(+ )和 pMD18 T 15质粒中酶切得到线性片段和CP15基因片段 ,然后用T4DNA连接酶连接 ,构建重组的CP15的原核表达载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中表达 ,并用SDS PAGE、ELISA和Westernblotting进行鉴定。　结果　构建了CP15的原核表达载体 ,得到了一分子质量约为 15ku的融合蛋白 ,占大肠杆菌总蛋白的 3 8%。　结论　CP15融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

融合基因IFN-α1b/CSPⅡ原核表达载体的构建及在大肠埃希菌中的表达

目的　构建融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体并予以表达。　方法　采用聚合酶链反应(PCR)从人基因组DNA中扩增出IFN α1b基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b。利用PCR法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出环子孢子蛋白Ⅱ区 (CSPⅡ )基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体pGEX 4T 1/CSPⅡ 。用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ将IFN α1b从原核重组质粒 pGEX 4T 1/IFN α1b中切下 ,克隆入经相同酶切的原核重组质粒pGEX 4T 1/CSPⅡ 中 ,构建融合基因的原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b/CSPⅡ。融合基因IFN α1b/CSPⅡ经异丙基 β D硫代半乳糖苷 (IPTG )诱导 ,在大肠埃希菌中进行初步表达。结果　构建的原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b、pGEX 4T 1/CSPⅡ和 pGEX 4T 1/IFN α1b/CSPⅡ经PCR和酶切鉴定与预期结果一致。证实融合基因IFN α1b/CSPⅡ拼接成功并正确地克隆入原核表达载体。在大肠埃希菌中表达出融合蛋白IFN α1b/CSPⅡ ,该融合蛋白经十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析与理论预测值相符。经蛋白质印迹法 (Westernblotting)鉴定具有免疫原性。　结论　构建了融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体 ,并在大肠埃希菌中表达了。     

柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP部分序列的克隆及原核表达

目的构建柔嫩艾美尔球虫病毒RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）蛋白部分区段的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中表达目的蛋白。方法根据柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP基因序列设计引物,以病毒基因组dsRNA为模板,RT-PCR扩增目的片段;扩增产物与pMD-18T克隆载体相连接,经测序鉴定序列正确后,将该质粒酶切,酶切目的片段与原核表达载体pET-28a连接构建原核表达质粒,转化入Transetta（DE3）中,经IPTG诱导表达重组蛋白,用SDSPAGE和Western blot分析目的蛋白表达。结果成功克隆柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP基因部分序列,其长度为1 330bp,DNA测序表明重组原核表达质粒构建成功,推导的编码氨基酸序列与GenBank中布氏艾美尔球虫病毒RDRP氨基酸序列同源区段同源性为36%。经SDS-PAGE和Western blot分析,柔嫩艾美尔球虫病毒部分RDRP蛋白得到表达,表达蛋白的分子质量单位为52ku,与理论值相符,且该重组蛋白可被His标签单克隆抗体识别。结论构建的重组原核表达载体pET-28a-RDRP在大肠埃希菌中高效表达柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP蛋白部分区段,为进一步研究该病毒奠定了基础。     

重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定

目的：构建人神经肽Y（NPY）基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清。方法：取已构建好且经测序确认无误的再组质粒pET28a—NPY转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a—NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果经IPTG诱导含有pET28a—NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础。     

丙型肝炎NS5ATP6基因原核表达载体的构建和表达纯化及多克隆抗体的制备

目的构建丙型肝炎病毒NS5A蛋白反式激活蛋白6基因的原核表达载体并进行表达、鉴定。方法从已构建的pGBKT7-NS5ATP6质粒上切取NS5ATP6基因,再克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP6表达重组体。结果以pET32a( )-NS5ATP6重组体分别转化DH5α和Rosseta大肠埃希菌后,经IPTG诱导,pET32a( )-NS5ATP6表达出分子量为41KD左右的重组蛋白。免疫动物并经Westernblot检测证实其具有良好的抗原性。结论成功地构建了原核表达载体pET32a( )-NS5ATP6,诱导表达和纯化了NS5ATP6融合蛋白,并制备了该蛋白的多克隆抗体,为下一步该基因功能研究奠定了基础。     

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

目的　构建原核重组表达质粒pET23aSAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性。　方法　PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18T载体,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET2 3aSAG2,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基 βD硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)与免疫印迹分析表达产物。　结果　PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23aSAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET23aSAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS PAGE显示表达产物约Mr19000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。　结论　成功构建了pET23aSAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性。     

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体，并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a（＋）载体上，构建原核表达载体pET-28a—Ts43，酶切鉴定正确后，导入菌株Rosetta中，用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a—Ts43，IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白，与预测值相符。以0．9mmol／LIPTG诱导4．5h后表达量最高，薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20％。Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功，为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌GGT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆幽门螺杆菌( H pylori)γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)基因,实现GGT基因在大肠杆菌中的表达.方法: 从胃癌患者胃黏膜组织中分离培养获得H pylori,提取其基因组DNA,对GGT基因进行PCR扩增,克隆进pMD18-T载体,酶切和测序验证,构建原核表达载体pET-28a(+)-GGT,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析检测表达产物.结果: 成功克隆了GGT基因,经酶切和测序验证正确,成功构建了pET-28a(+)-GGT质粒,高效表达出了68 kDa的融合蛋白.结论: 在大肠杆菌中成功表达了GGT重组融合蛋白,为进一步研究GGT与线粒体介导的细胞凋亡之间的关系奠定了基础.     

巨型艾美耳球虫ADF基因的克隆及原核表达

目的克隆巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)的ADF基因,并进行原核表达。方法采用RT-PCR方法扩增ADF基因,并将其与原核表达载体pET-28a连接,构建原核表达载体pET-28a-ADF,转化入大肠埃希菌Rossata(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定结果正确。表达分子质量单位为17ku的融合蛋白。Western blot检测融合蛋白能被抗E.maxima多克隆抗体识别。结论构建的原核表达载体pET-28a-ADF能表达具有反应原性的蛋白,为其免疫原性研究奠定了基础。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29基因的表达、纯化及免疫原性初步分析

目的对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)诊断抗原P-29(diagnostic antigen P-29)重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫原性。方法从重组质粒EgP-29/pGEM-T中获取诊断抗原P-29基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白,经Western-blot、ELISA分析重组蛋白的免疫原性。结果成功构建原核重组表达载体EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体IgG,Western-blotting鉴定该抗体能识别重组抗原及天然抗原原头蚴。结论重组蛋白具有良好的免疫原性。     

蓝氏贾第鞭毛虫末端结合蛋白 1 基因的克隆与原核表达

目的 克隆并原核表达 C2 株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia,简称贾第虫)末端结合蛋白 1(End-bind- ing protein 1,geb1)基因,获得重组 gEB1 蛋白。 方法 由于 geb1 基因无内含子,我们以 C2 株贾第虫基因组为模板,以国际标准株WB 株geb1 基因序列为参考序列,设计引物克隆 geb1 基因,经 NcoⅠ和 XhoⅠ双酶切与原核表达载体 pET-28α(+)连接,转化感受态 E. coli TOP10,经筛选和测序验证后导入大肠杆菌 E. coli Rosetta(DE3),异丙基-β-D -硫代半乳糖(IPTG)诱导 gEB1 蛋白表达,产物经 SDS-PAGE 和 Western blot 进行检测和验证。 结果 成功构建了表 达 C2 株贾第虫 geb1 基因的原核表达载体 pET-28α(+)- gEB1,转化入大肠杆菌 E. coli Rosetta(DE3),重组菌株经 0. 1 mmol / L IPTG ,30℃低温诱导 5 h, SDS-PAGE 和 Western blot 显示,在相对分子量约 29 KDa 的位置出现目的蛋 白条带,与理论值一致。 结论 用大肠杆菌成功表达了 gEB1 蛋白,为 gEB1 蛋白的功能研究和抗体制备提供了材料。     

乙型脑炎病毒NS5蛋白原核表达与亚细胞定位研究

目的对乙型脑炎病毒NS5蛋白进行原核表达和亚细胞定位研究。方法通过PCR扩增乙型脑炎病毒NS5基因,并将之克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中,构建的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后,免疫BALB/c小鼠,制备NS5蛋白特异性的多克隆抗体。同时,构建NS5基因与绿色荧光蛋白（EG-FP）融合表达的真核表达质粒pcDNA-NS5-EGFP,将之转染BHK-21细胞,利用激光共聚焦荧光显微镜观察NS5蛋白在BHK-21细胞中的亚细胞定位。结果 NS5蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达蛋白分子量大小约为103kD,该蛋白在真核细胞中的表达呈颗粒状不均匀分布于整个细胞,且颗粒状主要分布在细胞质中。结论成功表达乙型脑炎病毒NS5蛋白,并对NS5蛋白的亚细胞定位进行了分析,为进一步研究NS5蛋白提供依据。     

克隆、表达和纯化具有生物学活性的巴西诺卡菌P61蛋白

目的构建巴西诺卡菌P61基因原核重组表达载体,在大肠杆菌中表达具有生物活性的P61蛋白,为P61蛋白的进一步相关研究提供实验基础。方法通过基因合成的方法合成P61基因,将其插入到质粒pET30a(+)载体并导入BL21大肠杆菌,应用IPTG进行诱导表达。通过Western Blot对表达产物进行分析。应用过氧化氢酶检测试剂盒检测其过氧化氢酶活性。结果 P61蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,且具有较高的过氧化氢酶活性,能被感染巴西诺卡菌的小鼠血清识别。结论成功构建了巴西诺卡菌P61蛋白的原核表达质粒,并能在原核表达宿主E.coli BL21中进行高效表达,且表达产物具有过氧化氢酶活性。     

阴道毛滴虫沉默信息调节因子2同源基因的原核表达载体构建及表达

提取阴道毛滴虫（T.vaginalis）LX006细胞株传代培养细胞总RNA，RT-PCR扩增Tv-Sir2-like全长cDNA链，扩增产物连接到T-A克隆载体并转化大肠埃希菌（E.coli）JM109。提取重组克隆质粒，并用限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ进行双酶切，将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-41b，并在E.coli BL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果显示目的基因定向克隆于原核表达质粒pET-41b获得了表达重组子，IPTG诱导该原核表达载体在E.coli BL21中表达相对分子质量（Mr）约为59 000的重组融合蛋白，表达量占菌体总蛋白量的30%。     

4种血清型登革病毒多表位重组抗原的表达及血清学初步评价

目的在原核表达系统中对登革病毒包膜蛋白(E蛋白)和非结构蛋白1(NS1)融合的B细胞抗原表位进行表达、纯化及血清学评价。方法将B细胞抗原表位用形成α螺旋的连接肽(EAAAK)2作为接头,串联合成1条全新的多表位融合重组基因rE,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达融合蛋白,用镍柱对重组蛋白纯化,并用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。以融合蛋白为抗原,用间接ELISA检测登革热病人血清IgM抗体。结果重组表达载体pET28a-rE构建成功,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,用镍柱纯化获得高纯度的目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示蛋白分子量大小与预期结果相符,建立的间接ELISA具有较高的准确性。结论原核表达的登革病毒多表位融合蛋白具有良好的血清学检测价值。     

新孢子虫NcSAG4基因克隆及原核表达

目的构建新孢子虫NcSAG4基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。方法根据新孢子虫NcSAG4基因序列设计特异性引物,以新孢子虫总核酸为模板PCR扩增目的片段,与pMD-18-T连接,构建克隆载体pMD-NcSAG4,经双酶切后回收目的片段,与表达载体pGEX-T连接,构建原核表达载体pGEX-NcSAG4,用IPTG诱导,通过SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果成功构建了新孢子虫NcSAG4基因原核表达载体pGEX-Nc-SAG4;SDS-PAGE电泳显示,在IPTG诱导下阳性菌高效表达了分子质量单位为18.79ku的蛋白质;Western blot显示表达产物可被抗新孢子虫的多克隆血清识别。结论成功构建了NcSAG4基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,为建立经济、实用的诊断新孢子虫病的ELISA方法奠定了基础。