HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid原核表达载体构建及其基因工程菌种稳定性的鉴定

目的 构建HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid的原核表达载体并鉴定其基因工程菌种稳定性.方法 应用PCR技术以pCMV-e23sFv-Fdt-tBid为模板扩增e23sFv-Fdt-tBid片段,并将其克隆人pET-22b原核表达载体;将该表达载体转化BL21大肠杆菌并挑取表达蛋白较高的克隆菌,划线接种传代50次;通过革兰氏染色方法、扫描电镜形态观察、菌种质粒酶切鉴定及蛋白诱导表达的Western blot分析鉴定e23sFv-Fdt-tBid免疫促凋亡蛋白表达工程菌的稳定性.结果 成功构建pET-22b-e23sFv-Fdt-tBid原核表达载体,并在BL21大肠杆菌中诱导表达;革兰氏染色方法、扫描电镜形态观察、菌种质粒酶切鉴定及Western blot法鉴定结果表明基因工程菌种稳定性良好,可以稳定表达免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid.结论 成功构建了HER2靶向免疫促凋亡蛋白原核表达载体,鉴定了表达该免疫促凋亡蛋白的基因工程菌种稳定性,为HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid的应用研究奠定了基础.     

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的：构建CD80/IgG真核表达载体，使其在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中呈分泌型表达，为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法： 采用多聚酶链反应（PCR）技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA（cDNA） 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中，获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG；采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株；免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果： DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点，CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达，其分子量大小和预期的基本一致，该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论： 成功构建pcDNA／CD80-IgG真核表达载体，并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。     

人IL-18结合蛋白A在CHO细胞中表达的研究

目的 克隆人IL－18结合蛋白A（hIL-18BPa)的cDNA，构建真核表达载体及其在CHO细胞中的表达。方法 采用RT－PCR，自人白血病血细胞株Jurkat中获得hIL-18BPa的cDNA。将其克隆至T-vector中，经测序确证后，将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3．1中。以脂质体介导法，将其转染CHO细胞，用G418筛选抗性克隆，ELISA法测定其生物学活性。结果 获得的IL-18BPa的cDNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hIL-18BPa插入载体pcDNA3．1后，成功地构建稳定表达的载体。转染CHO细胞2后，获得可稳定表达hIL-18BPa的基因工程细胞株。经纯化后，证明具有良好的生物学活性。结论 成功地克隆hIL-18BPa基因，并实现了在CHO细胞中的稳定表达，为研究其生物学活性奠定了基础。     

hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达

目的:构建人类促甲状腺激素受体(hTSHR)胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf(aa29 ～100)、 hTSHRe(aa101～278)的真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe, 并在CHO细胞中进行表达.方法:RT-PCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5-His-TOPO中, 经酶切、 PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达, RT-PCR扩增转染细胞的cDNA、 Western blot分别鉴定hTSHR在CHO细胞中mRNA和蛋白水平的表达.结果:RT-PCR分别扩增两个片段的阳性克隆株, 所得片段大小与预期一致, 经Western blot鉴定, 相对分子质量(Mr)分别为11900、 23600左右, 与预期的大小相符.结论:真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe构建成功, RT-PCR和Western blot检测证实重组质粒能在CHO细胞中高效表达, 为进一步研究pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe在体内的基因表达, 建立Graves'病的动物模型奠定了基础.     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的克隆人Flt3配体（Flt3 LIg and，FL），并在CHO细胞中进行表达。方法从健康人外周血中提取总RNA，通过RT-PCR技术，扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段，经DNA测序证实后，将得到的片段基因插入pcDNA3．0表达载体，构建了pcDNA3．0-FL真核表达载体；将重组质粒pcDNA3．0-FL转染CHO细胞．经G418筛选出阳性细胞克隆，扩大培养，提取细胞总蛋白，用SDS—PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24000处有一显色条带。结果FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3．0中并在CHO细胞中成功表达。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．0-FL并在CHO细胞中成功表达，为FL的相关研究和应用开发奠定了基础。     

人衰变加速因子DAF基因真核表达系统的构建

目的：构建含人补体调节蛋白衰变加速因子DAF分子的cDNA编码区的真核重组表达载体pcDNA3-DAF,转染NIH3T3细胞,建立稳定表达人DAF的NIH3T3细胞模型。方法：将人DAF分子的cDNA编码区克隆到真核表达载体pcDNA3,经酶切和测序鉴定后用磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NIH3T3细胞株。用PCR检测人DAF基因在NIH3T3细胞基因组中的整合;用RT-PCR、Westernblot实验和间接免疫荧光技术分别从RNA水平和蛋白质水平检测人补体调节蛋白分子DAF在细胞株中的表达。结果：成功构建了pcDNA3-DAF重组真核表达载体,并建立了稳定转染的NIH3T3细胞株,成功地表达了目的基因。PCR检测连续传代30次的NIH3T3pcDNA3-DAF细胞,结果显示人DAF基因仍稳定整合在异源细胞的染色体上,并未随着传代而丢失,为稳定的转染细胞株。结论：真核表达载体构建和稳定转染NIH3T3细胞株的建立为进一步研究人DAF功能和多种补体调节蛋白的协同作用奠定基础。     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

目的 建立稳定表达CD40－Ig融合蛋白的工程细胞株,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40：CD40L途径防治移植物抗宿主病（GVHD）策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG／40Ig中切下CD40－Fc融合基因,插入pcDNA3．1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo-fectamine将该载体转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆;夹心ELISA法检测上清中CD40－Ig融合蛋白的表达;Westem blot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞,ProteinA亲和层析法纯化,SDS－PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40－Fc融合基因插入pcDNA3．1载体后构建成功稳定表达载体p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化融合蛋白纯度达95％以上,该融合蛋白可特异结合Jukat细胞表面的CD40L。结论 CD40－Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合,为研究靶向CD40：CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。     

mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.     

免疫促凋亡蛋白Immuno-caspase-6可选择性杀伤HER2阳性SGC-7901胃癌细胞

目的构建融合白喉毒素转位序列的免疫促凋亡蛋白Immuno-caspase-6的真核表达载体,真核表达纯化该重组蛋白后验证其对人表皮生长因子受体2(HER2)阳性细胞的选择性杀伤活性。方法把Kozak序列与单链抗体e23sfv、白喉毒素的促转位片段白喉毒素弗林蛋白酶识别位点(fdt)、caspase-6以及免疫球蛋白Ig G Fc段基因重组,克隆入真核表达载体pc DNA3.1(+)中,命名为pc DNA3.1(+)-AFC。瞬时转染CHO-S细胞,Western blot法检测上清中目的蛋白的表达;收集培养上清并利用蛋白A纯化柱对目的蛋白进行纯化;流式细胞术验证目的蛋白对HER2阳性SGC-7901细胞的杀伤作用。结果成功构建pc DNA3.1(+)-AFR真核表达载体;瞬时转染悬浮CHO-S细胞后,Western blot法证实目的蛋白可分泌性表达于细胞培养上清中,流式细胞术结果显示纯化后的目的蛋白可以显著促进HER2阳性SGC-7901细胞凋亡。结论真核细胞表达的免疫促凋亡蛋白Immuno-caspase-6可选择性高效杀伤HER2阳性SGC-7901细胞。     

ImmunoAIF△1-480融合蛋白对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用

目的:观察免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1-480对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用.方法:利用PCR的方法将九聚精氨酸编码序列(R9)与AIF C-末端结构域编码区重组, 然后将R9-AIF△1-480基因与pCMV-e23sFv载体重组, 构建免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1-480真核表达载体.用脂质体法转染CHO细胞, 经G418筛选, 建立稳定转染的细胞株, 通过RT-PCR、Western blot、流式细胞术(FCM)等方法检测重组基因在转染细胞中的表达及其对HER2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤活性.结果:经过酶切鉴定与测序证实, 带有ImmunoAIF△1-480基因的真核表达载体构建成功, 经RT-PCR、Western blot可检测到培养上清中免疫促凋亡基因的表达, 用FCM检测发现融合蛋白ImmunoAIF△1-480对HER2阳性肿瘤细胞SGC-7901和SKBR-3有明显的促凋亡活性, 而对不表达HER2分子的ECV-304细胞几乎没有影响.结论:ImmunoAIF△1-480可以特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞.     

用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究

目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆。检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+。将表达质粒pA FRTHFLF和pOG44以1∶9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+。转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测。筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆。在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其最后的表达量为5mg/L。对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Westernblot和抗原结合活性的检测。结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L。结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础     

稳定表达GHR基因和突变体的CHO细胞株的构建及其功能分析

目的构建稳定表达先天性生长激素不敏感综合征相关基因-hGHR及突变体(hGHR-E42K、hGHR-H56R)的CHO细胞株,测定野生株和突变株的STAT5-磷酸化水平。方法利用已有的PUC-hGHR质粒,定点突变获得2个hGHR突变体(hGHR-E42K、hGHR-H56R),限制性酶切法将目的基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1/(zeo+);然后用Lipofectamine2000将重组子转染至CHO细胞,通过Zeocin抗性筛选稳定表达hGHR及突变体的细胞群;并用RT-PCR和Western blot证实hGHR、STAT5-P表达水平。结果测序验证hGHR的E42K和H56R错义突变成功引入,并克隆到真核表达载体;转染后在CHO细胞株中成功检测到hGHR和突变体的mRNA和蛋白;突变细胞株(E42K、H56R)的磷酸化STAT5蛋白表达量低于野生株。结论成功构建携带稳定表达hGHR及突变体的CHO细胞株,E42K、H56R突变部分阻碍STAT5蛋白进行磷酸化。     

人Epsilon干扰素在CHO细胞中的表达及生物学活性的研究

目的 为了研究新发现的人epsilon干扰素（hIFN-ε）的生物学活性，我们通过RT-PCR克隆了hIFN-ε基因，并构建pcDNA3．1／myc-his（-）A-hIFN-ε（以下简称pcDNA3-1A-hIFN-ε）的真核表达载体，在CHO细胞中表达，并研究真核细胞重组表达的rhIFN-ε的生物学活性。方法 用TNF-α刺激人宫颈癌HeLa细胞，抽提总RNA，经RT-PCR获得全长cDNA，与pcDNA3．1／myc-his（-）A真核表达载体连接，构建重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε并在CHO细胞中进行表达，采用微量细胞病变抑制试验研究表达产物中的rhIFN-ε对多种病毒的抗病毒活性；MTT法检测其对A375、HeLa和A549细胞的生长影响，并通过在Wish、HeLa、A375细胞中诱导MxA抗病毒蛋白的产生研究hIFN-ε的抗病毒机制。结果 经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序，结果表明已经成功构建了重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε，并在CHO细胞中稳定表达了rhIFN-ε蛋白，该蛋白具有抗HSV-I、PolioV、Ad3和VSV病毒的作用，能够抑制HeLa、A375、A549细胞的生长，刺激Wish、HeLa、A375细胞产生MxA蛋白。结论 本研究成功地构建了pcDNA3．1A-hIFN-ε真核表达载体并在CHO细胞中获得稳定表达，证明了ddFN．￡蛋白具有抗病毒和抗增殖活性，其抗病毒效应的分子机理可能与诱导细胞产生MxA抗病毒蛋白有关，为今后研究rhIFN-ε的生物学功能和基因重组药物研制及其开展基因治疗奠定了基础。     

HBV基因组各基因真核表达载体的构建及转染

目的 构建HBV基因组各基因真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系.方法 采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBV基因的各基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用细胞流式技术及细胞免疫组化技术检测HBV各基因产物在细胞内的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/HBs、pcDNA3.1( )/HBc、pcDNA3.1( )/HBe、pcDNA3.1( )/HBp、pcDNA3.1( )/HB-preS1、pcDNA3.1( )/HB-preS2、pcDNA3.1( )/HBx真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究各基因的功能奠定良好的实验基础.     

重组人平足蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞的稳定表达

目的构建平足蛋白(PDPN)真核表达质粒PDPN-pEGFP-N1,建立稳定高表达重组人PDPN的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对其进行生物学活性研究。方法通过反转录PCR和DNA重组技术从HEK293细胞中克隆PDPN cDNA,插入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的真核表达载体pEGFP-N1中。通过PCR、酶切及测序等方法鉴定重组载体;进而将该重组载体转染至CHO细胞中,通过荧光显微镜检测EGFP的表达,Western blot法检测PDPN在CHO细胞中的表达,流式细胞术分选高表达PDPN的CHO细胞,运用血小板聚集实验检测分选后细胞株的生物学活性。结果 DNA测序和酶切鉴定证明PDPN基因正确克隆至pEGFP-N1载体中,重组载体稳定转染CHO细胞后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,流式细胞术分选后的细胞高表达PDPN;Western blot结果显示转染后CHO细胞膜表面表达PDPN蛋白;过表达PDPN的CHO细胞可以诱导人血小板聚集。结论成功构建了稳定高表达PDPN蛋白的CHO细胞株,该细胞株可表达PDPN,并诱导血小板聚集。     

重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选

目的:构建人表皮生长因子受体(HER2)胞外区(1 896 bp)基因的真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-HER2),转染小鼠乳腺癌细胞(EMT6),获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2).方法:用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1-HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列;经酶切、连接构建pcDNA6/v5-his-HER2;转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,对其进行酶切及测序鉴定;以PEI法将pcDNA6/v5-his-HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周,获得抗性克隆EMT6/HER2;用RT-PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA,免疫组化法检测其HER2蛋白的表达.结果:PCR产物与预期片段大小一致;pcDNA6/v5-his-HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后,可见与PCR产物大小相同的片段;DNA测序结果显示,pcDNA6/v5-his-HER2 中HER2 基因序列无误,读码框正确;用RT-PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA,免疫组化法证实,EMT6/HER2中有HER2的阳性信号.结论:成功地构建了HER2胞外区真核表达载体,获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株,为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础.     

免疫凋亡素e23sFv-Fdt-RC6对HER2阳性胶质瘤细胞U251的杀伤作用

目的:探讨靶向活性caspase-6融合蛋白对HER2阳性胶质瘤细胞系U251的促凋亡作用.方法:利用白喉毒素furin酶识别序列(Fdt)连接抗HER2单链抗体基因e23sFv和重构型caspase-6(RC6)基因,连接入pCMV载体,构建重组基因的真核表达载体pCMV-e23sFv-Fdt-RC6.脂质体转染HER2阳性胶质瘤U251细胞系,Western blot检测目的蛋白的表达.流式细胞术(FCM)检测转染后U251细胞的凋亡率,MTT法检测目的基因转染后对U251细胞增殖的影响.结果:双酶切及基因测序证实,pCMV-e23sFv-Fdt-RC6载体被成功构建.Western blot检测到转染表达载体48 h后的U251细胞中有活性caspase-6的表达.FCM检测到实验组细胞凋亡率比对照组显著增高.MTT实验观察到转染载体pCMV-e23sFv-Fdt-Rc6的U251细胞的增殖被明显抑制.结论:e23sFv-Fdt-RC6融合蛋白对HER2阳性胶质瘤细胞系U251有明显的促凋亡作用.     

人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体的构建和表达

目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSeetag2/seFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达.方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体psectag2,构建重组载体pSectag2/scFv,测序鉴定后,电转染CHO细胞,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达情况.结果:将750 bp人源肝癌scFv插入真核表达载体pSectag2,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag2/scFv.将pSectag2/scFv转染CHO细胞后获得目的蛋白表达.SDS-PAGE和Western blot检测表明目的蛋白Mr约为34 000.结论:成功地构建抗scFv真核表达载体pSectag2/scFv,并在CHO细胞中获得表达,为人源肝癌scFv的进一步的应用研究提供依据.     

线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体.方法 通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增获得线粒体抗病毒信号蛋白基因的完整序列,进而纯化回收后连接到pMDTM 18-T载体上,将pcDNA6/myc-HisA载体和带有目的片段的pMDTM 18-T载体同时进行双酶切,酶切产物过夜连接转化至大肠杆菌JM109,挑取阳性克隆pcDNA6/myc-HisA-MA VS扩增后,提取重组质粒;利用PCR和核酸测序验证线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体构建的正确性;应用Western blotting的方法检测融合蛋白的表达.结果 线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体构建成功,并且该载体能够在OL细胞中表达融合蛋白.结论 成功构建线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体,为进一步研究该蛋白的功能和作用机制奠定基础.