接触式细胞共培养诱导人脐带华通胶间充质干细胞向类髓核细胞分化

目的:观察接触式细胞共培养条件下,人髓核细胞对脐带华通胶间充质干细胞(Wharton′s jelly-derived mesenchymal stem cells,WJMSCs)的诱导分化效应,为椎间盘退变性疾病的治疗寻找种子细胞来源。方法:取足月产健康新生儿脐带约30cm,分离、纯化、培养WJMSCs;取人椎间盘髓核组织,酶消化法分离培养髓核细胞。取第三代稳定增殖的WJMSCs,利用流式细胞方法检测细胞免疫表型CD73/CD90/CD105/CD34/CD45/HLA-ABC/HLA-DR。用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记WJMSCs,与髓核细胞以1∶1比例进行混合,在6孔板中进行接触式细胞共培养;以单独培养的WJMSCs为对照组。培养7d后利用高速流式细胞仪分选荧光标记阳性的WJMSCs,提取细胞总RNA,进行反转录获得cDNA,利用Real-Time PCR方法检测其Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅵ型胶原、蛋白多糖、SOX-9和多能聚糖基因的相对表达,管家基因GAPDH作为内参,单独培养的WJMSCs作为对照,利用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达变化。结果:WJMSCs原代细胞接种24h可见部分细胞贴壁生长,形态为梭形和多角形,1周后形成集落,2周时细胞融合达到90%。流式细胞检测结果显示CD73/CD90/CD105/和HLA-ABC(+),CD34/CD45和HLA-DR(-)。与髓核细胞共培养7d后WJMSCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达较对照组显著性增加(P<0.01),Ⅰ型胶原、Ⅵ型胶原和多能聚糖基因相对表达未见显著性变化(P>0.05)。结论:通过接触式细胞共培养人脐带WJMSCs能够被髓核细胞诱导分化为类髓核细胞,可为组织工程技术和细胞治疗修复退变椎间盘提供种子细胞来源。     

Paxillin对骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的影响

目的 :探讨Paxillin对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向类髓核细胞分化的影响。方法 :取3周龄健康SD大鼠骨髓,采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,传至第3代,用流式细胞仪对其表面标志分子进行鉴定。利用pc DNA3.1(-)/Myc-His B质粒构建真核表达载体pc DNA3.1-Paxillin。取第3代BMSCs分为3组:实验组,转染pc DNA3.1-Paxillin;阴性对照组,转染pc DNA3.1(-)/Myc-His B;空白对照组,不转染质粒。分别培养36h后,实验组和阴性对照经G418筛选,取3组BMSCs采用实时荧光定量PCR方法(q RT-PCR)检测各组Paxillin、蛋白多糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原α1(collagen typeⅡα1,COL2α1)、性别决定区Y框蛋白9(sex determining region Y box protein 9,SOX9)、角蛋白19(keratin19,KRT19)、配对盒1(paired box 1,PAX1)和叉头蛋白(forkhead box F1,FOXF1)的m RNA表达量;免疫印迹法(Western blot)检测Paxillin、KRT19、PAX1和FOXF1蛋白表达水平。结果:BMSCs原代培养至第3代的细胞形态大体一致,呈长梭形,细胞连接紧密且均匀分布,CD44、CD90呈现高表达(95.6%和96.8%),CD45、CD11则呈现低表达(1.82%和2.16%)。实验组中Paxillin的m RNA和蛋白表达量较阴性对照组和空白对照组升高,差异具有显著性(P0.05);经G418筛选后的BMSCs和髓核细胞形态相似。实验组中COL2α1、SOX9、Aggrecan、KRT19、PAX1、FOXF1的m RNA表达量较阴性对照组和空白对照组显著性升高(P0.05);实验组KRT19、PAX1和FOXF1的蛋白表达量显著性高于阴性对照组和空白对照组(P0.05)。结论 :Paxillin可以促进BMSCs向类髓核细胞分化,为椎间盘退变性疾病的细胞移植治疗提供基础。     

人退变髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究

[目的]探讨人脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)向类髓核细胞(nucleus pulposuslike cells,NPCs)诱导分化的可能性,为椎间盘退变的防治研究提供种子细胞。[方法]收集腰椎间盘退变患者手术中切除的脂肪组织及髓核组织,采用胶原酶消化法提取原代ADSCs和NPCs,倒置显微镜下观察共培养后ADSCs形态学变化。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,采用孔径为0.4μm的Transwell小室建立细胞共培养体系,NPCs置于上层,ADSCs接种于下层,建立2个细胞培养组:ADSCs单独培养组和ADSCs/NPCs共培养组,甲苯胺蓝染色以检测蛋白聚糖表达情况,RT-PCR法检测细胞COL2A1、ACAN和SOX9基因表达水平。[结果]采用胶原酶消化法可较好的分离培养出人脂肪间充质干细胞和髓核细胞。与NPCs共培养后的ADSCs可被甲苯胺蓝染为天蓝色,且Ⅱ型胶原及SOX9基因表达水平上调(P0.05)。[结论]采用胶原酶消化法分离培养的ADSCs活力较好、增殖旺盛,与退变NPCs共培养后,软骨特异性标记物的表达明显增加,细胞表现出向NPCs分化的趋势,可作为椎间盘组织工程研究的种子细胞。     

间充质干细胞向髓核分化研究进展

正椎间盘退行性变为下腰痛的重要原因之一[1]。非手术或手术治疗均不能彻底治愈椎间盘退行性变,且有复发的可能[2-3]。间充质干细胞(MSCs)具有体外扩增及分化成正常组织的潜能,在一定的诱导条件下可以向成骨、成软骨、成脂及髓核细胞分化,且具有免疫原性低和免疫调节性的特点[4-7],一直是组织修复研究的热点。近年来,诱导MSCs向髓核分化,用于修复椎间盘退行性变备受关注,     

人髓核细胞诱导人尿源性干细胞向髓核样细胞分化作用的研究

目的:探讨人髓核细胞(NPCs)诱导对人尿源性干细胞(USCs)向髓核样细胞分化的作用。方法 :手术时获取腰椎间盘突出症患者L4/5的髓核组织,并采用贴壁法体外分离培养NPCs;从健康成年人尿液中获取USCs并进行体外培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,并采用成骨、成脂、成软骨三系诱导分化及蛋白免疫印迹技术(Western blot,WB)对所获取的USCs进行形态、分化潜能及细胞表面标志蛋白鉴定。使用Transwell小室将P3代NPCs与USCs培养以建立共培养体系,设实验组、对照组及NPCs组,实验组为NPCs与USCs共培养组,对照组为单独USCs培养,NPCs组为单独NPCs培养;培养14d后应用倒置显微镜观察细胞形态;应用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)及WB分别检测实验组USCs、对照组USCs与NPCs组NPCs中蛋白多糖(ACAN)、SOX-9(SRY-related high mobility groupbox gene 9)、Ⅱ型胶原(COL2)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的m RNA及蛋白的表达情况;免疫荧光染色观察3组COL2A1及ACAN荧光表达。...     

非接触式共培养体系对脐带间充质干细胞向类髓核细胞的诱导分化效应

目的探讨人脐带间充质干细胞向类髓核细胞的分化潜能,为椎间盘退变性疾病的生物学治疗探索新的细胞来源。方法取人正常足月产婴儿脐带及成人椎间盘,分离消化华通胶组织和髓核组织,收集培养脐带间充质干细胞及成人髓核细胞。利用带有插入层的Transwell 6孔培养板进行细胞非接触式共培养,细胞比例为1∶1,以脐带间充质干细胞单独培养作为对照组。共培养1周后,提取脐带间充质干细胞总RNA,利用Real-Time PCR检测其Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX9基因的相对表达改变。结果成功分离提取脐带间充质干细胞;Real-Time PCR检测结果显示实验组脐带间充质干细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因相对表达较对照组显著增加,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论人脐带间充质干细胞能够被髓核细胞诱导分化为类髓核细胞,有可能为椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供一种新的细胞来源。     

人髓核细胞外泌体诱导人尿源干细胞向髓核样细胞分化的研究

目的探讨人髓核细胞(nucleus pulposus cells, NPCs)外泌体对诱导人尿源干细胞(urine-derived stem cells, USCs)向髓核样细胞分化的作用。方法体外分离培养USCs和NPCs, 提取NPCs外泌体, 以Western-blot检测外泌体标记蛋白;以GFP慢病毒转染标记USCs细胞质、DAPI染料标记USCs细胞核以及PKH26染料标记NPCs外泌体;将USCs与NPCs外泌体共孵育12 h并观察摄取情况, 采用NPCs外泌体和非接触共培养方法诱导USCs分化, 检测各组髓核细胞标志基因mRNA的相对表达量和450 nm波长处的吸光度。结果分离的USCs具备向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的能力, 高表达干细胞标志蛋白CD29(99.57%)、CD44(97.46%)、CD73(97.71%), 低表达干细胞阴性蛋白CD31(0.59%)、CD45(0.19%)。分离的NPCs高表达髓核细胞标志蛋白COL2A1、ACAN、SOX-9。提取的NPCs外泌体高表达标志蛋白CD63、CD81、Tsg101。共孵育12 h后, NPCs外泌体与U...     

髓核细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用

目的:探讨人髓核细胞(NPCs)外泌体对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用。方法:取腰椎间盘突出症患者手术切除的髓核组织,体外分离培养人NPCs,采用差速离心法提取NPCs的外泌体,利用透射电镜及Western blot对外泌体进行大小形态及标志蛋白的检测,同时用PKH67荧光染料标记外泌体后与BMSCs共孵育0.5h、2h、4h,在激光共聚焦显微镜下观察BMSCs对NPCs外泌体的摄取情况;取人BMSCs经NPCs外泌体诱导3d、7d、10d、14d后应用RT-PCR检测BMSCs中蛋白聚糖(ACAN)、SOX-9、Ⅱ型胶原(COL2A1)、角蛋白19(KRT19)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的m RNA表达情况。结果:提取的人NPCs外泌体为直径为30~100nm的圆形或椭圆形结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白。经PKH67标记的NPCs外泌体可以被BMSCs摄取;经NPCs外泌体诱导后7d开始BMSCs中的ACAN、SOX-9、COL2A1、KRT19及HIF-1α基因m RNA表达均显著性高于未经诱导的BMSCs(P0.05)。结论:在体外实验中,人NPCs可以分泌外泌体并被BMSCs所摄取,诱导BMSCs分化为髓核样细胞,可为椎间盘退变的组织工程修复提供更为简单有效的NPCs来源。     

胚胎干细胞向肾脏细胞分化的研究进展

胚胎干细胞可以分化成为成体器官内不同胚层的所有细胞,具有广阔的研究和应用前景.近几年,胚胎干细胞向肾脏细胞分化方面的研究逐年增多,但仍有许多问题尚未解决.本文将就胚胎干细胞向肾脏细胞分化的文献以及其应用前景进行综述.     

干细胞向女性生殖细胞分化的研究进展

人类辅助生殖技术(ART)可以治疗部分女性卵巢早衰、年龄相关的卵巢功能障碍,但不能治疗生殖细胞缺乏的不孕不育。干细胞研究取得的重大进展,包括多种成体干细胞、人类胚胎干细胞、诱导多能干细胞等,对生殖医学有潜在的应用前景。卵巢中极少量具有自我更新和分化潜能的生殖干细胞,有产生新的卵母细胞的潜能,为卵巢再生、卵母细胞生成、女性不孕治疗提供了新的希望,也为研究生殖生理提供新的研究策略。本文综述干细胞向生殖细胞分化研究。     

Effects of hypoxia on differentiation from human placenta-derived mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells

Background context

Low back pain is a frequently occurring disease caused by intervertebral disc degeneration. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a possible treatment modality. Studies have shown MSCs can be transformed into nucleus pulposus-like cells under normoxic conditions. However, this is not a true representation of the hypoxic environment nucleus pulposus cells experience during in vivo growth and differentiation.

Purpose

To determine the effects of a hypoxic environment on the differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells (PMSCs) to nucleus pulposus-like cells.

Study design

An experimental study.

Methods

Placenta-derived mesenchymal stem cells were cultured and the mesenchymal lineage was confirmed by flow cytometry. Two groups of PMSCs were then cultured under different oxygen concentrations creating a hypoxic group and normoxic group. The proliferation of cells in each group was compared by cell counting kit-8 on Day 1, 3, 5, and 7. Real-time polymerase chain reaction on Days 3 and 7 compared the expressions of Sox-9, Type II collagen, aggrecan, and hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) between the two groups. Immunofluorescence was used to compare the expression of Type II collagen between the two groups after 14 days.

Results

Placenta-derived mesenchymal stem cells were successfully isolated and cultured. Mesenchymal markers were positive. On Days 3 and 5, the hypoxic group had a significantly higher proliferation rate than the normoxic group (p<.05). The expression of Sox-9 and HIF-1α was significantly higher (p<.05) in the hypoxic group at Days 3 and 7. Type II collagen and aggrecan expressions were significantly higher (p<.05) in the hypoxic group at Day 7. The hypoxic group stained more positive for Type II collagen at Day 14.

Conclusions

Hypoxic conditions lead to an increased differentiation and proliferation of nucleus pulposus-like cells. Placenta-derived mesenchymal stem cells cultured in nucleus pulposus inducing media and a hypoxic environment show enhanced expression of the nucleus pulposus-like cell markers, Sox-9, Type II collagen, aggrecan, and HIF-1α.     

大鼠髓核细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用研究

目的:探讨大鼠髓核细胞来源外泌体对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用。方法:采用贴壁法体外分离培养SD大鼠尾椎椎间盘髓核细胞和BMSCs,流式细胞术和三系分化实验鉴定BM-SCs。差速离心法分离髓核细胞外泌体,透射电镜观察其形态并使用蛋白免疫印迹(Western blot)检测其蛋白标志物CD81、Tsg101。分别使用荧光探针CM-DIO和CM-DIL标记BMSCs和髓核细胞外泌体,将两者共培养24h后在荧光显微镜下观察BMSCs对髓核细胞外泌体摄取情况。将第三代BMSCs分为三组:外泌体组,加入髓核细胞外泌体(50μg/ml);共培养组,与髓核细胞非接触式共培养;对照组,未做任何处理。分别于7、14、21d时应用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外泌体组和对照组Ⅱ型胶原(COL2A1)、蛋白多糖(ACAN)、SOX9的m RNA表达量。14d时应用qRT-PCR检测3组的COL2A1、ACAN、SOX9的m RNA表达量。结果:提取的第三代大鼠髓核细胞呈多角形或不规则形状,第三代BMSCs呈形态均一的长梭形。BMSCs高表达CD29(99.77%)、CD44(93.97%)、CD90(99.67%),低表达CD34(0.82%)、CD45(0.68%)。BMSCs成骨、成脂、成软骨诱导后染色均为阳性。透射电镜观察外泌体为30～100nm类圆形双层膜结构,其表达CD81、Tsg101蛋白,不表达Calnexin蛋白。荧光显微镜下CM-DIL标记的外泌体可被CM-DIO标记的BMSCs摄取。诱导7、14、21d后,外泌体组的COL2A1、ACAN、SOX9 mRNA表达量均显著高于对照组(P0.05)。14d时共培养组COL2A1、ACAN、SOX9的m RNA表达量均显著高于对照组,低于外泌体组(P0.05)。结论:大鼠髓核细胞外泌体可在体外诱导BMSCs向髓核样细胞分化,且诱导效果优于与髓核细胞的非接触式共培养,可为椎间盘组织工程提供一种有效的髓核细胞来源。     

脂肪间充质干细胞向髓核样细胞诱导分化的初步研究

[目的] 定向诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为髓核样细胞,为椎间盘退变性疾病的细胞移植治疗奠定生物学基础.[方法] (1)200 g SD雄性大鼠断颈处死后,取腹股沟脂肪垫处脂肪,0.1%胶原酶消化,体外接种培养,同时采用极限稀释法纯化细胞;(2)利用流式细胞技术对细胞表面标记进行鉴定;(3)第3代细胞消化计数后,用1.2%海藻酸钠溶液悬浮,调整细胞密度至1×10~6/ml,滴入3.5%CaCl_2溶液形成微球,加入含TGF-beta1的诱导培养基,低氧条件下进行微球联合培养;(4)7 d后,取部分微球进行Alcian Blue染色并收集微球内细胞提取RNA,进行RT-PCR检测.[结果] (1)体外培养的脂肪间充质干细胞主要呈梭形和多角形,核大、核仁明显,平行排列生长或呈漩涡状生长;(2)流式细胞仪检测显示Sca-1、CD44的阳性率分别为95.2%、99.7%,CD45、CD11b的阳性率分别为0.4%、1.5%;(3)微球联合培养7 d后,Alcian Blue染色表明,实验组细胞外基质的生成明显多于对照组;(4)RT-PCR结果证实,髓核细胞标志基因和软骨细胞标志基因的表达,实验组明显高于对照组.[结论] (1)本实验方法可以获得大量均一的脂肪间充质干细胞;(2)脂肪间充质干细胞可以被定向诱导分化为髓核样细胞;(3)首次探讨了将脂肪间充质干细胞体外诱导后移植治疗椎间盘退变性疾病,为椎间盘退变性疾病的干细胞移植治疗提供了新的思路.     

非接触共培养脊索细胞诱导骨髓间充质干细胞向类软骨细胞分化的实验研究

目的:分离兔髓核脊索细胞(notochordal cells,NC)及骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),通过非接触共培养探讨NC对MSC细胞表型的影响。方法:4～6周龄新西兰兔8只,取胸腰段脊柱的髓核,用密度梯度离心提取NC,同时取其股骨骨髓用FICOLL液分离MSC,将NC和MSC等比例(1∶1)通过transwell培养板进行非接触共培养作为实验组,单纯MSC细胞培养作为对照组,光镜下观察细胞的生长情况。对两组的MSC行免疫组化及RT-PCR、Western-blot检测MSC细胞表型的改变情况。结果:原代NC呈圆形或椭圆形,细胞体积大,细胞增殖不明显;MSC贴壁生长,呈三角形或梭形,漩涡状排列。甲苯胺蓝染色:对照组MSC细胞核淡染,胞体染色不明显,染色阴性;实验组MSC可见从第3天开始胞体及胞外基质出现紫红色,第5天染色更加明显。Ⅱ型胶原免疫组化对照组MSC淡染,细胞形态不清楚;实验组第3天出现MSC内出现棕黄色深染,随着时间推移细胞染色加深呈阳性表现。RT-PCR检测,经过5d非接触共培养后实验组蛋白聚糖的基因表达为对照组的2.35倍(P<0.05),Ⅱ型胶原的基因表达为对照组的1.61倍(P<0.05),对照组Ⅰ型胶原的基因表达为实验组的2.56倍(P<0.05)。Western-blot检测后发现:经过5d非接触共培养,实验组蛋白聚糖的含量为对照组的1.61倍(P<0.05),Ⅱ型胶原的表达为对照组的10.04倍(P<0.05)(P<0.05)。结论:在非接触共培养条件下脊索细胞可以诱导骨髓间充质干细胞表型发生变化,向类软骨细胞方向分化,这将为组织工程化髓核的种子细胞筛选提供新选择。     

分层共同培养诱导骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的研究

目的 探讨体外联合HaCaT细胞共同培养诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向表皮细胞分化的可行性.方法 用聚碳酸酯细胞插入板分层后联合共同培养HaCaT细胞与MSCs,观察培养3、6、9d后的细胞形态,进行角蛋白(CK-19、CK-10)、整合素(α6、β1)染色并用流式细胞仪统计细胞阳性率.结果 共同培养后细胞形态变化明显,共培养3、6d后表皮细胞标志物CK-19、α6整合素、β1整合素免疫荧光染色阳性,细胞阳性率分别为9.3％、8.2％、11.5％和21.7％、34.1％、39.6％,CK10表达呈阴性;共培养9d后CK-19、α6整合素、β1整合素、表达较前减少,阳性率为12.2％、18.6％、16.3％,CK1O出现阳性表达,细胞阳性率为10.7％.结论 分层联合HaCaT细胞共同培养可以诱导骨髓干细胞向表皮细胞进行分化.