双自杀基因CD和TK对K562细胞体内外杀伤作用的实验研究

目的:探讨双自杀基因CD和TK对K562细胞的体内外抑制作用及前体药物对肿瘤的杀伤作用。方法:将目的基因转染入K562细胞,MTT法观察细胞在体内外的增殖状况及5-FC/GCV对转染细胞的杀伤作用,电子显微镜观察其超微结构变化。将K562/CDgly TK和K562细胞接种于裸鼠皮下,观察各种肿瘤细胞在体内的成瘤情况及对前体药物治疗的敏感性。结果:单独使用GCV或5-FC对K562及K562/CDgly TK细胞产生明显的杀伤作用,联合应用该2种药物对肿瘤细胞的杀伤作用更强。将K562细胞和K562/CDgly TK细胞接种于小鼠皮下后小鼠成瘤率为100%,GCV或5-FC可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成,联合应用GCV和5-FC治疗K562/CDglyTK细胞在小鼠体内形成的肿瘤,较单独应用GCV和5-FC及对照组小鼠形成的肿瘤体积明显缩小,生存期也明显延长。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有明显的抑制作用,可增加前体药物GCV和5-FC对瘤细胞的杀伤率。     

反义VEGF基因及内皮抑素基因转染对人巨细胞肺癌生物学行为的影响

目的　探讨反义VEGF基因和内皮抑素基因联合转染在抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长转移中的作用。方法　反义VEGF12 1cDNA脂质体法转染人肺巨细胞癌细胞 (PG AS VEGF) ,先行转基因细胞裸鼠异种移植 ,之后电脉冲介导PsectagA 内皮抑素基因转染 ,观察反义VEGF基因和内皮抑素转染对肿瘤血管生成和肿瘤生长转移的调节作用。结果　肿瘤内微血管密度在PG AS VEGF、转染空载体组分别为 40 .6 7± 9.35和5 8.34± 10 .5 2 (P <0 .0 5 ) ;裸鼠体内接种PG AS VEGF细胞后 18天 ,PG AS VEGF、转染空载体组肿瘤体积分别为 (0 .9779± 0 .2 42 1)和 (1.5 2 10± 0 .415 0 )cm3(P <0 .0 5 ) ;PG AS VEGF、转染空载体组淋巴结转移率分别为16 .7% (2 /12 )和 5 0 % (6 /12 ) (P <0 .0 5 )。在肿瘤局部行PsectagA 内皮抑素基因转染的PG AS VEGF瘤 ,当肿瘤生长到 2 1天时 ,肿瘤生长受到明显抑制 ,PsectagA 内皮抑素基因转染组与PsectagA空载体转染组肿瘤体积分别为 (1.5 889± 1.1396 )和 (3 .398± 2 .6 42 )cm3(P <0 .0 5 ) ;两者肿瘤淋巴结转移率分别为 12 .5 % (1/8)和 75 %(6 /8) (P <0 .0 5 )。结论　内皮抑素基因转染对反义VEGF基因转染的PG细胞裸鼠体内生长和淋巴结自发性转移有协同抑制作用。     

胞嘧啶脱氨酶基因旁观者效应与宿主免疫状态关系

目的 :研究胞嘧啶脱氨酶自杀基因 (E .Coli.cytosingedeaminasegene ,EC CD)旁观者效应与宿主免疫状态的关系。方法 :CT2 6细胞分别接种于Balb/c小鼠及Balb/cnu/nu裸鼠皮下 ,每只动物接种相互分离的两处 ,在其中一处瘤体内接种AdCMVCD ,腹腔给予氟胞嘧啶 (5 fluorocytosine ,5 FC) ,观察肿瘤体积的变化。并用FCM检测肿瘤浸润淋巴细胞CD3、CD4、CD8的表达情况。结果 :Balb/c小鼠中 ,治疗组接种病毒侧瘤体积为 2 4 95 2± 898 6 5mm3 ,其对侧为 2 5 74 8± 339 0 5mm3 ,均明显小于对照组 (P =0 0 0 9,P =0 0 12 )。Balb/cnu/nu裸鼠中 ,治疗组接种病毒侧瘤体积为 2 4 32 6± 36 8 5 3mm3 ,明显小于对照组(P =0 0 15 ) ,而其对侧为 396 0 9± 12 80 76mm3 ,明显大于治疗组接种侧 (P =0 0 4 9) ,但与对照组两侧间均无差异。FCM显示Balb/cnu/nu裸鼠体内肿瘤浸润淋巴细胞主要是CD3+、CD4 +的淋巴细胞 ,而Balb/c小鼠体内肿瘤主要是CD3+、CD8+的淋巴细胞。结论 :EC CD/ 5 FC系统的旁观者效应特别是远距离旁观者效应与宿主免疫状况有关 ,在免疫健全宿主中旁观者效应较强。     

HSV1-TK/GCV自杀基因系统治疗卵巢癌的体内杀伤作用

目的:探讨Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirustypeⅠthymidinekinase,HSV1TK)/丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)自杀基因系统对卵巢癌的体内治疗效果。方法:用携带TK基因的重组逆转录病毒转染人卵巢癌细胞系SKOV3,用G418筛选抗性克隆(命名为SKOV3/TK)。PCR方法检测TK基因整合情况。将SKOV3和SKOV3/TK细胞按不同比例混合培养,给与10mg/LGCV治疗,观察体外旁观者效应。再分别用含有不同SKOV3/TK浓度的细胞建立荷瘤鼠模型作为3个TK基因转染组,并以接种单纯SKOV3细胞的动物模型作为对照组。TK基因转染组均行GCV20mg/(kg·d)腹腔注射共9d,对照组给等体积生理盐水腹腔注射。绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率,并取瘤细胞做病理学检查。结果:体外混合培养细胞显示明显BSE,当SKOV3/TK细胞数占混合细胞数20%时,10mg/LGCV就可将约50%的混合细胞杀死。体内实验显示,20%、40%和100%TK基因转染组肿瘤体积与对照组比较,抑瘤率分别为38%、61%和99%,各组间两两比较差异有统计学意义,P<0.01(除20%TK基因转染组和40%TK基因转染组P值为0.001外,其余各组间P值均<0.001)。病理结果显示,TK基因转染组出现不同程度点、片状坏死,以100%TK基因转染组最重,残存的肿瘤均为坏死组织。结论:HSV1TK/GCV自杀基因系统对荷人卵巢癌皮下瘤裸鼠模型的肿瘤具有杀伤作用,同时存在BSE。这种杀瘤作用随着TK基因转染率的提高而增强。     

HSVTK/GCV自杀基因系统治疗乳腺癌的研究

 目的　探讨HSV TK/GCV自杀基因系统对小鼠乳腺癌细胞系MA782 / 5S 810 2体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应。方法　采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染小鼠乳腺癌细胞MA782 / 5S 810 2 ,得到带有HSV TK基因的MA782 / 5S 810 2 /TK细胞 ,并将其分别用于体外和体内实验。结果　载体HSV TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示 ,当MA782 / 5S 810 2 /TK细胞数占混合细胞 10 %时 ,低浓度 (10 μg/ml)的GCV就可将 5 0 %左右的肿瘤细胞杀死。体内实验结果显示GCV可明显抑制MA782 / 5S 810 2 /TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成。实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变。结论　逆转录病毒可介导HSV TK基因转入小鼠乳腺癌细胞MA782 / 5S 810 2并获稳定表达 ,HSV TK/GCV自杀基因系统在体内外对乳腺癌细胞均有杀伤作用 ,且存在明显的旁观者效应。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）治疗大鼠9L胶质肉瘤的疗效

为了评价HSV-tk基因转染加GCV治疗方案的效果,本研究采用Fischer 344大鼠9L胶质肉瘤模型,所使用的物品和实验的条件尽量同NIH研究组相同,包装细胞为G1TkSvNa 53,立体定向脑内接种4×10~4肿瘤细胞,第5天同样接种包装细胞1.5～6×10,第10～24天,腹腔注射GCV,15mg/kg。另外本研究还观察了体外转染tk基因后用GCV治疗的效果。结果:HSV-tk GCV组的生存期是23.90±0.90天,HSV-tk 生理盐水组是24.0±0.4天,βgal GCV组是24.7±1.8天,各组之间的存活期无显著差异,增加包装细胞的浓度也不能延长存活期。而体外转染tk基因(肿瘤细胞100％转染)接种于脑内后用GCV治疗可以治愈约1/4的大鼠,而同样皮下接种脑瘤模型却有约2/3的大鼠得到治愈。本研究还对“旁观者效应”(bystander effect)和GCV治疗浓度的问题进行了研究和探讨。     

人内皮抑素转基因治疗B16黑色素瘤的实验研究

目的　研究瘤内直接注射携带人内皮抑素 (hEN)基因逆转录病毒包装的细胞株对体内B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用。方法　修饰、鉴定hEN基因。构建含hEN基因的逆转录病毒载体pLNC hEN ,转染包装细胞株 ,筛选稳定转染该基因之PA317 pLNChEN细胞。建立小鼠B16黑色素瘤动物模型。瘤内直接注射PA317 pLNChEN细胞 ,分时间测量肿瘤体积 ,切取肿瘤 ,免疫组化检测肿瘤组织微血管密度 (MVD) ,TUNEL染色检测肿瘤组织中的凋亡细胞。结果　细胞接种后第 7～ 9天 ,全部小鼠均长出 2～ 3mm直径肿瘤。hEN基因转染后第 3,5 ,7,9天 ,转基因组肿瘤的平均体积 (mm3 )分别为 4 .6 7± 1.10、2 2 .2 5± 13.0 6、84 .17± 4 3.5和 15 5 .0 8± 81.1;空载体对照组分别为 136 .17± 30 .6 1、390 .17± 2 2 0 .4 7、10 2 1.6 7± 5 37.4 0和 2 92 0 .2 0± 2 2 0 .0 1,两组差异有显著性。转基因组和对照组的平均MVD分别为 8.0 0± 2 .2 8和 2 8.17± 5 .31,平均凋亡细胞数分别为 2 3.33± 3.83和 2 .33± 1.2 1,差异均有显著性。结论　瘤内注射携带hEN基因逆转录病毒包装的细胞 ,可抑制小鼠种植性B16黑色素瘤的微血管数目 ,促进肿瘤细胞凋亡 ,抑制肿瘤生长     

mdr1启动子调控CD::UPP基因对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的杀伤作用

目的探讨腺病毒介导的mdr1启动子调控胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶磷酸核糖转移酶(CDUPP)融合基因联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的特异性杀伤作用.方法扩增、纯化含有mdr1-CDUPP基因的重组腺病毒,转染人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol和亲本细胞株A2780,RT-PCR检测mdr1和CDUPP基因的表达水平;之后加入5-FC,MTT法检测细胞抑制情况及旁观者效应,并观察腺病毒转染后裸鼠移植瘤的生长情况.结果mdr1和CDUPP基因在A2780/Taxol细胞中可稳定表达,转染后A2780/Taxol组的细胞生长明显低于A2780组;转基因的A2780/Taxol细胞联合5-FC后可通过旁观者效应杀伤周围未转基因的耐药细胞;耐药组移植瘤生长明显受到抑制,肿瘤体积为(569.10±187.93)mm3,对照组肿瘤体积为(2 111.98±230.82)mm3,差异有统计学意义(P＜0.01).结论mdr1启动子可调控CDUPP基因特异性表达并特异性杀伤紫杉醇耐药卵巢癌细胞.     

重组腺病毒胸苷激酶基因构建体联合更昔洛韦治疗移植瘤裸鼠小细胞肺癌的实验研究

目的　观察以腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因重组构建体 (ADV TK)联合更昔洛韦 (GCV)体内抗肺癌的活性。方法　建立移植瘤裸鼠小细胞肺癌模型 ,肺癌局部注射ADV TK后 ,腹腔注射GCV ,观察肿瘤体积、相对肿瘤体积、瘤重、相对肿瘤增殖率以及肿瘤体积生长变化的时间曲线 ,评价ADV TK的抗肿瘤活性。结果　在作用底物GCV存在条件下 ,ADV TK对人癌裸鼠移植性小细胞肺癌生长具有明显抑制作用 ,对裸鼠移植性小细胞肺癌的体积和瘤重的抑制效应与ADV TK呈剂量依赖性增强 ,且未达量效平台期 ,其中 6 .0× 10 9病毒颗粒 /kg剂量组的肿瘤生长抑制率分别达到 6 4 .6 %和 81.7%。将ADV TK和GCV分别单独应用 ,结果显示对肿瘤生长均有一定的抑制作用 ,但与阴性对照组相比 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　ADV TK联合GCV对肺癌具有明确的实验性治疗作用 ,值得进一步研究 ,开展临床试验。     

RV-HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗子宫颈癌的体内实验研究

目的探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对小鼠子宫颈癌细胞系Hela形成肿瘤的体内杀伤作用及其产生的旁观者效应。方法体内实验分Hela对照组、Hela/TK Hela(1∶9)组、Hela/TK Hela(1∶1)组和Hela/TK组。分别按实验组别要求接种3.0×106细胞/只于BALB/C小鼠的右腋窝皮下,观察各组肿瘤形成及肿瘤治疗情况。治疗结束后将标本制成石蜡切片和超薄切片进行病理学分析,RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中的表达情况。统计学分析采用SPSS软件进行完全随机的方差分析(ANOVA)。结果丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成。经GCV治疗后,Hela/TK Hela(1∶9)、Hela/TK Hela(1∶1)组和Hela/TK组分别较对照组肿瘤体积缩小约11.1%、30.6%和47.2%;RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达。实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变。结论HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内对子宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应。     

hTERT1658-2070在大肠杆菌中的克隆及表达

目的　用基因工程的方法在大肠杆菌中表达人端粒酶逆转录酶 (hTERT)部分活性片段。方法　PCR扩增hTERTcDNA16 5 8 2 0 70片段 ,将其克隆至表达载体pGEX 5x 3上 ,转化大肠杆菌TG1,获得hTERT蛋白片段表达。并经DNA测序及Westernblot验证表达蛋白。结果　表达出的蛋白为GST hTERT融合蛋白 ,分子量为 38.8kD。经DNA测序及Westernblot证实表达蛋白即为所需蛋白。结论　在大肠杆菌中克隆并表达了hTERT部分片段。     

基因芯片技术在胰腺癌研究中的应用

利用基因芯片技术为胰腺癌的分子病理诊断、临床预后判断及治疗方案的选择提供理论指导.这必将加速对胰腺癌发生、发展机制的了解,为进一步诊断和治疗提供理论基础.     

核糖核酸酶抑制因子基因在人乳腺癌中的表达及突变分析

目的　通过核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor,RI)基因在人乳腺癌中的表达及其是否突变的分析 ,进一步探讨RI与肿瘤细胞生长的关系。方法　采用Westernblotting方法检测人乳腺癌组织中RI的表达量 ;采用SSCP的方法分析肿瘤细胞RI基因中是否有突变。结果　人乳腺癌组织中RI的表达明显低于同体癌旁正常组织 ,但用MboI酶切及SSCP分析未发现人乳腺癌组织中RI基因有突变。结论　乳腺癌的生长可能与RI表达的下降有关 ,从而可能使癌组织周边新血管的形成未受到有效抑制的结果。     

IL-24对B16细胞生长抑制作用的体内外实验研究

目的:构建白细胞介素24(Interleukin24,IL24)真核表达质粒,研究其体内外表达对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法:采用重组DNA技术构建IL24真核表达质粒pEGFPIL24。用脂质体法将重组质粒及空载体体外转染B16细胞,再经激光扫描共聚焦显微镜(LSM)观察其表达,用MTT法检测B16细胞的体外增殖能力,用流式细胞仪检测细胞周期。小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤的体内生长抑制作用。结果:pEGFPIL24转染B16细胞后,LSM可观察到IL24在细胞中的表达。转染IL24基因的B16细胞体外增殖能力明显受到抑制,细胞被阻滞在G2/M期。与对照组相比,IL24基因治疗组肿瘤在体内的生长受到明显抑制,P<0.05。结论:IL24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。于荷瘤小鼠的瘤内注射pEGFPIL24可抑制肿瘤生长,提示IL24具有明显的体内外抗肿瘤作用。     

Gene Expression Omnibus资源库在肿瘤学研究中的应用

Gene Expression Ominibus （GEO）是供学者们分享基因表达谱芯片数据、高通量测序数据等的国际化的公共资源平台,其中涵盖了应用炎癌模型获得的大量相关实验数据,比如关于某些炎性因子的表达情况.这些数据为炎癌转化中的调控网络和分子机制的研究提供了帮助,也为肿瘤的防治提供了新思路.研究者针对新的预测基因进行研究时,起源于各种疾病模型或实验处理的GEO数据库为寻找其有关功能提供了有利条件和有力证据.     

Detection of Epidermal Growth Factor Receptor Gene Amplification in Human Squamous Cell Carcinomas Using Fluorescence in situ Hybridization

The gene for epidermal growth factor receptor (EGFR) is associated with development of certain human cancers. In this study, we employed the improved fluorescence in situ hybridization technique to detect EGFR gene amplification in cell lines and tissue sections from human squamous cell carcinomas. We detected multiple distinct signals as arrayed amplicons on metaphase chromosomes and interphase nuclei of tumor cells. Our results provide a basis for rapid and quantitative DMA diagnosis of the EGFR gene amplification in individual cells of tumor specimens.     

重组人GM-CSF逆转录病毒基因转移系统的建立及其在人肿瘤细胞中的稳定表达

目的　建立逆转录病毒介导的 GM- CSF基因转移系统 ,为 GM- CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗研究奠定实验基础。方法　应用基因重组技术将 GM- CSF c DNA克隆于逆转录病毒载体p DORneo,获得重组载体 p DORGM。经脂质体介导将其转染于病毒包装细胞系 PA317细胞 ,经NIH3T3细胞检测病毒滴度 ,NIH3T3放大实验检测辅助病毒 ,并用高滴度病毒感染人乳腺癌细胞系MCF- 7。结果　GM- CSF基因克隆入逆转录病毒载体 ,经 PA317细胞包装产生病毒 ,最高的病毒滴度为 1× 10 6CFU/ ml,且没有发现辅助病毒存在。重组病毒感染的人乳腺癌 MCF- 7细胞在体外长期培养中保持稳定分泌 GM- CSF,活性在 50 0～ 80 0 U/ 10 6细胞 / 2 4小时。结论　建立的逆转录病毒介导的GM- CSF基因转移系统安全、有效 ,为 GM- CSF应用于肿瘤基因治疗提供了实验基础。     

EphA 2和KAI 1蛋白在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其意义

目的：探讨EphA 2蛋白和KAI 1蛋白的表达与膀胱移行细胞癌发生及浸润转移的关系以及两者表达的相关性。方法：采用免疫组织化学SP法,检测EphA 2蛋白和KAI 1蛋白在88例膀胱移行细胞癌组织及76例相应癌旁正常膀胱黏膜中的表达。结果：EphA 2蛋白在癌组织中的表达明显高于其癌旁正常黏膜（P〈0.01）;随着膀胱癌病理分级的升高,EphA 2蛋白的表达逐渐增加（P〈0.05）;在浸润性膀胱癌中的表达明显高于表浅性膀胱癌患者（P〈0.05）;有淋巴结转移组的表达明显高于无淋巴结转移组（P〈0.05）。KAI 1蛋白在癌组织中的表达明显低于癌旁正常膀胱黏膜（P〈0.01）;随着膀胱癌病理分级的升高,KAI1蛋白的表达逐渐减少（P〈0.01）;KAI 1在浸润性膀胱癌中的表达明显低于表浅性膀胱癌患者（P〈0.05）;有淋巴结转移组的表达明显低于无淋巴结转移组（P〈0.05）。EphA 2蛋白和KAI 1蛋白的表达在有淋巴结转移的患者中呈显著负相关（P〈0.05）。结论：EphA 2蛋白的高表达和KAI 1蛋白的低表达与膀胱移行细胞癌的发生及浸润转移有关。