SD大鼠骨骼肌卫星细胞系的建立及诱导其向成肌、成脂和成骨分化

目的:建立SD大鼠骨骼肌卫星细胞的细胞系,为组织工程学提供种子细胞和研究资料.方法:采用两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞.MTT法观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖特性并绘制生长曲线图,流式细胞仪检测细胞周期.观察不同诱导条件下骨骼肌卫星细胞的成肌、成脂、成骨的分化特性.结果:骨骼肌卫星细胞可传50代以上,第7代时,倍增时间约为60 h,80.7%的细胞处于G1期,在特定诱导作用下骨骼肌卫星细胞可以向成肌、成脂、成骨方向分化,显示了骨骼肌卫星细胞的多向分化潜能,成功建立了骨骼肌卫星细胞的细胞系.结论:建立了SD大鼠骨骼肌卫星细胞系,为组织工程学提供种子细胞.     

大鼠乳鼠肌源性干细胞体外诱导分化为神经样细胞

目的:探讨神经生长因子(NGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠乳鼠肌源性干细胞(MDSCs)分化为神经样细胞的可行性.方法:取SD大鼠乳鼠骨骼肌,差速贴壁至第5代时培养液中加入诱导培养基培养,行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析.结果:分化后细胞NSE染色阳性,RT-PCR结果显示,诱导后MDSCs样品中检测到NSE、GFAP特异性条带.结论:在一定条件下NGF和bFGF联合诱导法可以诱导MDSCs分化为神经样细胞.     

骨髓间质干细胞诱导为肌样细胞分化相关基因的表达

目的：研究骨髓间质干细胞向肌样细胞分化前后骨骼肌特异性基因的表达。方法:体外分离成年SD大鼠骨髓干细胞，培养增殖，用5-氮杂胞苷诱导分化，RT-PCR检测分化前和分化后1 d、2 d、5 d和7 d骨骼肌特异性转录因子生肌决定因子MyoD、肌细胞生成素myogenin、MRF4以及肌肉特异性肌酸磷酸激酶MCK的表达 。结果:MyoD在诱导前后均有表达，在诱导后1 d表达显著上调（P＜0.05）；myogenin、MRF4和MCK在诱导前无表达，诱导后2 d开始出现myogenin和MRF4的表达，诱导后7 d开始出现MCK的表达。结论：骨髓间质干细胞能表达一定水平的骨骼肌细胞的分化调控基因MyoD，它向肌样细胞的分化可能与MyoD、myogenin和MRF4有关。     

二甲基亚砜体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的 探索二甲基亚砜（DMSO）体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的方法。方法 取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用终浓度为1.0%的DMSO定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共聚焦显微镜技术检测结蛋白（desmin）,α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、心肌特异性肌钙蛋白（C-TnT）的表达,透射电镜观察超微结构。结果 MSCs经体外诱导后分化的细胞均阳性表达desmin、α-sarcomeric actin、C-TnT。透射电镜下可见到平行排列的肌丝和丰富的粗面内质网。结论 大鼠骨髓间充质干细胞体外在DMSO诱导下可以定向分化为心肌样细胞。     

人外周血来源内皮祖细胞诱导分化为心肌样细胞的实验研究及机制探讨

目的： 研究人外周血来源内皮祖细胞（EPCs）在体外定向分化为心肌样细胞的能力及其可能机制。方法： 分离培养及鉴定健康人群（对照组）及冠心病（CAD）患者（实验组）EPCs。将对照组及实验组EPCs分别分成3组在体外进行分化诱导实验：A组 EPCs与乳鼠心肌共培养；B组 EPCs与多聚甲醛固定后的乳鼠心肌共培养；C组 于EPCs中加入收集到的乳鼠心肌培养液上清诱导培养。观察心肌样细胞形态变化;2周后免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白 （cTnT）和结蛋白（desmin）的表达；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌相关基因ANP、cTnT、cTnI和主要组织相容性复合物α链（αMHC）的表达；流式细胞仪检测HLA-DR和人desmin的表达，计数desmin阳性表达细胞。结果： 实验及对照A、B组EPCs均可呈现心肌样细胞形态;ANP、cTnT、cTnI和αMHC基因及cTnT和desmin蛋白均呈阳性表达；流式检测HLA-DR及desmin呈双阳性表达，对照A组分化率为（9±2）％，实验A组分化率约为（4±1）％，差异显著（P<0.01）。实验及对照C组EPCs形态未发生变化，各项检测指标均为阴性表达。结论： 与乳鼠心肌共培养可诱导人外周血来源EPCs分化为心肌样细胞，且其可能机制为细胞间的直接接触。     

成熟心肌细胞诱导胚胎干细胞定向分化为心肌样细胞

目的： 拟证实成熟心肌细胞对胚胎干细胞（ESCs）定向分化的诱导作用。方法：分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,以DAPI（4’6-联眯-2-苯基吲哚）染核作为细胞标记。取昆明小鼠3.5-4 d的囊胚培养后分离出ESCs,以1和（或）2代的小鼠ESCs细胞团与心肌细胞共培养。录像动态观察ESCs向心肌细胞分化的情况;分别于共培养后3、7、14 d对ESCs行肌钙蛋白T（cTnT）免疫荧光染色检测。结果：1代或2代的ESCs和/或细胞团与心肌细胞共培养约7 d左右出现成节律搏动的心肌样细胞;最好实验批次,可计数到1/4以上的ESCs和/或ESCs细胞团出现节律性搏动。心肌细胞共培养体系中添加0.6% DMSO时,节律搏动的心肌样细胞分化率未见提高。心肌细胞诱导组,记录已搏动和未搏动ESCs诱导分化后心肌样细胞cTnT蛋白荧光染色阳性;ESCs与心肌成纤维细胞共培养诱导组,分化的细胞cTnT蛋白荧光染阴性;0.6% DMSO诱导组约3％的细胞cTnT蛋白荧光染色阳性;DMSO联合心肌细胞诱导组,结果与单纯心肌细胞诱导组相似。结论：未经建系操作的ESCs可直接诱导分化为节律搏动的心肌细胞;成熟心肌细胞与ESCs共培养状态下,成熟心肌细胞是ESCs定向分化较强的诱导因素。     

大鼠自体骨骼肌卫星细胞向心肌梗死区移植后血液流变特性的改变

目的 了解大鼠自体骨骼肌卫星细胞（SC）梗死心肌移植后血液流变特性的改变及临床意义。方法 45只Wistar大鼠随机分为假手术组（n=15）、对照组（n=15）及移植组（n=15），对照组及移植组大鼠经结扎冠状动脉前降支建立MI模型；假手术组除不结扎左前降支外，其余操作同对照组和移植组。将体外培养2周的大鼠自体SC以注射的方式移植到移植组大鼠梗死区周围，4周后测定大鼠血清VEGF浓度（酶联免疫吸附法）、血液流变学参数的改变以及大鼠缺血心肌中VEGFmRNA（RTPCR法）、VEGF蛋白（免疫组化法）的表达情况，同时病理检测移植细胞在梗死区的生长、增殖情况并探讨它们相互的关系。结果 SC在梗死区中可增殖分化为横纹肌纤维。移植组大鼠血清VEGF浓度及缺血心肌中VEGF mRNA、VEGF蛋白质的表达较之假手术组、对照组明显升高（P〈0．05或0．01或0．001），而某些血液流变学参数明显改善（P〈0．05或0．01）。结论 SC在心肌梗死区中可增殖分化为横纹肌样细胞。并通过自分泌和旁分泌的形式增加VEGF的表达进而提高血清VEGF浓度，由此改善血液流变学参数。     

心肌细胞损伤条件诱导液诱导人骨髓间充质干细胞的分化

目的明确SD乳鼠心肌细胞（CMs）氧化损伤性条件诱导液是否可诱导人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向心肌样细胞分化。方法体外原代分离培养hMSCs及SD乳鼠原代CMs。搏动的CMs用过氧化氢进行损伤，将培养氧化损伤CMs的培养基制备成条件诱导液，对传代hMSCs培养诱导4周。倒置显微镜观察细胞形态，并进行CMs特异性标志物肌钙蛋白I（cTnI）及结蛋白的免疫细胞化学染色检测。结果hMSCs经CMs氧化损伤性条件诱导液诱导培养后，其形态变为宽大，诱导后细胞表达cTnI及结蛋白。结论CMs氧化损伤性条件诱导液能诱导hMSCs向心肌样细胞分化。     

心肌梗死大鼠血清促进大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用

 目的: 探讨急性心肌梗死（AMI）大鼠血清在体外对大鼠骨髓间质干细胞（BMSC）分化为心肌细胞的作用。方法: 将大鼠BMSC分为6组进行细胞培养：Ⅰ组为未诱导组(对照组),Ⅱ组为5-aza诱导组,Ⅲ组为5-aza＋AMI血清诱导组,Ⅳ组为5-aza＋正常大鼠血清诱导组,Ⅴ组为AMI血清诱导组,Ⅵ组为正常大鼠血清诱导组。培养30 d后进行分化细胞鉴定，检测细胞的形态变化和心肌肌钙蛋白（cTnT）、心肌细胞转录因子GATA-4和结蛋白（desmin）的表达。结果: 大鼠BMSC经5-aza或5-aza联合血清诱导后，向心肌样细胞分化，其cTnT、GATA-4、desmin表达阳性。对照组和单纯血清诱导组的BMSC未见形态改变，其cTnT亦为阴性，但GATA-4、desmin却呈弱阳性。另外，5-aza联合血清诱导组在诱导2周后可观察到部分细胞呈缓慢而有节律的跳动，而单纯5-aza诱导组未见细胞跳动。结论: 单纯用AMI大鼠血清不能诱导BMSC向心肌细胞分化，但AMI血清能促进5－aza诱导的BMSC向心肌细胞分化，并促进分化的心肌细胞成熟。     

体外心肌梗死微环境下大鼠骨髓间充质干细胞向内皮样细胞的分化

背景：间充质干细胞来源于中胚层,具有多向分化的能力。有研究显示骨髓间充质干细胞有向内皮细胞分化的能力,从而有助于心肌梗死后心脏新生血管的形成和心肌修复。 目的：观察骨髓间充质干细胞体外成内皮样细胞分化的特点,以及体外模拟心肌梗死微环境对骨髓间充质干细胞向内皮样细胞分化的影响。 方法：骨髓取自SD大鼠股骨和胫骨,骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增,对其形态学、增殖能力及多向分化能力进行鉴定;建立大鼠心肌梗死模型,制备8 h、3 d、1周、2周、4周梗死后不同时间点心肌组织的匀浆,分别加入到由血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子β、胰岛素样生长因子1组成的内皮细胞诱导体系中,共同诱导2周后,观察不同时间的心肌组织匀浆对骨髓间充质干细胞增殖和成内皮分化的影响,检测vWF特异性抗原及表达的阳性率。 结果与结论：通过对培养细胞的形态学及功能鉴定,证明其为骨髓间充质干细胞,并具有成骨、成脂肪细胞、成内皮样细胞分化的能力。加入生长因子诱导体系诱导后的细胞部分表达vWF,梗死心肌匀浆与生长因子共同作用,能促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,vWF阳性率提高(P < 0.05)。RT-PCR显示加入梗死1周心肌组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞其vWF阳性表达率最高。提示骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化能力的有别于造血干细胞的另一种骨髓干细胞。骨髓间充质干细胞具有向内皮分化的能力,且加入梗死心肌组织匀浆的诱导体系在体外可促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化。应用骨髓间充质干细胞治疗的最佳时机在1周为宜。     

骨形态发生蛋白2体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：目前研究者尝试使用各种细胞因子、中药单体和组织裂解液等诱导剂作用于其分化过程,用以修复梗死的心肌组织。 目的：探索骨形态发生蛋白2在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中的作用。 方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。应用含有骨形态发生蛋白2的培养基定向诱导培养(对照组为普通培养基培养) 72 h,其后换用普通培养基继续培养4周。 结果与结论：初分离的细胞经纯化培养后,显示CD29阳性、CD34阴性,符合骨髓间充质干细胞的特征,生长曲线显示各代细胞生长规律相近。经骨形态发生蛋白2体外诱导培养后,细胞形态狭长,排列紧密、方向一致。分化后的细胞均阳性表达C-TnI、C-TnT 、desmin、α-sarcomeric actin和P38MAPK。空白对照组则基本不表达以上蛋白。提示骨形态发生蛋白2可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌样细胞,是骨髓间充质干细胞体外心肌分化的一种新的有效诱导剂。     

CD34在体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞发育的免疫组织化学研究

目的 观察CD34在发育中的体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞中的分布，探讨CD34在发育中的大鼠骨骼肌卫星细胞中的作用。方法 原代培养骨骼肌卫星细胞，第1次传代后，取贴壁2、4、8、16、24、48和72h的细胞行CD34多克隆抗体的免疫组织化学染色。结果 CD34免疫阳性反应存在于发育中的骨骼肌卫星细胞中，但在形成肌管后，细胞核免疫反应转为阴性，同时成纤维细胞呈弱阳性反应。结论 CD34在发育中的骨骼肌卫星细胞中有一定量的分布，它可能在骨骼肌的生理发育中起某种调节作用。     

大鼠骨骼肌植块诱导脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞的分化

目的:分离大鼠胚胎的脊髓神经于细胞进行体外培养,探讨骨骼肌植块诱导其向运动神经元样细胞分化.方法:应用无血清培养技术分离培养脊髓神经干细胞,通过5-溴-2-脱氧尿苷标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况;通过与骨骼肌植块共培养观察神经干细胞向运动神经无样细胞的分化情况.结果:大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;诱导分化后结果显示.骨骼肌植块组有7.87%的细胞呈胆碱乙酰基转移酶阳性.与10%胎牛血清组(0.94%)比较具有统计学意义.结论:从大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,骨骼肌植块可诱导脊髓神经干细胞分化为运动神经元样细胞.     

胚胎干细胞来源的巢蛋白阳性细胞向胰岛素分泌细胞分化的实验研究

目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导，为糖尿病患者实施细胞移植治疗建立基础。方法将胚胎干细胞（ESC）在成纤维细胞（MEF）饲养层上扩增后脱离饲养层，让ESC自发分化成拟胚体（EB），再将EB诱导为巢蛋白（nestin）阳性的神经前体细胞（NPC），最后将NPC诱导成胰岛素分泌细胞（IPC）。结果ESC在MEF饲养层上扩增4d后，在悬浮培养状态下自发分化为EB。将EB在NPC选择性培养基中做贴壁培养后，ESC先分化为上皮样细胞，再分化为神经细胞样细胞。经过nestin免疫组化检测，在经过NPC培养基诱导4d的细胞，nestin阳性细胞占86．5％。nestin阳性细胞在IPC选择性培养基中诱导5～6d后，可分化成胰岛素分泌细胞。结论ESC来源的nestin阳性细胞既可以分化为NPC，也可以分化为IPC。     

5-氮杂胞苷诱导骨髓源性心肌干细胞向心肌分化过程中心肌肌钙蛋白T的表达变化

目的研究5-氮杂胞苷诱导骨髓源性心肌干细胞(MCSC)向心肌分化过程中,心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达变化和超微结构。方法从SD大鼠骨髓间充质干细胞(MMSC)中筛选MCSC,用5-氮杂胞苷诱导向心肌定向分化。取分化后不同时间的细胞作cTnT免疫细胞化学染色,并对结果进行图像分析。透射电镜下观察分化细胞的超微结构。取不同发育期和成熟期的SD大鼠心肌作对比研究。结果用5-氮杂胞苷诱导后2周,细胞内开始表达cTnT;诱导后3周,cTnT表达增强,可见横纹样结构;诱导后4周,cTnT表达明显增强,横纹增多,但排列不规则。诱导后4周的细胞内出现心房粒,可见丰富的粗面内质网和糖原。胚胎11d大鼠的心肌内,横纹样结构较少且排列不规则。新生大鼠心肌内横纹增多,排列较规则。1月龄和3月龄心肌的横纹样结构发达,排列规则。诱导分化后4周的细胞cTnT表达特征与胚胎11d的心肌相似。结论MCSC经5-氮杂胞苷诱导后可分化为心肌细胞,表现为未成熟心肌的结构和功能特征。     

电穿孔转染酸性成纤维细胞生长因子基因对骨骼肌卫星细胞的影响

背景：课题组早期研究表明体外一定剂量酸性成纤维细胞生长因子对骨骼肌卫星细胞增殖有促进作用。 目的：进一步验证电穿孔转染酸性成纤维细胞生长因子基因对骨骼肌卫星细胞生长、增殖及分化的影响。 方法：原代培养、纯化骨骼肌卫星细胞,将带有酸性成纤维细胞生长因子基因的质粒pSectag-GFP-aFGF通过电转染的方法转染大鼠骨骼肌卫星细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况并计算转染率,以流式细胞仪分析转染后细胞周期,绘制细胞生长曲线,观察转染后肌管形成情况,Western Bloting检测酸性成纤维细胞生长因子基因的表达。 结果与结论：①免疫细胞化学检测：骨骼肌肌动蛋白呈阳性表达。②转染效率：pSectag-aFGF质粒电转染12 h后即可看见散在发绿色荧光的卫星细胞,72-96 h达高峰,阳性表达率约90%。③细胞周期检测：电转染后S期所占的百分比明显多于未转染对照组(P < 0.05)。④细胞生长曲线检测：电转染细胞接种后第3天进入对数生长期,第5天后开始减少。⑤分化能力观察：电转染组肌管较未转染对照组明显减少,老化细胞较少。⑥Western-blot：酸性成纤维细胞生长因子基因在转染骨骼肌卫星细胞中表达。结果表明,通过电穿孔法可以将酸性成纤维细胞生长因子基因转染进骨骼肌卫星细胞并获得高效持久的表达,并有促进骨骼肌卫星细胞增殖及抑制分化为肌管的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肾系膜细胞样细胞

目的证实体外诱导骨髓间充质干细胞向系膜细胞分化的潜能,探讨其诱导分化的机制。方法将SD大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养增殖后,用血小板源生长因子（PDGF-BB）进行诱导,7d后检测形态学、系膜细胞标志物及功能学变化。在诱导分化体系中加入ERK阻断剂,检测细胞生长及系膜细胞标志物的表达。结果经PDGF-BB诱导培养7d,细胞逐渐分化为多角形的系膜细胞样细胞,其系膜细胞标志物α-actin及Desmin免疫荧光染色呈阳性,PDGF受体mRNA表达水平显著上调,且对血管紧张素Ⅱ的刺激产生细胞收缩反应。加入ERK阻断剂的抑制分化组细胞,阻断了其系膜细胞标志物mRNA的上调表达。结论在PDGF-BB的诱导作用下,骨髓间充质干细胞分化为系膜细胞样细胞,MAPK/ERK1/2信号途径在此诱导分化机制中发挥了重要作用。     

细胞接触诱导骨髓间充质干细胞获得心肌分化表型的研究

目的观察不同浓度条件下，细胞接触对骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为心肌细胞（CM）的诱导作用。方法利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因大鼠的BMSCs与CM以不同比例（1：1、1：10、1：20、1：40）共培养1周，分别采用免疫荧光染色及流式细胞计数分析检测肌钙蛋白I（cTnI）、α—sarcomeric actinin和MEF-2C等心肌特异性蛋白，采用膜片钳技术检测分化细胞的电生理功能。结果在共培养条件下，部分GFP—BMSCs可表达一系列心肌表面标记物，如心肌特异性cTnI蛋白等，且获得心肌分化表型的数量随着CM数量的增加而增加。部分GFP—BMSCs与CM一起同步搏动，并可获得与CM相似的膜电位。结论细胞接触可诱导BMSCs获得有功能的心肌分化表型，其数量与心肌的数量不同浓度有相对的依赖性，随着心肌数量的增加而增加。     

不同培养代数大鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞转分化能力的比较

为确定诱导大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)向神经元样细胞转分化的适宜培养代数,本研究比较了不同培养代数的BMSCs的转分化潜能。首先体外培养大鼠BMSCs并传代,于不同的培养代数利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、全反式维甲酸(RA)、音猬因子(Shh)诱导分化,随后运用免疫荧光法和免疫印迹法检测诱导细胞中的神经元样细胞。结果显示骨髓基质细胞体外培养1至3代时能够被诱导分化为神经元样细胞,培养至第7代时丧失转分化为神经元样细胞的潜能。上述结果提示:传代次数增多将引起BMSCs自发分化,使其向神经元样细胞转分化的能力下降,因而BMSCs培养至第3代时适宜进行诱导分化。     

大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞Cx43通讯连接功能检测

目的： 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化为心肌样细胞Cx43的分布与通讯连接功能状态。方法： 取健康SD大鼠骨髓，用5-氮杂胞苷体外诱导培养。取诱导培养2、3、4周的MSCs为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，另取急性分离的心肌细胞为对照组，用激光共聚焦技术检测Cx43的分布及平均荧光漂白恢复率。结果： 对Cx43在细胞内分布检测发现，随诱导培养时间的延长，细胞内蛋白颗粒密度逐渐增加；诱导培养4周后MSCs内蛋白颗粒密度与对照组比较无显著差异（63.87±12.43，64.87±12.15，P>0.05）。各组细胞平均荧光漂白率的变化趋势与Cx43分布变化相似，即随诱导培养时间的延长，细胞平均荧光漂白率逐渐增加；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及对照组分别为19.59%±6.08%、37.17%±3.84%、46.82%±2.69%、49.71%±5.53%，Ⅲ组与对照组比较无显著差异（P>0.05）。结论： 大鼠MSCs在体外诱导培养4周后已分化为心肌样细胞，其细胞Cx43的分布与通讯连接功能与正常心肌细胞相似。