超声微泡介导EGFP 质粒对视网膜母细胞瘤细胞转染效率的实验研究

目的探讨不同浓度的超声微泡造影剂，在不同声强的超声辐照下，介导DNA质粒转染视网膜母细胞瘤（RB）细胞的效率及可行性，为实现外源基因高效、定向的转移奠定基础。方法将培养的RB细胞分别予以超声条件为0．25，0．5，0．75，1．0，1．25W／cm^2，60S的连续波辐照，微泡造影剂浓度为1％，100．4，20％，30％，以筛选出对RB细胞活性无明显抑制的最适超声声强、辐照时间和微泡浓度。根据以上筛选条件，转染EGFP基因入RB细胞，24～48h后，在荧光显微镜下观察EGFP表达情况，并用RT-PCR对EGFPmRNA进行半定量检测。结果声强〈0．75W／cm^2（60s），以及微泡浓度〈20％时，对RB细胞的活性无明显抑制。当微泡浓度10％，超声声强为0．5W／cm^2或0．75W／cm^2时，介导的DNA质粒对RB细胞转染具有较高的转染效率，明显高于其他实验组。超声声强为0．5W／cm^2或0．75W／cm^2介导的转染效率，在统计学上差异无显著性意义。结论浓度适当的微泡在优化的声强条件下，能够有效地提高DNA质粒在RB细胞中的转染效率。     

超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的实验研究

目的探讨超声破坏微泡介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的效率及可行性，为实现外源基因高效、定向的转移目的奠定基础。方法将30只Long-evans大鼠分为6组，第1组仅以0．5w／cm。的超声波辐照大鼠眼球，第2组于尾静脉输入适当剂量的微泡造影剂，并立即以相同能量的超声波辐照大鼠眼球，第3组于尾静脉输入质粒，第4组于尾静脉输入质粒，并以超声辐照大鼠眼球，第5组于尾静脉输入质粒与微泡，第6组尾静脉输入质粒、微泡，并用超声辐照眼球。转染2周后，在激光共聚焦显微镜下观察EGFP表达情况。结果超声微泡介导的EGFP质粒对大鼠视网膜的转染效率，明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照，及适当浓度的微泡，对大鼠视网膜脉络膜无明显损伤。结论利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂，能够有效地提高EGFP质粒在大鼠视网膜的转染效率。     

超声微泡造影剂介导EGFP对兔视网膜的转染效率

目的 探讨在不同能量超声和一定剂量微泡作用下,超声微泡造影剂介导下增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒对兔视网膜转染的效率、安全性以及可行性.方法 将30只新西兰大白兔随机分为6组:质粒组(A组)、质粒+微泡组(B组)、质粒+超声照射组①(C组)、质粒+超声照射组②(D组)、质粒+微泡+超声照射组①(E组)、质粒+微泡+超声照射组②(F组).将1 ml pEGFP-C1质粒与1 ml SonoVue微泡造影剂混合,由耳缘静脉注入,分别用0.5、1.0 W/cm2超声波辐照眼球.转染7天后行视网膜光镜及透射电镜检查,观察质粒、微泡及超声照射对视网膜有无损害,并在荧光显微镜下观察pEGFP-C1质粒表达情况.结果 光镜及透射电镜结果显示质粒、微泡及超声照射对视网膜无损害.A～D组均可见少量绿色荧光表达(P均＞0.05),E、F组的荧光表达较强,明显高于其他4组(P均＜0.05),E、F组荧光强度差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 在一定能量的超声照射下,超声微泡造影剂能够提高携带EGFP质粒在兔视网膜的转染效率.     

超声微泡介导野生型p53基因转染Y79细胞的实验研究

目的研究超声微泡介导wtp53（wild type p53）基因转染视网膜母细胞瘤（Y79）细胞的效率及作用效果。方法以一定能量的超声介导wtp53转染Y79细胞,分为（1）质粒＋微泡＋超声照射组;（2）质粒＋脂质体组;（3）质粒＋超声照射组;（4）空白对照组。RT-PCR检测wtp53mRNA,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果超声微泡介导的wtp53基因对Y79细胞的转染效率明显高于其他实验组,检测到的细胞凋亡率也明显高于其他组。结论超声微泡可达到高效的基因转染目的,wtp53对Y79细胞有明显抑制生长的作用。     

超声微泡造影剂介导PEDF基因转染大鼠视网膜与传统转染比较的实验研究

目的探讨超声微泡造影剂与脂质体介导色素上皮源性因子（pigment epithelium derived factor,PEDF）质粒转染大鼠视网膜、脉络膜的效率及治疗脉络膜新生血管（choroidal neovascu larization,CNV）效果。方法氩绿激光对Long-Evans大鼠视网膜进行光凝建造CNV模型。将36只CNV大鼠分为3组：（1）空白组,（2）超声辐照微泡转染组,（3）脂质体转染组。于转染后7、14、28d,分别进行荧光眼底血管造影（fundus flourascent angiography,FFA）,RT-PCR检测。结果转染后7、14d超声微泡介导PEDF质粒对大鼠视网膜的转染效率与脂质体介导的转染效率相似,但转染后28d两者转染效率差异有显著性。超声微泡与脂质体介导PEDF质粒转染对CNV有抑制作用。结论利用一定能量的超声击碎携带PEDF质粒的超声微泡造影剂,能够有效地提高PEDF质粒在大鼠视网膜脉络膜的转染效率,对大鼠脉络膜新生血管有一定抑制作用。     

超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠骨骼肌

目的 探讨增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP)在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的条件下表达的可行性.方法 20只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为裸质粒组(P)、质粒 超声组(P U)、质粒 微泡组(P M)和质粒 超声 微泡组(P U M)共4组进行实验.选择增强绿色荧光蛋白质粒与白蛋白微泡相混合,以超声介导白蛋白微泡破裂的方法 对大鼠骨骼肌行基因转染,转染7 d后,荧光显微镜下观察质粒在大鼠脊斜肌组织中的表达情况.结果 P、P M组大鼠脊斜肌组织中均未见增强型绿色荧光蛋白表达;P U组可见少量微弱绿色荧光,荧光强度较P和P M组明显增强(P<0.05),P U M组可见明显特异性增强型绿色荧光蛋白表达,荧光强度约为P、P M组的10倍,P U组的3倍(P<0.05);P U M组转染率为(42.72±10.07)%较之P U组(13.62±6.17)%明显增高(P<0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂造成的脊斜肌组织毛细血管通透性的增加,是血管内基因成功跨越内膜屏障的主要途径之一.     

超声微泡造影剂介导PEDF质粒转染大鼠视网膜的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导色素上皮源性因子(PEDF)质粒转染大鼠视网膜、脉络膜的效率及治疗脉络膜新生血管(CNV)效果.方法 氩绿激光对Long-Evans大鼠视网膜进行光凝建造CNV模型.将24只造模成功的CNV大鼠分为2组:①空白组,②超声辐照微泡转染组.于转染后14 d,分别进行眼底荧光血管造影(FFA),RT-PCR和免疫荧光检查.结果 转染后14天超声微泡能介导PEDF质粒对大鼠视网膜、脉络膜的转染,并且对CNV有抑制作用.结论 利用一定能量的超声击碎携带PEDF质粒的超声微泡造影剂,能够有效地提高PEDF质粒在大鼠视网膜、脉络膜的转染效率,对大鼠脉络膜新生血管有一定抑制作用.     

超声介导微泡造影剂促进HSV-TK基因转染抑制小鼠肝癌移植瘤的实验研究

目的 探讨超声辐照微泡造影剂介导的单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)自杀基因系统转染小鼠肝癌组织的有效性.方法 小鼠肝癌皮下移植瘤,尾静脉注入HSV-TK,添加或不添加Sono Vue,脉冲多普勒超声(1MHz、2W/cm2 、5min)辐照,第2天重复治疗1次.24h后荷瘤鼠腹腔注射更昔洛韦(GCV),连续10d,绘制肿瘤生长曲线,观测荷瘤鼠生存时间,半定量RT-PCR分析肿瘤内TK mRNA的表达,TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡.结果 与单纯超声辐照组比较,超声(US)和Sono Vue组肿瘤生长受到明显抑制(P<0.05),小鼠的平均生存时间延长(P<0.05),肿瘤内TK mRNA的表达增多(P<0.05),肿瘤细胞凋亡指数增高(P<0.05).结论 超声辐照Sono Vue可有效介导HSV-TK基因发挥抗瘤效应.     

载自杀基因的靶向微泡联合超声抑制视网膜母细胞瘤的实验研究

目的 探讨载自杀基因的靶向微泡联合超声对视网膜母细胞瘤（RB）的抑制作用。方法 制备携带单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（HSV1-tk）质粒和VEGFR2抗体的靶向微泡,分为空白对照组、细胞+质粒组、细胞+质粒+SonoVue组、细胞+靶向微泡组、细胞+质粒+超声辐照组、细胞+质粒+SonoVue+超声辐照组和细胞+靶向微泡+超声辐照组进行实验。荧光显微镜观察基因转染情况,流式细胞仪检测转染率,加入丙氧鸟苷（GCV）后,检测细胞的抑制率。结果 细胞+靶向微泡+超声辐照组的转染率为（24.78±1.04）%,较细胞+质粒+SonoVue+超声辐照组（14.31±0.69）%高。随着GCV浓度的增加,培养时间的延长,各组的抑制率逐渐升高。当GCV浓度在100 mg/l,培养96h后,细胞+靶向微泡+超声辐照组对RB细胞的抑制率达（92.91±1.71）%。结论 在加入GCV后,携带HSV1–tk的靶向微泡联合超声能有效的抑制RB细胞。     

超声微泡介导pGPU6/Neo质粒转染神经干细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡介导pGPU6/Neo 质粒转染神经干细胞(NSCs)的效率及可行性.方法 以一定能量的超声介导质粒转染大鼠NSCs,分为:空白组、质粒组、质粒+微泡组、质粒+超声组、质粒+微泡+超声组,并按不同转染条件分为亚组.转染48 h后荧光显微镜观察转染效率,台盼蓝染色法检测细胞活性.结果 最优参数为声强1....     

电镜硝酸镧示踪超声微泡造影剂开放血脑屏障

目的 研究超声波破坏微泡造影剂对大鼠血脑屏障通透性的影响。 方法 用电镜硝酸镧示踪法观察超声波破坏微泡造影剂对大鼠血脑屏障通透性的变化。 结果 超声波照射后即刻，即可见镧颗粒通过毛细血管内皮细胞及细胞间的紧密连接进入组织间隙，血脑屏障开放持续至6h，12h时已关闭。电镜下可以见到血管源性脑水肿，细胞器水肿不明显。 结论 超声波破坏微泡造影剂开放血脑屏障，为中枢神经系统疾病的治疗提供了一种无创、具靶向性的药物转运方法。     

微泡造影剂联合超声辐照介导的绿色荧光蛋白质粒转染小鼠肝癌的实验研究

目的探讨微泡造影剂SonoVue联合超声辐照在介导体内基因转染中的作用。方法建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型，尾静脉注入绿色荧光蛋白质粒（pEGFP），添加或不添加SonoVue，脉冲多普勒超声辐照（1MHz，2W／cm^2）瘤组织。持续时间1、5、10min，7d后流式细胞仪、荧光显微镜评价pEGFP转染率。HE染色行肿瘤病理学检查。结果SonoVue联合超声辐照组pEGFP的转染率显著高于单纯超声辐照组（P〈0．01）；仅SonoVue与单纯pEGFP2组间转染率无显著差异（P〉0．05）；辐照时间5、10min时pEGFP表达明显高于1min（P〈0．05）。5与10min组间pEGFP表达无显著差异（P〉0．05）。HE染色肿瘤组织无坏死灶出现。结论微泡造影剂联合超声辐照可明显提高基因转染率，且对组织无损害。     

超声波介导微泡破裂促EGFP基因转染大鼠脑组织的实验研究

目的 探讨超声波介导微泡造影剂破裂促外源基因在中枢神经系统转染的可行性.方法 15只大鼠分3组,1组经股静脉输入含绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)的造影剂0.8 ml,立即用超声波照射大鼠颅骨3 min;第2组输入相同的造影剂0.8 ml,不采用超声波照射;第3组输入不含造影剂的pEGFP 0.2 ml,立即超声波照射3 min.48 h后处死大鼠,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 只在股静脉输入含pEGFP的造影剂,并经超声波照射的大鼠微血管壁上观察到绿色荧光蛋白表达.结论 以微泡造影剂为基因载体,通过超声波靶向破坏微泡,有可能在脑血管内皮细胞中获得基因转染.     

靶向超声造影剂促进反义基因转染的体外研究

目的 探讨超声破坏造影剂微泡联合半乳糖化多聚赖氨酸(G-PLL)对基因治疗肝癌的靶向促进作用.方法 将合成的超声造影剂微泡、G-PLL及c-myc反义寡核苷酸(ASODN)耦联物,结合超声辐照作用于表达c-myc基因的人肝癌及人肺癌细胞株进行体外效应研究.观察细胞形态学改变及耦合物与细胞结合情况并检测c-myc基因的表达情况.结果 镜下显示肝癌细胞较肺癌细胞更易于与耦联物结合,多数细胞呈凋亡改变.经超声辐照,耦联物作用后的人肝癌及肺癌细胞c-myc基因表达量均有降低,而G-PLL对肝癌细胞c-myc基因表达有明显抑制作用.结论 超声辐照下,造影剂结合G-PLL及反义基因耦联物可靶向性促进反义基因转染肝癌细胞.     

超声和共聚物P85介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 探讨超声和共聚物Pluronic P85能否介导HepG2细胞基因转染,并摸索超声辐照条件.方法 质粒DNA用EGFP,超声辐照加或未加P85的HepG2细胞,48 h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪定量分析转染率,锥虫蓝染色评价细胞活性.结果 0.8 W/cm2、30 s时达到较理想的转染效率.超声 P85组转染率为单独超声组的3倍左右,超声 P85组细胞成活率80%左右,单独超声组细胞成活率60%左右.结论 超声和共聚物能介导HepG2细胞基因转染,在0.8 W/cm2、30 s时达较理想的转染效率,P85使超声介导的细胞损伤有一定程度的增加.     

超声辐照微泡声学造影剂增强脂质体介导肝细胞基因转染的体外实验研究

目的研究超声破坏微泡声学造影剂提高脂质体介导肝细胞生长因子质粒（plRES—EGFP—HGF）在肝细胞中转染率的可行性。 方法将培养的肝细胞分为4组：（1）单纯对照组，（2）脂质体转染组，（3）超声辐照脂质体转染组，（4）超声辐照微泡＋脂质体转染组。第（4）组按照每孔加入造影剂剂量又分为1）10μl组，2）20μl组，3）30μl组，4）40μl组4亚组。超声辐照微泡＋脂质体转染组在脂质体介导肝细胞生长因子转染肝细胞1h后，在24孔板中每孔加入微泡声学造影剂10，20，30或40μl，超声辐照60s。24h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况、MTT法检测肝细胞增殖率和流式细胞仪检测基因转染率。 结果超声频率1MHz，功率0．5W／cm。辐照60S，每孔加入造影剂30μl时肝细胞基因转染效率最高，与脂质体转染组比较有显著性。 结论在一定条件下，超声辐照微泡声学造影剂可明显提高脂质体介导肝细胞基因转染效率，为基因治疗提供了新的思路。