SARS-CoV N蛋白研究进展

SARS-CoV(severe acute respiratory syndrome coronavirus)N蛋白是病毒的重要结构蛋白,也是目前倍受关注的蛋白组分.N蛋白位于病毒颗粒的核心,以与基因组RNA结合的形式存在,具有多种重要的生物学功能.本文就近期对SARSCoV N蛋白的研究进展作一综述.     

重组SARS-CoV核衣壳蛋白的表达纯化及其单克隆抗体的制备鉴定

目的目的表达纯化SARS冠状病毒(SARS-CoV)的核衣壳蛋白(nucleocapsid N蛋白),并制备出高安全性、高特异性的针对该蛋白的单克隆抗体(McAb),为SARS的早期快速诊断提供有力的抗体工具。方法在不接触病原体的前提下,采用全基因合成方式分别将SARS-CoV N蛋白编码基因第1-549位碱基(N端)和第496-1269位碱基(C端)直接合成至原核表达载体pET32a(+),表达、纯化重组蛋白(分别记为N1蛋白、N2蛋白),并以纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备特异性针对N蛋白的单克隆抗体,以间接ELISA法对所需的杂交瘤细胞株进行配对筛选,分析其亚类,以Western blot和间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体特异性。结果成功表达并纯化SARS-CoV N1、N2蛋白,筛选出7株抗SARS-CoV N1蛋白及2株抗SARS-CoVN2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定6株为IgG1,2株为IgG2b,1株为IgG3,Western blot及间接免疫荧光证实所获的单克隆抗体可与SARS-CoV N蛋白发生特异性反应。结论重组SARS-CoV N蛋白成功表达及纯化,并由此获得了SARS-CoV特异性单克隆抗体,为SARS预防检测和发病机制研究奠定基础。     

湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶全长基因克隆、表达与蛋白活性分析

目的克隆湖北钉螺(Oncomelania hupensis)硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)全长基因cDNA,并分析其表达蛋白的抗氧化活性。方法抽提人工饲养的阴性湖北钉螺总RNA,采用逆转录PCR方法扩增TPx基因片段。使用快速扩增cDNA末端法(RACE)扩增TPx基因,获得全长基因cDNA,与质粒pGEM-Teasy连接后,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选、测序,并进行生物信息学分析。克隆质粒pGEM-Teasy/TPx和表达载体pET28a经双酶切后连接,构建重组表达质粒pET28a/TPx,转入E.coli BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,通过组蛋白标签镍离子(Ni-NTA)层析柱分离纯化可溶性蛋白。在体外过氧化氢(H2O2)还原试验中,分别加入不同浓度的TPx重组蛋白(10、20、30、40和50μg/ml),各浓度均设二硫苏糖醇(DTT)平行对照,计算H2O2清除率。在DNA超螺旋保护试验中,分别加入2.5、5.0和10μg/ml重组蛋白,观察其对DNA超螺旋结构的保护作用。结果 TPx全长基因cDNA为992bp,开放阅读框(ORF)为747bp,GenBank登录号为JN831437,编码249个氨基酸,预期蛋白相对分子质量(Mr)为27 000。重组质粒pET28a/TPx构建成功,经诱导表达和纯化后获得了可溶性重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,Mr为27000。体外H2O2还原试验结果显示,含有DTT的反应体系H2O2清除率均显著高于不含DTT的体系(均P<0.05),各个浓度组间差异无统计学意义(均P>0.05)。DNA超螺旋保护试验结果显示,5.0μg/ml组保护效果优于2.5μg/ml组,但5.0μg/ml组和10μg/ml组的保护效果差异不明显。结论获得湖北钉螺TPx全长基因cDNA,且重组表达蛋白具有一定抗氧化功能。     

猪链球菌WC—SS7株GDH基因的表达及GDH蛋白单克隆抗体的制备

目的原核表达猪链球菌7型临床分离株WCSS7的GDH蛋白,制备抗GDH蛋白的单克隆抗体（mAb）。方法将临床分离的猪链球菌7型WC—SS7株的GDH基因克隆入表达载体pET-30a,转入大肠杆菌中,用IPTG诱导表达,用Ni化琼脂糖柱（Pierce）纯化的GDH蛋白免疫BALB／c小鼠,取鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA方法筛选阳性克隆,对抗WC—SS7GDH蛋白单克隆抗体进行特异性鉴定及亚型鉴定。结果表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析后,在约为52KD处可见一条明显的诱导表达带,说明GDH蛋白得到了正确的表达;细胞融合后检测为阳性的细胞株经过3次单克隆筛选,最终得到了6株能和GDH蛋白反应的能稳定分泌单抗的阳性细胞克隆,这些单抗通过Western鉴定结果显示其具有良好的特异性,6株单克隆抗体亚型鉴定结果显示其亚型均为IgG1型,且轻链均为k链。结论本研究成功表达了WCSS7的GDH蛋白,并获得了6株能和GDH蛋白反应的、能稳定分泌单抗的阳性细胞克隆,所获得的重组GDH蛋白及特异性单克隆抗体能用于猪链球菌结构和功能的研究,为猪链球菌临床感染血清学诊断方法的建立奠定基础。     

截短弓形虫表面抗原SAG2C的基因克隆、蛋白表达及其初步应用

目的克隆截短的弓形虫表面抗原SAG2C基因,在大肠埃希菌中表达SAG2C蛋自,并探讨其在弓形虫病诊断中的应用。方法对已知的弓形虫SAG2C基因序列进行部分取舍,用RT-PCR技术从弓形虫Prugniaud（PRU）株的总RNA中扩增截短的SAG2基因片段,插入载体pET32a（＋）中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达,应用westemblot和EI—ISA检测重组表达蛋白的免疫反应性。用重组SAG2C蛋自ELISA祛检测弓形虫感染血清特异抗体．观察初步应用效果。结果从弓形虫PRU株总RNA中扩增出截短的SAG2CC基因片段,成功构建了重组表达质粒pET32a（＋）-tSAG2C;该重组质粒经IPTG诱导能表达可溶性大小为51ku的SAG2C蛋白。Western blot显求重组SAG2C能被弓形虫感染小鼠血清识别;以重组SAG2C蛋门、重组SAG1蛋白及BAG1蛋白ELISA检测精神病患者血清弓形虫抗体,阳性率分别为8．07%（23／285）、4．56％（13／285）和7．37％（21／285）,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功构建了重组质粒pET32a（＋）-tSAG2C,表达的融合蛋白具有免疫反应性,具有用于弓形虫感染诊断的潜在价值。     

甲状腺激素反应蛋白1的原核生物表达

目的 应用基因工程技术表达甲状腺激素反应蛋白1(TRP-1)。方法 应用RT-PCR方法，从新生大鼠脑组织RNA中扩增编码TRP-1的cDNA片段，构建表达型重组质粒，经DNA序列分析确证后，在大肠杆菌中表达，以Western印迹来初步鉴定是否表达了目的融合蛋白，用亲和层析纯化融合目的蛋白，并以SDS-PAGE电泳测定其相对分子质量。结果 所获特异PCR产物正确地重组入Pinpoint Xa-1表达载体中。Western印迹表明经异丙基硫代半乳糖苷诱导的原核细胞表达产生了目的融合蛋白，亲和层析得到了纯度较高、相对分子质量约23400的融合目的蛋白。结论 应用原核细胞表达体系成功地表达了TRP-1融合蛋白，为进一步研究其在脑发育中的所起的作用以及该蛋白的其它功能提供了可能。     

日本血吸虫大陆株粘蛋白样蛋白部分基因的克隆

目的构建日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白(SjMLP)核酸疫苗。方法分子克隆常规操作将扩增产物 SjMLP 编码区基因序列克隆至载体 pUCm-T 中,然后亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1( )中。结果经酶切、PCR 及测序鉴定表明所构建的质粒 pUCm-T/SjMLP 和 pcDNA3.1( )/SjMLP 中含有所扩增的基因序列。结论成功地构建了含目的基因的真核表达质粒 pcDNA3.1( )/SjMLP,从而,为进一步对其进行 DNA 免疫系列研究工作奠定了基础。     

Ⅰ型登革病毒ns1基因克隆及其表达产物的免疫原性研究

目的克隆并表达Ⅰ型登革病毒非结构蛋白1(NS1)基因,初步鉴定其免疫原性。方法登革热Ⅰ型病毒标准株感染C6/36细胞后,抽提病毒RNA,经RT-PCR方法扩增出NS1全长基因片段,经T-A克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用兔抗Ⅰ型登革病毒免疫血清及登革热患者血清对重组蛋白进行Western Blot及ELISA鉴定。结果构建的重组质粒pQE-30/DV1NS1经IPTG诱导,重组蛋白NS1高效表达并纯化成功,经Western Blot及ELISA证实重组蛋白NS1可以被免疫血清和病人血清特异识别。结论Ⅰ型登革病毒非结构蛋白NS1表达载体在大肠杆菌M15中高效表达。纯化产物具有较强的免疫原性,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定了基础。     

人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达

目的构建高效表达球状脂联蛋白的真核表达载体，为研究脂联素、球状脂联蛋白在2型糖尿病及动脉粥样硬化中的作用奠定基础。方法克隆人脂联素基因，构建球状脂联蛋白基因的真核表达载体，转染人脐静脉内皮细胞株（HUVEC），Western blot检测上清中球状脂联蛋白的表达。结果测序结果表明克隆的人脂联素基因序列正确;构建的球状脂联蛋白基因真核表达载体能有效转染HUVEC，并在上清中检测到该基因的表达。结论完成人脂联素基因克隆，成功构建了人球状脂联蛋白基因真核表达载体，并在HUVEC中获得分泌表达，为研究球状脂联蛋白对2型糖尿病的干预作用提供了可能。     

甲型H1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的真核表达与纯化

目的构建甲型SWH1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的杆状病毒真核表达载体,转染sf9细胞表达并纯化其编码蛋白。方法从江苏甲型H1N1流感病毒毒株[A/Jiangsu/1/2009（H1N1）]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA1基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/HA1质粒,双酶切pMD18-T/HA1与p-fast后,连接构建真核表达载体p-fast-HA1,转化DH10Bac细胞,转座构建杆状病毒HA1-Bacmid,经酶切及测序鉴定后将HA1-Bacmid转染到sf9细胞中,通过免疫印迹法鉴定HA1蛋白的表达,采用亲和层析法纯化HA1蛋白。结果经双酶切、测序鉴定证实HA1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实HA1基因的表达;纯化获得了高纯度的HA1蛋白。结论成功克隆了HA1基因,并构建了其杆状病毒真核表达载体,该表达载体的构建为后期的流感快速检测以及基因工程疫苗制备奠定了良好的基础。     

SARS冠状病毒N蛋白致大鼠肺部炎症及糖皮质激素对其的作用

目的探讨严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒N蛋白所致大鼠肺部炎症反应及糖皮质激素(以下简称激素)对其的调节作用。方法24只SD大鼠随机分为4组,每组6只;A组大鼠气管内滴入无菌生理盐水0.2ml,B组(6h)、C组(24h)大鼠气管内滴入SARS病毒N蛋白溶液0.2ml,D组大鼠气管内滴入SARS病毒N蛋白溶液0.2ml的同时腹腔内注射10mg/kg地塞米松。测4组大鼠外周血、支气管肺泡灌洗液(BALF)中WBC总数及分类;测4组大鼠肺组织湿/干(W/D)比值;观察4组大鼠肺组织病理学变化;ELISA测4组大鼠血清及BALF中IL6、IL10、转化生长因子(TGF)β1水平。结果(1)外周血淋巴细胞比例C组较A组低(P<0.05),D组较A、C组均低(P值均小于0.01);D组WBC总数较A、C组均低(P<0.01)。BALF中WBC总数C组较A组高(P<0.05),D组较C组低(P<0.05);B、C组BALF中肺泡巨噬细胞占98%～99%。(2)肺脏W/D比值B、C组较A组高(P<0.05),D组较C组低(P<0.01)。(3)肺组织病理学变化:B、C组大鼠肺泡间隔明显增宽,有较多的炎性细胞渗出,包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、成纤维细胞等,血管充血、淤血,有的支气管腔内有炎性细胞渗出,C组变化较B组无明显加重;D组大鼠肺组织炎性反应较B、C组减轻,肺泡间隔变薄,炎性细胞渗出减少。(4)血清及BALF中IL6、IL10、TGFβ1水平B组较A组高(P<0.01),C组进一步升高(P<0.01),D组较C组低(P<0.01)。结论SARS冠状病毒N蛋白具有致病性,能够引起大鼠肺部炎症反应和(或)急性肺损伤,肺损伤与促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子的升高及失衡有关;激素可有效地减轻SARS冠状病毒N蛋白所致的肺部炎症反应。     

人基质金属蛋白酶-1的基因克隆、表达及其产物抗原性的分析

目的 构建人基质金属蛋白酶-1(MMP-1)基因重组质粒的克隆，获得具有抗原性的人MMP-1融合蛋白。方法 从人肝组织提取总RNA，以此为模板，逆转录巢式PCR扩增MMP-1全编码区基因片段，构建含目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆，经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达MMP-1重组质粒菌，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot对重组蛋白进行分析鉴定。结果 经核苷酸序列测定和免疫印迹鉴定，成功地构建了人MMP-1重组质粒基因工程菌，并表达具有MMP-1抗原性的融合蛋白。结论 构建了人MMP-1重组质粒克隆，获得了具有抗原性的MMP-1融合蛋白，这将有助于今后制备MMP-1多克隆抗体。     

日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)的编码基因。方法根据日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入SalI酶切位点和终止密码子TAA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SjcTrx基因。经双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcTrx,转化BL21感受态菌并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcTrx/BL21用IPTG诱导表达。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334 bp,构建的重组pET28a-SjcTrx表达质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段。根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,约14kDa。Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清所识别。结论SjcTrx基因的表达获得成功,并获得纯化蛋白,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA2全基因的原核重组表达

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白2（GRA2）的全长基因,在大肠埃希菌工程菌中重组表达GST—His—GRA2融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA2基因全长,与pET-41Ek／LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠埃希菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,然后采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白产物。结果PCR鉴定弓形虫GRA2全基因重组表达质粒构建正确;诱导表达的GST—His—GRA2融合重组蛋白分子质量单位为52ku,与预测值相符。结论本研究成功构建了弓形虫GRA2全基因重组蛋白质粒,该质粒能表达GRA2蛋白,为研究GRA2与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

肺炎支原体P1黏附蛋白基因的克隆与表达

目的对肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)3’端的P1黏附蛋白基因片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和表达产物的免疫性分析，为临床诊断试剂和疫苗的研制打下基础。方法应用PCR技术直接从MpFH株染色体DNA中扩增894bp的3’端p1基因片段(p1’)，将此基因片段插入表达载体pGEX-6P-1后，转入大肠杆菌BL21扩增后提取重组质粒进行酶切、PCR扩增及核苷酸测序进行鉴定。诱导阳性克隆株表达重组蛋白后纯化，用兔抗Mp多克隆血清通过免疫印迹实验鉴定其免疫反应性。结果插入重组质粒的p1基因片段经测序后，与GenBank中p1基因核苷酸序列(AF290001、AF290002、AF286371、AE000002、M21519、M18639)比较，其同源性为99．66％～100%。氨基酸序列同源性为99．32％～100%。经SDS—PAGE分析。重组蛋白的相对分子量约为59kDa。免疫印迹实验证实重组蛋白是P1黏附蛋白抗原。结论成功构建了pGEX-6P-1-p1’重组质粒并获得表达。此p1’基因重组质粒表达的蛋白具有免疫反应性，有希望成为特异性抗原诊断试剂和疫苗的候选抗原。     

日本血吸虫卵壳蛋白前体基因Sj423的克隆表达及分析

据日本血吸虫菲律宾株编码卵壳前体蛋白的一段230bp的序列设计PCR引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出日本血吸虫中国大陆株相应的基因片段、然后根据测序结果设计一系列引物,用5’RACE和3’RACE法扩增出该基因cDNA的5’和3’端,再根据测序结果设计全长引物,用RT-PCR方法扩增出大小为423bp的片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株卵壳前体蛋白基因的完整阅读框,对相应基因组区段测序证实该基因没有内含子(GenBank登录号:AF519182)。将其克隆到表达载体pET28c(+)中,在大肠杆菌中获得表达,融合表达产物分子量约为20.9 kD。Real-ti me PCR结果显示该蛋白在尾蚴感染宿主后第23d即卵壳形成时高表达。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。     

幽门螺杆菌1pp20基因的克隆与表达

目的 克隆及表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori)lpp20基因，为探索高效的防治幽门螺杆菌感染的疫苗抗原和诊断抗原奠定基础。方法 用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp20基因片段，将目的基因插入的表达载体pMAL-C2X中，用重组质粒转化大肠杆菌（E.coli TB1），并在E.coli TB1中进行表达。用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果 用PCR方法扩增的lpp20基因长度约为540bp；经酶切、PCR和测序分析，插入到载体的基因片段与文献报道的基因序列一致；SDS-PAGE的结果显示，目的基因表达产物的相对分子质量为18kDa，融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的34%。结论 本研究中构建的pAML-C2X与lpp20基因重组质粒在E.coli TB1中能够高效表达目的基因。该重组子的构建为幽门螺杆菌lpp20基因的研究建立了重要的基础。     

结核分枝杆菌新抗原Mtb8.4基因的克隆与真核表达

目的克隆结核杆菌新抗原Mtb8．4基因，导入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4，并在真核细胞中进行表达。方法提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增，获得Mtb8．4目的基因后，与pcDNA3．1（＋）载体进行连接重组，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定；重组质粒转染COS-7细胞48k后，用RT-PCR方法鉴定Mth8.4在转录水平的表达情况。结果pcDNA3．1（＋）．Mth8．4真核表达载体构建成功；转染COS-7细胞后，Mtb8．4在转录水平成功表达。结论pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4真核表达质粒的构建成功以及Mtb8．4在COS-7细胞中的成功表达，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4DNA疫苗奠定了基础。     

刚地弓形虫硫氧还蛋白基因的克隆 表达及鉴定

目的 目的 克隆刚地弓形虫硫氧还蛋白 （Thioredoxin,Trx） 基因, 构建原核表达载体, 通过诱导表达和纯化蛋白, 免 疫家兔制备多克隆抗体。方法 方法 采用PCR技术扩增刚地弓形虫Trx基因, 克隆至原核表达载体pET?28a （+） 中, 转化大肠 埃希菌 （E. coli） Rosetta, 用IPTG诱导目的蛋白表达, 采用镍亲和层析法获得纯化蛋白并免疫家兔制备多克隆抗体。利用 Western blotting技术鉴定多克隆抗体的特异性。结果 结果 成功从刚地弓形虫 cDNA 中扩增出 Trx 目的基因, 构建了 Trx/pET?28a （+） 重组质粒, 获得抗Trx重组蛋白的多克隆抗体。Western blotting技术检测出弓形虫Trx蛋白的特异性条 带。结论 结论 用制备的兔抗Trx多克隆抗体能检测弓形虫Trx在速殖子内的表达, 为进一步深入研究刚地弓形虫Trx功能 奠定了基础。