KCNQ1在小鼠耳蜗血管纹的表达及在听觉中的意义

目的探讨KCNQ1在耳蜗侧壁血管纹的表达及其在听觉中的作用。方法以不同基因型小鼠KC-NQ1-/-(突变纯合子)、KCNQ1 /-(杂合子)和KCNQ1 / (野生型)以及C57BL/6J小鼠为实验对象,采用免疫组织化学和ABR检测技术,检测KCNQ1在小鼠耳蜗血管纹的表达及其听力。结果KCNQ1蛋白阳性颗粒集中在小鼠耳蜗血管纹边缘细胞顶膜。KCNQ1 / 小鼠的听力正常,短声ABR的阈值为36.67±7.13dBSPL;KCNQ1 /-小鼠听力低于同窝KCNQ1 / 野生型鼠,短声ABR的阈值为38.25±9.35dB SPL;KCNQ1-/-小鼠呈现全聋,ABR在100dB SPL时仍无反应。结论KCNQ1是位于耳蜗侧壁血管纹边缘细胞的重要通道蛋白,在维系耳蜗听觉功能中有重要作用。KCNQ1通道蛋白的缺失或功能受限可以不同程度地影响耳蜗的听觉功能。     

钾离子通道基因与耳蜗听觉功能

钾离子通道与多种疾病有关，钾离子通道基因突变可以造成综合征型和非综合征型听力下降，表明在耳蜗听觉生理过程中，钾离子发挥着重要作用。耳蜗内淋巴液中富含钾离子，维持内淋巴内的高电位，转运大多数正电荷，机械电转导时在细胞顶部发生去极化。毛细胞的基底外侧（basolateral）通道中有KCNQ4、KCNN2和KCNMA1钾离子通道，顶端（apical）钾离子通道有KCNQ1／KCNE1，另外位于血管纹中间细胞的KCNJ10（Kit4．1）钾离子通道产生内淋巴电位。目前已经发现的与人类耳聋有关的钾离子通道有KCNQ4和KCNQ1／KCNE1。     

Smad4 基因缺陷小鼠耳形态学改变的初步研究

目的研究Smad4基因缺陷小鼠中耳及内耳的病理形态学改变，探讨Smad4基因对中耳及内耳发育的影响。方法利用建立的Smad4基因敲除嵌合体小鼠模型，通过火棉胶包埋HE染色观察Smad4（＋/＋）与Smad4（＋／-）小鼠的情况；通过耳蜗基底膜铺片琥珀酸脱氢酶染色观察Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠的耳蜗内、外毛细胞数量；应用扫描电镜观察Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠的内耳超微结构。结果火棉胶包埋HE染色显示：Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠耳蜗大小、耳蜗转数均未见异常，中耳鼓膜正常，听小骨锤骨、砧骨、镫骨及关节结构正常，骨细胞排列紧密，Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）之间没有差异。Smad4（＋／＋）小鼠耳蜗Corti器结构完整，未圯异常，血管纹厚薄均匀，血管腔腔径大小均匀。内、外毛细胞及内外柱细胞、支持细胞无异常，螺旋神经节细胞未见缺失；Smad4（＋／-）小鼠耳蜗钩端至-回外毛细胞轮廓不清，呈均质化，细胞核消失。Deiter细胞核下沉或消失，相应的螺旋神经节细胞大量缺失。耳蜗基底膜铺片琥珀酸脱氢酶染色显示：Smad4（＋／-）和Smad4（＋／＋）小鼠均有明显的局限于Corti’S器底同的外毛细胞缺失，其中Smad4（＋／-）小鼠外毛细胞的缺失，比Smad4（＋／＋）小鼠更明显（P〈0．01），两个基因型小鼠的内毛细胞均未见缺失。扫描电镜显示：Smad4（＋／＋）小鼠未见明显病理变化，Smad4（＋／-）小鼠耳蜗钩端外毛细胞静纤毛广泛散在性缺失，外毛细胞的表皮板穿孔、自溶，其周边与指状突小皮板断离。两个基因型小鼠耳蜗内毛细胞纤毛均未见明显改变。结论Smad4基因敲除后内耳形态发生明显改变，表明Smad4基因缺陷导致小鼠内耳细胞损害。     

半拷贝基因NKCC1杂合小鼠与年龄相关性听力下降的关系

目的培育杂合子NKCC1＋／一和野生型NKCC1＋／＋小鼠，观察携带不同拷贝基因的NKCC1小鼠的年龄相关性听力表现，研究NKCC1基因及其离子通道在年龄相关性听力下降（agerelated hearing loss，AHL）中的作用，并初步探讨其可能发生的机制。方法运用NKCC1＋／一杂合子小鼠和NKCC1＋／＋野生型小鼠为平台，于小鼠生长过程中的各个年龄段分别检测小鼠的听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）和耳蜗内电位（endocochlear potential，EP）；同时采用扫描电镜进行耳蜗形态学观察和免疫印迹杂交检测不同鼠龄小鼠耳蜗的NKCC1通道蛋白的含量。结果NKCC1＋／一杂合子小鼠与NKCC1＋／＋野生型小鼠相比较，其ABR检测短声阈值在每一年龄组的各测试频率均升高，各年龄组相比较差异有统计学意义（P值均〈0．05）。NKCC1＋／一杂合子半拷贝基因鼠的听力随年龄增长而逐渐下降，与低龄鼠相比，老龄鼠的ABR阈值显著性升高（P值均〈0．05）。NKCC1＋／-小鼠的EP也随年龄增长而呈下降趋势，老龄小鼠的EP值与其低龄鼠相比明显降低（P〈0．05）。老龄小鼠的耳蜗NKCC1蛋白含量低于低龄鼠。与老龄NKCC1＋／＋鼠相比较，老龄NKCC1＋／-鼠的耳蜗底回外毛细胞出现散在的点状缺失。结论当NKCC1基因呈现半拷贝复制时小鼠可呈现AHL，NKCC1基因可能在AHL的发病中起一定的作用。AHL的发病可能与NKCC1通道蛋白的遗传特性及功能有关，还可能与NKCC1＋／-鼠出现的耳蜗底回外毛细胞缺失有关。     

钾离子通道基因与耳蜗听觉功能

钾离子通道与多种疾病有关,钾离子通道基因突变可以造成综合征型和非综合征型听力下降,表明在耳蜗听觉生理过程中,钾离子发挥着重要作用。耳蜗内淋巴液中富含钾离子,维持内淋巴内的高电位,转运大多数正电荷,机械电转导时在细胞顶部发生去极化。毛细胞的基底外侧(basolateral)通道中有KCNQ4、KCNN2和KCNMA1钾离子通道,顶端(apical)钾离子通道有KCNQ1/KCNE1,另外位于血管纹中间细胞的KCNJ10(Kir4.1)钾离子通道产生内淋巴电位。目前已经发现的与人类耳聋有关的钾离子通道有KCNQ4和KCNQ1/KCNE1。     

耳蜗钾循环中Na—K-2C1与听觉生理关系的研究进展

耳蜗钾循环对维持正常听觉生理功能具有重要作用。耳蜗钾循环途径中涉及诸多离子通道，本文就其中的Na—K-2C1联合转运子（NKCC）-1与听觉生理关系的研究进展综述如下。     

MARK4基因在小鼠的表达研究及其在DFNA4基因搜寻中的意义

目的探讨微管亲和力调节激酶基因MARK4基因在小鼠不同组织（尤其耳蜗）中的表达情况，以及在不同发育期耳蜗中的表达变化，研究该基因与听觉系统功能的关系，为DFNA4型耳聋基因的定位克隆提供有意义的线索。方法分别取成年（30天）健康NIH小鼠的五种组织（心、肝、肾、脑、耳蜗）以及不同发育期（出生后6、11、15、30天）健康NIH小鼠的耳蜗组织，提取各组织的总RNA，针对小鼠MARK4基因的mRNA序列（NM-172279），设计引物进行逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）；同时，利用生物信息学方法了解MARK4基因与DF—NA4型耳聋基因座的定位关系。结果①成年小鼠（30天）五种组织中，除心脏组织外其余四种组织均有MARK4基因的表达，以肝、肾中表达量较高，而耳蜗和脑组织中表达稍弱，表现出一定的组织特异性；②处于新生期（6天）、幼年期（11、15天）、成年期（30天）的小鼠，其耳蜗组织中均有MARK4基因的表达，以新生期表达量最高，生长至成年期时较前稍有降低，但无统计学差异；③MARK4基因位于人类19号染色体的长臂上，恰位于中国DFNA4型耳聋家系的定位区域。结论MARK4基因在成年小鼠的表达具有一定的组织特异性，其在耳蜗组织的表达情况提示该基因与听觉功能相关，可能在小鼠听觉系统的发育过程中产生作用。MARK4基因无论从位置上还是功能上考虑，均是中国DFNA4型耳聋家系极好的候选基因。     

Cu／ZnSOD基因敲除小鼠—研究耳蜗氧化损伤的理想模型

目的 确定一个理想的耳蜗氧化损伤模型。方法 对5只Cu/ZnSOD基因敲除纯合突变（Cu/ZnSOD无活性,Sod1-/-)小鼠和10只Cu/ZnSOD杂合突变（50％Cu/ZnSOD失活,Sold /-)小鼠及5只野生小鼠（Cu/ZnSOD活性正常,Sodl / )进行ABR检测及内、外毛细胞计数。应用PCR技术检测Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mtDNA缺失情况。结果 Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗内外毛细胞大量缺失（P＜0.001),ABR检测,Sodl-/-小鼠ABR阈值在8,16,32kHz及Sodl /-小鼠ABR阈值在16,32kHz明显增大（P＜0．001）。Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mDNA有三种缺失,分别为mtDNA 3867bp、mtDNA3726bp及mtDNA 4326bp缺失。结论 Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗在细胞及分子水平上的表现出受到ROS损伤的改变,是一个理想的耳蜗氧化损伤模型。     

重组腺病毒构建及介导报告基因在豚鼠耳蜗中的表达

目的：带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒,为利用重组腺病毒介导外源基因转导内耳提供依据。方法：通过细菌内同源重组方法构建携带有报告基因的重组腺病毒（Ad-GFP）,将重组腺病毒经耳蜗底回途径导入豚鼠耳蜗鼓阶外淋巴后,观察手术后不同时间GFP基因在豚鼠耳蜗内的表达、分布情况;检测手术前后听觉脑干诱发电位,观察手术和病毒对豚鼠听觉功能的影响。结果：构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确;豚鼠耳蜗底回途径导入腺病毒24 h后即有报告基因表达,3 d后最高,表达时间可持续2周以上;报告基因表达部位主要分布在血管纹、鼓阶外淋巴面的间皮细胞和耳蜗Corti器等部位;听觉脑干诱发电位（ABR）在各组动物手术前后无明显改变。结论：成功构建了携带GFP基因的重组腺病毒,通过该方法构建的腺病毒可以介导报告基因在豚鼠耳蜗中表达,并且对豚鼠听觉功能无明显影响,为内耳基因治疗提供了理论依据。     

Smad4基因敲除对小鼠听力和前庭功能的影响

目的研究Smad4基因敲除（Smad4＋/-）小鼠听力和前庭功能的改变.方法检测Smad4基因敲除小鼠（1、2、3、6月龄）与同种同月龄的野生型（Smad4＋/＋）小鼠的ABR阈值.按Steal的方法测定小鼠的平衡功能,包括游泳试验、空间姿势反射,以及一般行为观察.结果 2、3、6月龄Smad4＋/-小鼠听力较同种野生型小鼠明显下降,两种基因型小鼠听阈有显著性差异（P〈0.01）,但1月龄的不同基因型小鼠听力水平无统计学差异（P〉0.05）.Smad4基因敲除小鼠与野生型小鼠外观和体重无明显差异（P〉0.05）,生后至6月龄的Smad4＋/-小鼠与野生型小鼠均无前庭功能异常和行为异常.结论单倍体Smad4基因敲除小鼠听力明显障碍,但前庭功能基本正常.表明Smad4对内耳的听觉有重要作用,可能存在着单倍体功能不全性;而单倍体Smad4基因缺失对于前庭功能影响可能不明显.