Livin siRNA重组腺病毒的构建及其对K562细胞增殖、凋亡和耐药的影响

目的 通过改良的重组腺病毒介导方法 研究Livin基因与K562细胞增殖、凋亡及耐药的关系.方法 用基因工程技术将靶向Livin siRNA片段克隆至穿梭质粒pSES-HUS中,然后与骨架质粒pAdeasy同源重组,将重组成功的质粒用脂质体介导的方法 转染HEK293细胞,乒乓感染收获高滴度的重组腺病毒AdS-Livin siRNA,并将其感染K562细胞,采用Real-time PCR、Western blot检测Livin基因的干扰效果,用MTT和流式细胞仪检测其与K562细胞增殖、凋亡及多药耐药的关系.结果 成功构建重组腺病毒Ad5-Livin siRNA,并感染K562细胞,在mRNA和蛋白2个水平均抑制Livin的表达.证实通过重组腺病毒沉默Livin基因,可抑制K562细胞增殖,促进凋亡,增加其对阿霉素、长春新碱和依托泊苷的敏感性.结论 用重组腺病毒介导的方法 抑制K562细胞中Livin基因的表达,可增加K562细胞的凋亡及对抗癌药物的敏感性.Livin可能成为治疗白血病新的分子靶点.     

RNAi沉默livin基因表达对胶质瘤U251细胞增殖的影响

目的:通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)阻断胶质瘤U251细胞中livin基因的表达,研究livin基因沉默后对细胞生长和细胞凋亡的影响.方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencer2.0线性质粒以T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切鉴定后,用脂质体法转染胶质瘤U251细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果.MTT法检测细胞生长的影响,流式细胞仪检测转染后胶质瘤U251细胞的凋亡变化.结果:酶切证实设计合成的DNA片段已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-liv1、pSilencer2.0-liv2重组载体均能有效地阻断胶质瘤U251细胞中livin基因的表达,使livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),后者抑制效果更佳.转染后的U251细胞生长速度明显变慢.转染pSilencer2.0-1iv2实验组细胞的凋亡增加了17.0%.结论:重组真核载体能有效抑制U251细胞的livin表达,抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡.     

重组人ndrg2腺病毒对胶质瘤细胞U251抑制作用的研究

目的:研究抑癌候选基因NDRG2在体外对人脑胶质瘤细胞系U251增殖和凋亡的影响。方法:将人脑胶质瘤细胞系U251细胞分成空白对照组,重组人ndrg2腺病毒组和今又生(重组人P53腺病毒)组,重组人ndrg2腺病毒组和今又生组下设1.68×1011、8.4×1010、4.2×1010、2.1×1010、1.05×1010、5.25×109、5.25×108、5.25×107 v.p/ml组,各组分别作用96h后观察细胞形态学改变,甲基噻唑基四唑法(MTT法)绘制细胞生长抑制曲线。结果:重组人ndrg2腺病毒和今又生转染人胶质瘤细胞系U251后,细胞生长受到明显抑制,呈现明显的剂量-效应依赖曲线;重组人ndrg2腺病毒组对U251细胞的抑制率优于今又生组。结论:过表达NDRG2可明显抑制人胶质瘤细胞U251的增殖并导致细胞凋亡。     

Osteopontin特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及其在U251胶质瘤细胞中OPN的表达

目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)对人胶质瘤细胞U251骨桥蛋白(osteopon-tin,OPN)表达的影响,为后续的以OPN基因为靶点的神经胶质瘤基因治疗研究奠定基础.方法:应用基因工程技术,筛选出2条针对OPN基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建2个重组慢病毒表达载体LV-OPNshRNA1,LV-OPNshRNA2;将连接产物转化到DH5α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将LV-OPNshRNA,pHelper 1.0,pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的2种重组慢病毒分别感染U251细胞,实时定量PCR和Western印迹检测U251细胞OPN mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果:2个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为8×1010TU/L和5×1010TU/L.感染U251细胞后,OPN基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降.结论:成功构建针对OPN基因的2个慢病毒载体OPN...     

Livin基因特异性siRNA对肝癌细胞增殖、转移的影响

目的 应用PNA干扰技术抑制人肝癌细胞株SMMC-7721中凋亡抑制因子livin表达,研究livin基因对肝癌细胞生物学行为的影响.方法 构建针对hvin β基因的siRNA真核表达栽体pU-livinβ-siRNA,将其表达栽体经脂质体LipofectamineTM2000转染至肝癌细胞株SMMC-7721细胞,采用RT-PCR、Western blot方法检测转染后的SMMC-7721细胞中livin β基因的mRNA和蛋白质表达,了解转染效率.通过流式细胞仪分析细胞周期的分布,并应用Transwell侵袭小室模型观察转染后SMMC-7721细胞恶性生物学行为的变化.结果 在pU-livinβ-siRNA转染后的SMMC-7721细胞中,livinβ基因的mRNA和蛋白质表达显著下降(P＜0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降.结论 通过RNAi技术阻断livin的表达,可抑制SMMC-7721细胞的生长、增殖、迁徙,提示Livin基因在肝癌的发生、发展过程中起重要作用.     

胶质瘤细胞BT325和U251凋亡相关因子的表达差异

目的比较BT325和U2512种胶质瘤细胞中凋亡相关因子的表达差异及其在凋亡中的作用。方法应用Western blot方法检测细胞中Fas、Caspase-3、Caspase-7、Survivin和Livin的表达情况。结果U251与BT325均有Fas、Caspase-3和Livin蛋白表达,BT325的Caspase-3含量高于U251,U251的Livin含量高于BT325;Survivin仅表达于U251;Caspase-7仅表达于BT325。结论BT325胶质瘤细胞中凋亡效应因子呈高表达,U251胶质瘤细胞中凋亡抑制因子呈高表达。     

CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251体外增殖和侵袭能力的影响,为CXCR4 shRNA治疗胶质瘤提供实验依据. 方法 用脂质体LipofectimineTM2000将CXCR4-shRNA转染U251细胞,MTT实验检测转染细胞的增殖,Transwell侵袭实验检测转染细胞的迁移和侵袭能力. 结果 与转染非特异的pGPU6/GFP/NC组和未转染组比较,转染CXCR4-shRNA载体pGPU6/GFP/Rac 1-421组的U251细胞CXCR4 mRNA显著降低(P＜0.05),并且细胞体外增殖能力减弱(P＜0.05),侵袭到滤膜底面的细胞数为36.67±9.76,分别低于对应的pGPU6/GFP/NC组和未转染组(P＜0.05). 结论 CXCR4 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-421可下调U251细胞CXCR4的表达,抑制U251细胞的增殖和迁移侵袭能力,提示CXCR4在胶质瘤发展过程中具有重要作用.     

小鼠MK基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的死亡受体(Mouse killer,MK)基因干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒并在小鼠子宫基质细胞中鉴定其干扰作用.方法:人工合成靶向MK的siRNA干扰序列,将其克隆到穿梭载体psES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-MKsiRNA,在HEK293细胞中包装并扩增腺病毒颗粒.用纯化后的腺病毒混合液感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞,RT-PCR及Western Blot检测基质细胞中MK的mRNA及蛋白表达水平.结果:Adeasy-SES-HUS-MKsiRNA混合液均效价为6.8 X 10~(11)pfu/ml,感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞48h后,MK的mRNA及蛋白水平均显著下调.结论:构建的MK干扰表达腺病毒能有效地抑制MK基因的表达,为进一步研究MK在小鼠子宫基质细胞的功能提供了有效的工具.     

CAPE对人神经胶质瘤细胞株U251凋亡作用研究

目的探讨咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester,CAPE）在人神经胶质瘤凋亡中的作用。方法建立人神经胶质瘤细胞株模型,观察CAPE在体外神经胶质瘤凋亡的影响。运用流式细胞术检测CAPE对胶质瘤细胞株U251的作用。结果通过对细胞株模型的观察,发现CAPE可以促进神经胶质瘤细胞株的凋亡。结论 CAPE可以促进神经胶质瘤细胞株U251的凋亡,可能对神经胶质瘤的生长有抑制作用。     

siRNA沉默livin基因对恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响

目的：观察沉默livin基因对恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡和周期及增值的影响．方法：采用siRNA-3转染人恶性黑素瘤LiBr细胞后分别应用TUNEL法和AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用免疫荧光细胞化学技术检测siRNA对凋亡效应蛋白Caspase-3表达的影响及应用MTY法检测siRNA对细胞增殖的作用．结果：siRNA．3转染LiBr细胞72h可诱导细胞凋亡（P〈0．05）和引起细胞G0／G1期阻滞（P〈0．05）;可下调Caspase-3蛋白表达（P〈0．05）及抑制细胞增殖（P〈0．05）．结论：Livin可做为应用RNA干扰技术探索恶性黑素瘤基因治疗的潜在靶基因．     

淫羊藿素通过抗氧化损伤延缓CCl4诱导的大鼠肝硬化进程

目的探讨淫羊藿素延缓大鼠肝硬化进程的作用及可能机制。方法用不同浓度淫羊藿素处理经CCl4损伤的体外培养大鼠原代肝细胞,测定细胞培养液中ALT、AST和MDA浓度、细胞内SOD含量及凋亡细胞数量。建立CCl4诱导的大鼠肝硬化模型,用淫羊藿素处理后检测各组大鼠血清ALT、AST、ALB、GLB浓度,并观察大鼠肝组织病理学变化和胶原蛋白Ⅰ表达情况。结果 CCl4损伤可使原代大鼠肝细胞培养上清中ALT、AST活性和MDA含量以及细胞凋亡率升高,细胞内SOD活性降低。用淫羊藿素预处理后,其培养上清中ALT、AST活性和MDA含量以及细胞凋亡率均明显低于凋亡模型组和药物载体组,细胞内SOD活性则明显高于模型组和药物载体组,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。体内研究结果显示,与模型组比较,淫羊藿素处理可降低肝硬化模型大鼠血清ALT、AST水平,改善肝功能指标(P<0.05)并减少胶原蛋白Ⅰ沉积,减轻肝硬化程度。结论淫羊藿素可能通过抗氧化损伤延缓CCl4诱导的肝纤维化向肝硬化发展的进程。     

针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用

目的:构建针对乙型肝炎病毒x基因(HBx基因)的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体,并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-HBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western Blot方法证实,在HepG2细胞中,HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论:腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.     

VEGF特异siRNA重组腺病毒构建及其对K562细胞增殖的抑制作用

目的 构建重组腺病毒Ad5-VEGFsi观察其抑制人红白血病K562细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达及其对K562细胞增殖抑制作用的影响.方法 ①合成针对人VEGF mRNA的特异性siRNA;将其插入穿梭质粒psES-HUS,命名为pSES-VEGFsi;后者与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组.酶切鉴定成功后,于HEK293细胞中包装、扩增,氯化铯超速梯度离心后得到滴度较高的重组腺病毒Ad5-VEGFsi;②Ad5-VEGFsi以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染K562细胞72 h后,RT-PCR及ELISA方法检测VEGF mRNA及细胞培养液上清VEGF蛋白表达、MTT法检测细胞增殖、流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 成功构建重组腺病毒Ad5-VEGFsi,氯化铯梯度离心纯化获得重组腺病毒滴度约4.6×1011pfu/ml;Ad5-VEGFsi感染K562细胞72 h后,VEGF mRNA水平与对照组相比下降了66.55%(P＜0.01),蛋白浓度下降了 86.03%(P＜0.01).感染Ad5-VEGFsi后K562细胞生长明显受到抑制,且细胞的凋亡率也较对照组增加了13.89%(P＜0.01).结论 重组腺病毒腺Ad5-VEGFsi可明显抑制人白血病K562细胞VEGF的表达,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡.     

Raf-1基因重组腺病毒siRNA载体构建及其对大鼠心肌细胞肥大的影响

目的构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体,并将其体外转导大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。方法合成针对大鼠Raf-1的靶序列及阴性对照序列,经退火形成的DNA双链定向克隆到穿梭质粒p Ad Track CMV中获得p Ad Track-siRaf-1质粒,Pme I线性化后在BJ5183细菌中与p Ad Easy-1骨架质粒进行同源重组获得p Ad-siRaf-1质粒,后转染HEK293细胞,包装获得p Ad-siRaf-1腺病毒颗粒,继而感染原代培养的心肌细胞,通过Western blot方法检测siRNA对Raf-1、NF-κB基因的抑制效率,液体闪烁计数仪测定3H-亮氨酸([3H]-leu)掺入率,用HJ2000图像分析系统测定细胞表面积。结果重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确,制备的病毒感染效率高,携带Raf-1的病毒颗粒能够在蛋白水平有效抑制Ang II诱导心肌细胞Raf-1的表达、细胞表面积及[3H]-leu的增加并下调Raf-1、NF-κB表达。结论成功构建了p Ad-siRaf-1重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染心肌细胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表达,抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。     

重组改构人TNF-α联合顺铂对人胶质瘤U251细胞的生长抑制作用

目的:观察重组改构人肿瘤坏死因子α(rmhTNF-α)联合顺铂(CDDP)对人胶质瘤细胞生长的抑制作用.方法:人胶质瘤U-251细胞分为对照组(不加药);T组:加入rmhNF-α(20μg/L);C组:加入CDDP(2 mg/L);T C组:加入rmhTNF-α(20μg/L)及CDDP(2 mg/L).MTT法检测细胞生长抑制率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期变化情况,用免疫组织化学方法检测细胞PCNA、Bcl-2、P170蛋白的表达情况.结果:T组、C组细胞生长抑制率、细胞凋亡率均高于对照组(P＜0.05),T C组细胞生长抑制率、细胞凋亡率均高于其他各组(P＜0.05).T组PCNA-LI、Bcl-2蛋白表达低于对照组(P＜0.05),T C组PCNA-LI、Bcl-2蛋白表达均明显低于其他各组(P＜0.05),对照组、T组及T C组P170蛋白表达低于C组(P＜0.05).结论:rmhTNF-α能抑制人胶质瘤细胞生长,其机制与诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖活性有关,且rmhTNF-α与CDDP联用有协同增效作用.