微小RNA-221作用蓬乱蛋白2影响前列腺癌细胞系的侵袭功能研究

目的:探讨微小RNA-221(microRNA-221,miR-221)在前列腺癌细胞系中的表达,对神经内分泌样(NE)转化及其侵袭功能的影响.方法:以Northern blot检测雄激素依赖性前列腺癌(LNCaP) 细胞系,雄激素非依赖性前列腺癌(LNCaP-AI) 细胞系中miRNA的表达;细胞转染法检测在雄激素剥夺环境中LNCaP和LNCaP-AI细胞系中miR-221的作用;细胞增殖检测法检测细胞在不同阶段的生长增殖水平;Transwell法检测转染细胞的侵袭能力;定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测转染细胞中神经元特异性烯醇化酶及蓬乱蛋白2 (DVL2)表达的变化.结果:与LNCaP相比,miR-221在 LNCaP-AI中明显高表达.通过转染使miR-221在LNCaP中高表达可促进细胞的神经元特异性烯醇酶的表达,加速NE转化.而在LNCaP-AI中下调miR-221水平可增强靶基因DVL2的表达,并增强LNCaP-AI的迁移和侵袭能力(P<0.01).结论:LNCaP和LNCaP-AI中miR-221表达有差异.miR-221可促进前列腺癌细胞的NE转化,可能是导致前列腺癌雄激素非依赖转化的重要原因.MiR-221可通过作用DVL2调节前列腺癌细胞的转移和侵袭.     

miR-221对于前列腺癌细胞系侵袭功能的机制研究

目的评价miR-221在前列腺癌细胞系中表达的变化对其神经内分泌样转化及其侵袭功能的影响。方法以Northern blot检测LNCaP,LNCaP-AI两种前列腺癌细胞系中7种microRNA的表达变化;细胞转染法检测在雄激素剥夺环境中LNCaP和LNCaP-AI细胞系中miR-221的作用;CCK-8法检测细胞在不同阶段的生长增殖水平;Transwell法检测转染细胞的侵袭能力;qRT-PCR和Western blot检测转染的细胞中神经元特异性烯醇化酶(NSE)及dishevelled-2(DVL2)表达的变化。结果与雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)的细胞系LNCaP相比,miR-221在雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)的细胞系LNCaP-AI中明显高表达。通过转染使miR-221在LNCaP细胞系中高表达可促进细胞的NSE表达,加速其神经内分泌样分化。而在LNCaP-AI细胞系中下调miR-221水平则会升高靶基因DVL2的表达水平,并增强LNCaP-AI细胞的迁移和侵袭能力。结论该实验证实在AIPC和ADPC细胞系中miR-221存在表达差异。miR-221可促进前列腺癌细胞的神经内分泌样转化,这可能是导致前列腺癌雄激素非依赖转化的重要原因。MiR-221可通过作用DVL2调节晚期前列腺癌细胞的转移和侵袭。     

miR-221通过作用DVL2影响前列腺癌细胞系的侵袭功能

目的 评价miR-221在前列腺癌细胞系中表达的变化对其神经内分泌样转化及其侵袭功能的影响.方法 以Northern blot检测LNCaP和LNCaP-AI两种前列腺癌细胞系中7种microRNA的表达变化;细胞转染法检测在雄激素剥夺环境中LNCaP和LNCaP-AI细胞系中miR-221的作用;CCK-8法检测细胞在不同阶段的生长增殖水平;Transwell法检测转染细胞的侵袭能力;qRT-PCR和Western blot检测转染的细胞中神经元特异性烯醇化酶(NSE)及dishevelled-2(DVL2)表达的变化.结果 与雄激素依赖性前列腺癌(AD-PC)的细胞系LNCaP相比,miR-221在雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)的细胞系LNCaP-AI中明显高表达.通过转染使miR-221在LNCaP细胞系中高表达可促进细胞的NSE表达,加速其神经内分泌样分化.而在LNCaP-AI细胞系中下调miR-221水平则会升高靶基因DVL2的表达水平,并增强LNCaP-AI细胞的迁移和侵袭能力.结论 该实验证实在AIPC和ADPC细胞系中miR-221存在表达差异.miR-221可促进前列腺癌细胞的神经内分泌样转化,这可能是导致前列腺癌雄激素非依赖转化的重要原因.MiR-221可通过作用DVL2调节晚期前列腺癌细胞的转移和侵袭.     

雄激素非依赖性前列腺癌细胞亚系模型LNCaP-AI的建立

目的:建立雄激素非依赖性前列腺癌细胞亚系模型LNCaP-AI.方法:长期在去雄激素的血清环境下培养雄激素依赖性LNCaP细胞,培养出能够适直无雄激素环境的LNCaP-AI细胞亚系.MTT、RT-PCR、免疫荧光方法观察LNCaP-AI细胞在无雄激素环境下的增殖能力和表达及分泌前列腺特异性抗原(PSA)的水平.结果:LNCaP前列腺癌细胞在无雄激素中培养3个月后逐渐适应了无雄激素的环境,成为雄激素非依赖的LNCaP-AI细胞亚系.LNCaP-AI细胞在无雄激素的环境下迅速增殖,能够分泌PSA,但其PSA mRNA的表达水平是正常生长LNCaP细胞的44%.结论:成功构建雄激素非依赖性前列腺癌细胞亚系模型LNCaP-AI,可以模拟前列腺癌由雄激素依赖发展为雄激素非依赖的过程.     

雄激素受体在前列腺癌细胞激素非依赖转化中的表达及调控

目的：研究雄激素受体(androgen receptor, AR)在激素依赖性前列腺癌（androgen dependent prostate can cer, ADPC）细胞系LNCaP转化成激素非依赖性前列腺癌(androgen independent prostate cancer, AIPC)过程中的表达变化,以及其受Wnt信号通路和蛋白酶体降解通路调控的机制。方法：应用活性炭滤过的低激素胎牛血清培养LNCaP细胞,得到雄激素非依赖的LNCaP亚系LNCaP-AI（androgen independent）细胞。应用细胞增殖试验检测LNCaP-AI的细胞生长曲线。应用Western blot、RT-PCR分析激素依赖性转化过程中的AR、前列腺特异抗原（prostate specific antigen,PSA）的表达变化。在AIPC细胞中,应用Wnt信号通路阻滞剂IWR-1及蛋白酶体通路抑制剂乳胞素（lactacystin）处理细胞,观察Wnt信号通路和蛋白酶体信号通路对AR mRNA及蛋白表达的影响。结果：在体外低激素环境中生长6个月后,LNCaP细胞变成雄激素非依赖性的LNCaP亚系LNCaP-AI。表现为对雄激素依赖性减弱,细胞增殖加快,PSA的表达增高。在转化为LNCaP-AI的过程中,AR mRNA水平短期上调,后恢复到原始水平,但蛋白水平一直处于下调趋势。 IWR-1处理的LNCaP-AI,AR mRNA及蛋白的表达下调。乳胞素处理的LNCaP-AI,AR mRNA无变化而蛋白表达上调。结论：在体外前列腺癌细胞由激素依赖性向非依赖性转化的过程中, AR mRNA表达仅有一过性增高,而蛋白表达呈现明显的下降趋势。进一步研究发现,Wnt信号通路和蛋白酶体通路可能对AR的蛋白表达有调控作用。Wnt信号通路的抑制或蛋白酶体信号通路的增强可能是AR蛋白表达下调的原因。     

microRNA-148a对前列腺癌细胞系LNCaP神经内分泌分化的影响

目的探讨microRNA(miRNA)-148a对前列腺癌细胞系LNCaP神经内分泌分化的影响。方法采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)验证miRNA-148a在雄激素依赖性与雄激素非依赖性前列腺癌细胞系中的差异表达。采用miRNA-148a及其抑制物(anti-miRNA-148a)改变LNCaP细胞中miRNA-148a的表达量,观察LNCaP细胞神经内分泌分化的差异程度,并检测神经内分泌分化标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)的差异表达。结果 LNCaP-AI细胞中的miRNA-148a相对表达量显著低于LNCaP细胞(P<0.05)。下调miRNA-148a在LNCaP细胞中的表达量,可明显促进LNCaP细胞神经内分泌分化。结论 miRNA-148a可以抑制LNCaP细胞的神经内分泌分化,可能成为前列腺癌生物治疗的新靶点。     

前列腺癌相关长链非编码RNA在前列腺癌中的表达及生物学功能

目的 探讨前列腺癌相关长链非编码RNA(prostate cancer related long non-coding RNA,PCRL)在前列腺癌中的表达情况及其潜在的生物学功能。方法 采用qRT-PCR检测PCRL在前列腺癌组织、癌旁组织及其他组织中的表达,同法检测并比较PCRL在雄激素依赖(LNCaP-AD) 与雄激素非依赖(LNCaP-AI) 前列腺癌细胞和正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)中的表达差异。以siRNA干扰PCRL后,采用qRT-PCR方法检测LNCaP-AI细胞和LNCaP-AD细胞中雄激素受体的表达变化。结果 PCRL在前列腺及前列腺癌组织中特异高表达,LNCaP-AI细胞中PCRL水平高于LNCaP-AD细胞和RWPE-1细胞。干扰PCRL后LNCaP-AI细胞和LNCaP-AD细胞中雄激素受体的表达量上升(前者P<0.000 1)。结论 在前列腺癌中特异高表达的PCRL与前列腺癌的进展有关,PCRL和雄激素受体之间可能存在一定的调控关系。     

雄激素非依赖性前列腺癌LNCaP-AI细胞亚系模型的建立

目的利用雄激素递减法建立雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)细胞亚系模型LNCaP-AI。方法利用活性炭/葡聚糖处理的血清模拟去雄激素环境培养LNCaP细胞,逐渐递减培养基中雄激素10 d,然后在无雄激素环境中继续培养6个月,培养出能够在无雄激素环境中生长的LNCaP-AI细胞亚系。采用MTT和ELISA法检测LNCaP-AI细胞在去雄激素环境下的增殖能力和前列腺特异性抗原(PSA)的水平。结果 LNCaP细胞在去雄激素环境培养初期生长缓慢,细胞形态呈神经内分泌样改变,经过6个月的连续无雄激素培养,细胞恢复以前的形态和生长。MTT检测表明LNCaP-AI细胞能够在去雄激素环境中生长,通过ELISA检测PSA的分泌提示LNCaP-AI细胞能够在去雄激素环境中恢复分泌PSA的功能。结论激素递减法成功的建立了AIPC细胞亚系模型LNCaP-AI,利用该模型能够模拟前列腺癌由雄激素依赖发展为雄激素非依赖的过程。     

染料木黄酮通过PI3K/AKT途径抑制雄激素非依赖性LNCaP细胞

目的 利用LNCaP细胞建立去势抵抗前列腺癌细胞模型,研究染料木黄酮(GEN)对去势抵抗前列腺癌细胞生长的影响及可能的机制.方法 在无激素的血清环境下长时间培养LNCaP细胞,获得稳定生长的雄激素非依赖性 LN-CaP前列腺癌细胞,并鉴定细胞.以不同浓度的 GEN(0、6. 25、12. 5、25、50、100、200 μmol/L)分别作用于雄激素依赖性LNCaP和雄激素非依赖性LNCaP细胞24、48、72 h ,利用CCK-8法检测细胞增殖活性,Western blot法检测前列腺特异性抗原(PSA)、P53抑癌基因、细胞周期蛋白(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原( PCNA)在雄激素非依赖LNCaP细胞中的表达水平. Western blot法检测其对PI3K/AKT信号通路的调节作用.结果 GEN对雄激素非依赖性LNCaP细胞增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量、时间依赖关系. Western blot显示雄激素非依赖性前列腺癌细胞内PCNA、Cyclin D1随着GEN浓度的增加逐渐下调,P53随着GEN浓度的增加逐渐上调(P＜0. 05). GEN抑制了PI3K和AKT的磷酸化.结论 GEN可以在体外抑制雄激素非依赖性LNCaP细胞的增殖,其作用可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路,进而抑制细胞增殖实现的.     

前列腺癌细胞激素非依赖性转化过程中microRNA的差异化表达

目的 对比观察雄激素依赖前列腺癌细胞(LNCaP)与雄激素非依赖前列腺癌细胞(LNCaP-AI)中microRNA的表达差异,探讨前列腺癌激素依赖向非依赖转化的转录后调控机制.方法 利用Agilent基因芯片检测LNCaP及LNCaPAI细胞microRNA的表达,用RT-PCR方法对其中6个microRNA进行验证,并对差异表达的microRNA所调控靶基因功能进行生物信息学分析.结果 基因芯片检测发现:与LNCaP相比,LNCaP-AI细胞有27个microRNA表达降低,11个microRNA表达升高.对其中6个microRNA进行RT-PCR验证,结果与基因芯片结果一致.通过检索http://www.mirbase.org/针对microRNA调控的靶基因,并参考已知的与雄激素非依赖相关基因的功能,发现LNCaP细胞转化为激素非依赖的LNCaP-AI细胞过程中,差异表达的microRNA主要调控表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、Bcl-2及雄激素相关代谢酶.结论 前列腺癌激素非依赖转化过程中存在microRNA的差异表达,可能涉及雄激素受体(AR)旁路信号通路、金属酶、抗凋亡基因及雄激素相关代谢酶基因等.     

CircRNA EZH2通过调控miR-30c-5p促进前列腺癌细胞增殖和迁移

目的 探究circRNA EZH2通过调控miR-30c-5p对前列腺癌细胞的增殖和迁移的影响及其相关作用机制。方法 通过TCGA数据库分析circRNA EZH2在前列腺癌组织中的表达差异及生存曲线;转染siRNA敲降前列腺癌LNCaP细胞中的circRNA EZH2表达后,CCK-8实验和划痕实验观察LNCaP细胞增殖和迁移,RT-qPCR和Western blot法测定miR-30c-5p、JAK1和PI3K蛋白的表达。结果 在前列腺癌组织中circRNA EZH2的表达显著上调（P <0.000 1）,且高表达circRNA EZH2的患者生存率降低;沉默circRNA EZH2的LNCaP细胞较正常LNCaP细胞的增殖和迁移能力下降（P <0.000 1）,miR-30c-5p表达增高（P <0.000 1）,JAK1表达降低（P <0.000 1）,PI3K信号受抑制。结论 EZH2在前列腺癌中高表达,通过调控miR-30c-5p激活PI3K信号通路促进前列腺癌LNCaP细胞的增殖和迁移。     

miR-370-5p对前列腺癌细胞周期及增殖的影响

目的 研究miR-370-5p导入对前列腺癌细胞株DU-145和LNCaP细胞周期和增殖的影响。方法 合成miR-370-5p（实验组）和dsControl（阴性对照组）,分别转染至两个细胞株。利用Real-time PCR和Western blot法分别检测细胞转染后p21、CDK4、Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达变化。流式细胞术分析细胞周期变化,利用MTT法和集落形成实验分析细胞活力和增殖能力。结果 Real-time PCR结果提示,转染miR-370-5p后DU-145和LNCaP细胞中p21 mRNA水平分别上调3.43倍（P<0.01）和3.06倍（P<0.01）,CDK4 mRNA水平分别下调0.51倍（P<0.01）和0.43倍（P<0.01）,Cyclin D1 mRNA水平分别下调0.31倍（P<0.01）和0.35倍（P<0.01）。Western blot法检测结果符合这一趋势。流式细胞术检测结果显示,转染miR-370-5p后,位于S期和G₂/M期的细胞比例下降,位于G₀/G₁期的细胞比例则上升,说明细胞周期被阻滞在G₀/G₁期。MTT分析结果显示,与dsControl组相比,转染miR-370-5p后,DU-145和LNCaP细胞活力明显降低。集落形成实验显示,miR-370-5p组的集落数数量明显较少,细胞增殖能力降低。结论 miR-370-5p能显著激活前列腺癌细胞中p21蛋白的表达,抑制前列腺癌细胞周期的进展和增殖。     

过表达miR-4328抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化

目的 研究miR-4328在前列腺癌中的作用及分子机制.方法 采用CCK-8方法检测过表达miR-4328对前列腺癌细胞增殖能力的影响, 采用Transwell方法检测对迁移能力的影响, 采用Real-time PCR和Western blotting方法检测上皮间质转化标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin以及上皮间质转化相关转录因子ZEB1的表达水平.结果 miR-4328在前列腺癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织 (P<0.001) .在前列腺癌细胞中, 转染miR-4328 mimics后, 肿瘤细胞的增殖能力显著降低 (P<0.001) .同时过表达miR-4328可以显著降低前列腺癌细胞的迁移能力 (P<0.001) .在前列腺癌细胞中, 过表达miR-4328后, 上皮细胞标志物E-cadherin的表达水平显著上升 (P<0.001) , 而间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin的含量显著降低 (P<0.001) .进一步研究发现过表达miR-4328可以下调上皮间质转化相关转录因子ZEB1的表达水平 (P<0.001) .结论 过表达miR-4328显著抑制前列腺癌细胞的增殖能力、迁移能力和上皮间质转化过程.     

Effect of miR-296 on the Apoptosis of Androgen-independent Prostate Cancer Cells

Objective To investigate the miR-296＇s function in prostate carcinoma（PCa） cells. Methods In order to profile the miRNA expression in LNCaP cells, the cultured cells were stimulated with androgen after 48-h starvation, miRNA microarray analysis and Q-RT-PCR assay were performed. To characterize the effects of miR296 on PCa cells, CL-1 and PC-3 cells were transfected with miR-296 and antisense-miR-296, cell growth and apoptosis were then analyzed. Results The miR-296-5p expression was up-regulated by 2.22 folds in the CL-1 cells, which do not express significantly androgen receptor, than in LNCaP cells. Knockdown of miR-296-5p induced apoptosis of CL-1 cells, but not LNCaP cells. However, knockdown of miR-296-5p inhibited the growth rate of LNCaP cells cultured in absence of androgen. Conclusion MiR-296-5p could be important for development of prostate cancer from androgen dependence to androgen independence.     

miR-29c过表达载体的构建及其对95D肺癌细胞增殖的影响

目的构建miR-29c真核表达载体并转染95D肺癌细胞,观察miR-29c过表达对95D细胞增殖能力的影响。方法克隆miR-29c片段插入质粒pcDNA3．1,构建miR-29c表达质粒pcDNA3．1-miR-29c;通过脂质体瞬时转染人肺癌细胞株95D,荧光PCR检测细胞miR-29c表达水平,MTT法检测过表达miR-29c对细胞增殖能力的影响。结果重组质粒pcDNA3．1-miR-29c经酶切及测序证明构建成功,荧光PCR证实转染后95D细胞miR-29c表达水平显著升高,是对照组的36倍。MTT检测结果表明,过表达miR-29c的95D细胞增殖受到显著抑制,至72h抑制率最高,达38．63％。结论成功构建miR-29c真核表达质粒pcDNA3．1-miR-29c,初步观察显示过表达miR-29c显著抑制95D肺癌细胞增殖效应。为进-步深入研究miR-29c对肺癌的作用打下良好基础。     

Aurora A表达对人前列腺癌细胞生物学行为的影响

目的 研究Aurora A表达增高对人前列腺癌细胞LNCaP生物学行为的影响,以了解其在人前列腺癌发生发展中的作用.方法 克隆Aurora A全长基因,将其转染入LNCaP细胞中表达,采用四唑盐(MTT)法细胞增殖实验检测Aurora A表达升高的阳性细胞生长情况,采用改良的Transwell侵袭小室方法检测细胞侵袭能力;同时与转染空质粒(pcDNA3.1)细胞和未转染细胞进行比较.结果 成功构建重组质粒pcDNA3.1-Full Length Aurora A.Aurora A高表达的LNCaP细胞增殖速度较空质粒转染细胞和未转染细胞快,培养3 d后LNCaP-Aurora A组细胞较pcDNA3.1质粒转染细胞及未转染的LNCaP细胞增多,差异有统计学意义(P＜0.05).在体外细胞移动实验中,LNCaP-Aurora A组细胞也较另两组细胞表现出更强的穿膜能力(P＜0.01).结论 Aurora A表达增高与人前列腺癌细胞的恶性表型具有密切相关性,Aurora A在人前列腺癌发生发展中可能发挥重要作用.     

前列腺癌中miR-140-5p靶向YES1抑制细胞增殖和迁移的作用研究

目的 研究miR-140-5p与YES1的靶向调控关系,阐明miR-140-5p通过YES1调控前列腺癌发生发展的作用,并研究miR-140-5p在前列腺癌细胞中的潜在作用机制.方法 采用实时定量PCR检测前列腺癌组织和细胞系中miR-140-5p的表达,采用CCK-8、细胞克隆实验、迁移和划痕实验测定miR-140-...     

miR-29a在宫颈癌组织中的表达及其上调后对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响

目的检测微小RNA（miR）-29a 在宫颈癌组织和不同种类宫颈癌细胞系中的表达情况及其上调后对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移等恶性生物学行为的影响。方法①组织标本检测：收集2014 年7 月-2016 年7 月西南医科大学附属医院活检或手术切除的宫颈组织标本160 例,采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-29a 的表达情况,并分析宫颈癌组织中miR-29a 的表达与临床病理特征的关系。②细胞学实验：采用qRT-PCR检测miR-29a在不同种类的人宫颈癌细胞系（SiHa、HeLa、Caski及C33a）和人正常宫颈细胞系Ect1/E6E7中的表达水平,选取miR-29a表达最低的宫颈癌细胞系SiHa进行后续研究,使用miR-29a mimics转染SiHa细胞,qRT-PCR检测转染后细胞miR-29a 的表达变化,CCK-8 法检测转染后细胞增殖活力的变化,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率的变化,Transwell实验检测转染后细胞迁移和侵袭能力的变化。结果宫颈鳞癌组织中miR-29a 表达低于HSIL、LSIL及正常宫颈组织（p <0.05）;HSIL组织中miR-29a表达低于LSIL及正常宫颈组织（p <0.05）,LSIL与正常宫颈组织间miR-29a的表达差异无统计学意义（p >0.05）。宫颈鳞癌组织中miR-29a的表达与患者临床分期和淋巴结转移密切相关（p <0.05）。miR-29a在人宫颈癌细胞系（SiHa、HeLa、Caski和C33a）中的表达低于人正常宫颈细胞系Ect1/E6E7（p <0.05）。SiHa细胞转染miR-29a mimics后,miR-29a表达水平增高（p <0.05）,细胞增殖活力降低（p <0.05）,细胞凋亡率增高（p <0.05）,细胞迁移和侵袭能力下降（p <0.05）。结论miR-29a在宫颈癌组织和细胞中均呈低表达,上调miR-29a的表达能够抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖及侵袭迁移能力,促进细胞的凋亡。