曲古抑菌素A对前列腺癌LNCaP细胞雄激素受体的清除作用

目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)对前列腺癌细胞的抑制作用机理。方法:四甲基偶唑氮蓝(MTT)检测药物对肿瘤细胞增殖的影响;Hochest33342染色观察细胞凋亡的形态学变化;Western印迹分析雄激素受体(AR)蛋白的表达;反转录PCR检测AR转录水平的变化。结果:TSA在较低浓度即能有效抑制LNCaP细胞的增殖,EC50为125.9nmol·L-1,并诱导肿瘤细胞凋亡;药物处理后细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂p21表达增高,AR呈时间及剂量依赖性被清除。TSA对AR的清除是发生在蛋白水平的降解,而不影响其转录。结论:TSA能够清除对细胞生长具有重要作用的AR细胞信号通路,从而对前列腺癌LNCaP细胞发挥抑制作用。     

miR-34a通过调控雄激素受体基因抑制前列腺癌细胞系LNCaP增殖

目的:探究miR-34a对雄激素受体(AR)基因的调控作用及对前列腺癌(PCa)LNCaP细胞增殖、凋亡的影响。方法:收集2016年10月至2019年9月本院泌尿外科行前列腺穿刺活检确诊为PCa患者组织标本36例,另取同期行手术治疗切除的良性前列腺增生(BPH)组织标本41例。体外培养LNCaP细胞,分别转染miR-34a mimics(mimics组),miR-34a mimic NC(NC组),设正常生长细胞为空白对照组(BC组),另在mimics组基础上转染AR过表达(AR过表达组)载体及其对照(AR对照组),采用CCK-8试剂盒检测细胞活性,Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率,实时定量PCR(RT-qPCR)检测miR-34a及AR mRNA表达水平,免疫印迹法检测AR蛋白、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)及原癌基因产物(c-Mcy)、细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、capase-3)的表达水平。结果:与BPH组织比较,PCa组织中miR-34a表达水平显著降低(P<0.05),AR mRNA及蛋白表达水平均显著增加(P<0.05);与BC、NC组比较,mimics组LNCap细胞miR-34a表达水平、细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著增加(P<0.05),AR、Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05),同一时间LNCap细胞活力均显著降低(P<0.05);双荧光素酶实验结果显示,miR-34a与AR可能存在一定的调控关系,过表达AR基因可逆转miR-34a mimics对LNCaP细胞增殖抑制,促进凋亡作用。结论:miR-34a可能通过调控AR抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖,促进其凋亡。     

雄激素对前列腺癌细胞系泌乳素相关蛋白表达的影响

目的:探讨泌乳素相关蛋白(PIP)在前列腺癌不同细胞系中的表达情况,以及雄激素对其表达的影响.方法:应用不同浓度(0、0.1、1、10、100 nmol/L)双氢睾酮(Dihydrotestosterone,DHT)或睾酮(Testosterone,T)及不同时间(6、24和48 h)对前列腺癌细胞系(LNCaP、PC-3、DU145)及人乳腺癌细胞系T47D进行处理,通过RT-PCR及实时荧光定量PCR法检测PIP及雄激素受体(AR) mRNA表达情况.通过Western blot法检测各细胞系(LNCaP、PC-3、DU145、T47D)中PIP蛋白表达情况.结果:雄激素依赖性前列腺癌细胞系LNCaP中有PIP mRNA及蛋白表达,PIPmRNA的表达随DHT或T浓度增加而增加,且于10 nmol/L浓度DHT或T时达到最大峰值.而AR mRNA的表达差异无统计学意义.雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3与DU145中无PIP mRNA及蛋白表达,并且AR表达较少或无AR表达.结论:PIP在前列腺癌发生发展机制中,以及鉴别前列腺癌是否具有雄激素依赖性方面有一定作用.     

表观遗传学药物FK228治疗肝癌的实验研究

目的观察表观遗传学药物FK228对人肝癌细胞HepG2的体内外抑制作用,并初步探讨其机制。方法采用不同浓度的FK228和氟尿嘧啶(5-FU)处理HepG2细胞48 h,采用CCK-8法观察比较FK228对人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用。将5μg/L FK228和25μg/ml 5-FU分别单独或联合作用于2种肝癌细胞48 h,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。体内实验构建BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型,通过腹腔注射FK228 (1 mg/kg)和5-FU (20 mg/kg),比较FK228对HepG2裸鼠移植瘤生长抑制作用。结果 FK228对人肝癌细胞HepG2具有明显的生长抑制作用,且呈剂量依赖性,其48 h的半数抑制浓度(IC50)为(4.20±0.24)μg/L,而5-FU的IC50值为(117.50±8.40)μg/ml;FK228联合5-FU处理组与相应浓度的单药组相比,联合用药组的细胞存活率明显降低(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,FK228可以显著诱导肝癌细胞HepG2凋亡,且联合用药后细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。给药20 d后,FK228组、5-FU组、联合给药组及对照组的肿瘤体积分别为(344.71±118.87)、(351.97±73.46)、(220.36±72.12)、(639.76±241.47)mm3。FK228组、5-FU组、联合给药组的裸鼠肿瘤体积均小于对照组(P<0.05)。免疫组化结果显示,与对照组相比,FK228对肝癌细胞的体内促凋亡作用并不明显(P>0.05),但与5-FU联合应用后,促凋亡作用明显增强(P<0.05);与对照组和5-FU组相比,FK228可以明显抑制肿瘤内的血管生成(P<0.05)。结论 FK228对人肝癌细胞HepG2具有明显的体内外生长抑制作用,且与5-FU联合应用后,抑制作用更加明显。FK228与5-FU联合应用,可以明显促进HepG2肝癌细胞的凋亡和抑制肿瘤的血管生成。     

FK228对人肝癌细胞HepG2凋亡及细胞周期基因表达的影响

目的：探讨FK228对人肝癌细胞HepG2凋亡及细胞周期基因p 21,cdk4表达的影响。方法：培养HepG2,应用四氮唑蓝(MTT)比色法观察FK228对HepG2的生长抑制作用,琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA特征,流式细胞术分析细胞周期,以RT-PCR检测HepG2细胞中p 21,cdk4基因表达水平。结果：组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228能抑制人肝癌细胞HepG2生长,并具有时间和剂量依赖性；FK228引起细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡；FK228能明显促进p21mRNA转录,同时抑制cdk4mRNA的转录。结论：FK288能抑制HepG_2细胞增殖,诱导HepG_2细胞凋亡和周期阻滞；调节p21和cdk4基因的表达可能是FK228抑制HepG_2细胞生长的重要机制。     

雄激素对前列腺癌细胞系PIP表达的影响

目的：探讨PIP在前列腺癌不同细胞系中的表达情况,以及雄激素对其表达的影响。方法：应用不同浓度（0、0.1、1、10、100 nmol/L）双氢睾酮（Dihydrotestosterone,DHT）或睾酮（Testosterone,T）及不同时间（6、24和48 h）对前列腺癌细胞系（LNCaP、PC-3、DU145）进行处理,通过RT-PCR及实时荧光定量PCR法检测PIP 及AR mRNA表达情况。通过Western blot法检测各细胞系（LNCaP、PC-3、DU145、T47D）中PIP蛋白表达情况。结果：实时荧光定量RT-PCR法与Western blot结果显示,雄激素依赖性前列腺癌细胞系LNCaP中有PIP mRNA及蛋白表达,PIP mRNA的表达随DHT或T浓度增加而增加,且于10 nmol/L浓度DHT或T时达到最大峰值。而AR mRNA的表达差异无统计学意义。雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3与DU145中无PIP mRNA及蛋白表达,并且AR表达较少或无AR表达。结论：PIP或许在前列腺癌发生发展中,以及鉴别前列腺癌是否具有雄激素依赖性方面有一定作用。     

姜黄素上调前列腺癌细胞LNCaP中maspin基因的表达

目的研究姜黄素对前列腺癌细胞LNCaP凋亡的影响和对maspin基因表达的调控作用。方法利用不同浓度的姜黄素处理前列腺癌细胞LNCaP，MTT法和DNA 电泳检测不同时相LNCaP细胞的活性和凋亡情况，RT-PCR和Western blotting检测转录水平和翻译水平maspin基因的表达情况。将包含maspin 5′侧启动子区847 bp(-764～+83)DNA的荧光素酶表达载体pGL3-maspin瞬时转染LNCaP，姜黄素作用细胞48 h后，应用荧光素酶测定系统检测maspin启动子的表达活性作用。结果姜黄素抑制LNCaP细胞的生长活性，诱导LNCaP细胞的凋亡，增强LNCaP细胞中maspin基因的表达。结论姜黄素增强LNCaP细胞中maspin基因的表达是通过促进启动子的转录活性起作用的。     

依立雄胺对前列腺癌细胞(LNCaP)前列腺特异性抗原和Bcl-2蛋白体外表达的抑制作用

目的　为研究依立雄胺治疗前列腺癌的可能性及可能机制 ,探讨依立雄胺体外对人激素依赖型前列腺癌细胞 (LNCaP)生长及前列腺特异性抗原(PSA)与Bcl 2蛋白表达的作用。方法　用 5 ,15和4 5 μmol·L- 1的依立雄胺作用LNCaP细胞 3d或 7d后 ,相差显微镜进行细胞形态学观察 ;台盼蓝染色活细胞计数 ,绘制 7d的生长曲线 ;应用流式细胞仪分析依立雄胺对LNCaP细胞凋亡的影响 ;应用免疫组化ABC比较经依立雄胺作用后LNCaP细胞PSA与Bcl 2蛋白的表达强度。结果　 4 5 μmol·L- 1的依立雄胺作用LNCaP细胞 3d后 ,可使其明显的皱缩脱壁 ,部分细胞膜破裂。在 5 ,15和 4 5 μmol·L- 1的依立雄胺作用 7d后 ,可明显抑制LNCaP细胞的生长 ,抑制率分别达 4 0 .0 % ,4 7.4 %和 5 4 .3% ;流式细胞仪分析显示上述浓度的依立雄胺可诱导细胞凋亡 ,凋亡率分别为 3.5 % ,15 .8%和 2 5 .0 % ,而对照组为2 .2 % ;免疫组化分析表明依立雄胺可降低LNCaP细胞PSA和Bcl 2蛋白的表达。结论　在上述浓度下依立雄胺可特异性的抑制LNCaP细胞的生长和PSA与Bcl 2蛋白的表达而诱导细胞凋亡     

多西紫杉醇对前列腺癌细胞增殖与凋亡的影响

目的观察多西紫杉醇对前列腺癌细胞增殖与凋亡的影响。方法人雄激素依赖性前列腺癌(LNCaP)细胞株与25,50,100nmol/L多西紫杉醇作用,分别在24,48和72h,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术分析细胞凋亡情况。结果多西紫杉醇(25,50,100nmol/L)对LNCaP细胞的增殖抑制率逐渐增加;流式细胞术检测表明多西紫杉醇能诱导LNCaP细胞凋亡,且随浓度和时间的延长而增强。结论多西紫杉醇能够抑制LNCaP细胞增殖,促进其凋亡。     

雷公藤甲素通过miR-320bAR轴对前列腺癌细胞的抑制作用

目的 观察雷公藤甲素(triptolide, TPL)对前列腺癌细胞恶性生物学行为的作用,探究其作用机制。方法 用实时荧光PCR(real-time fluorescence PCR,RT-PCR)检测LNCaP、PC-3、DU145前列腺癌细胞、RWPE-1人正常前列腺上皮细胞中miR-320b和雄激素受体(androgen receptor, AR)mRNA的表达水平。用不同剂量的TPL处理PC-3细胞,用MTT法检测细胞的增殖活力。用RT-PCR检测miR-320b和AR的表达水平。用6.25 nmol·L^(-1) TPL处理细胞,在TPL处理的基础上转染miR-320b NC/mimics,用Transwell和平板克隆形成实验检测细胞的侵袭和克隆能力。用Western blot检测AR及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的表达水平。用荧光素酶实验验证miR-320b与AR的靶向关系。结果 与RWPE-1人正常前列腺上皮细胞比较,miR-320b和AR分别在前列腺癌细胞中呈低表达和高表达状态(P<0.01)。与Control组比较,TPL可上调PC-3细胞miR-320b的表达水平、下调AR的表达水平,抑制细胞的增殖、侵袭能力,抑制AR、N-cadherin和vimentin的表达、上调E-cadherin的表达水平(P<0.05)。与TPL组比较,miR-320b可提高TPL对PC-3细胞侵袭和增殖能力的抑制作用,抑制AR、N-cadherin和vimentin的表达、上调E-cadherin的表达(P<0.05)。荧光素酶实验显示,AR是miR-320b的潜在靶基因,miR-320b对AR存在显著调控作用(P<0.01)。结论 TPL可能通过miR-320b/AR轴抑制前列腺癌细胞的恶性生物学行为。     

曲古抑菌素A对前列腺癌LNCaP细胞抑制效应的细胞信号通路研究

目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（1SA）对前列腺癌LNCaP细胞抑制作用的细胞信号机制。方法：半固体培养检测TSA对前列腺癌细胞集落形成能力的影响；Westem Blot分析细胞蛋白乙酰化水平、细胞信号通路蛋白及细胞周期相关蛋白的表达。结果：TSA能够有效杀伤前列腺癌LNCaP细胞，在较低浓度即能抑制具有集落形成能力的细胞；药物处理使细胞内蛋白乙酰化水平增高，乙酰化组蛋白H3积累，多种细胞信号通路的相关蛋白如雄激素受体、HER2、Raf-1、Akt、CDK4等呈时间依赖性和剂量依赖性被清除。结论：TSA能够同时阻断对细胞生长具有重要作用的多条细胞信号通路，从而对前列腺癌LNCaP细胞发挥抑制作用。     

Cytotoxic effects of histone deacetylase inhibitor FK228 (depsipeptide,formally named FR901228) in combination with conventional anti-leukemia/lymphoma agents against human leukemia/lymphoma cell lines

Summary FK228 is a novel antitumor depsipeptide that inhibits histone deacetylases and restores the expression of genes aberrantly suppressed in cancer cells. This agent was shown to have broad antitumor activity in preclinical studies, and is currently under phase I/II evaluations. Because of its wide spectrum of actions, it is reasonable to consider the combination with other anticancer drugs in clinical application. We studied the cytotoxic interaction of FK228 in combination with conventional antileukemic agents using human promyelocytic leukemia HL60, Philadelphia chromosome-positive (Ph⁺) chronic myelogenous leukemia KU-812, T-cell lymphoblastic leukemia MOLT3 and Burkitt's lymphoma Raji cell lines. For the combination of FK228 and imatinib, Ph⁺ leukemia KU812, K562 and TCC-S cell lines were used. The cells were exposed simultaneously to FK228 and other agents for 4 days. Cell growth inhibition was determined by using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. We used the isobologram method of Steel and Peckham to evaluate the cytotoxic interaction at the concentration of drugs that produced 80% cell growth inhibition (IC₈₀). FK228 showed an additive effect with cytarabine, carboplatin, doxorubicin, etoposide, 4-hydroperoxy-cyclophosphamide, 6-mercaptopurine and SN-38 (active metabolite of irinotecan) in all cell lines studied. FK228 with methotrexate and vincristine showed an antagonistic effect in three and one of the four cell lines, respectively. FK228 was additive with imatinib in all three Ph⁺ leukemia cells. Our findings suggest that FK228 is a promising candidate for combining with most anticancer agents except for methotrexate and vincristine, which produce suboptimal effects.     

Antitumor efficacy of FK228, a novel histone deacetylase inhibitor,depends on the effect on expression of angiogenesis factors

It has been recently demonstrated that histone deacetylase inhibitors inhibit angiogenesis, but their mechanism of action has not been characterized well. In this study, we examined the in vitro and in vivo effects of FK228 [(E)-(1S,4S,10S,21R)-7-[(Z)-ethylidene]-4,21-diisopropyl-2-oxa-12,13-dithia-5,8,20,23-tetraazabicyclo-[8,7,6]-tricos-16-ene-3,6,9,19,22-pentanone; FR901228, depsipeptide], an HDAC inhibitor, on the expression of angiogenesis factors in FK228-sensitive PC-3 prostate and FK228-resistant ACHN renal cancer cells. FK228 suppressed the expression of VEGF mRNA in PC-3 cells, but not in ACHN cells. FK228 also suppressed the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) mRNA in both PC-3 and ACHN cells. Under conditions of hypoxia, FK228 suppressed the expression of VEGF mRNA without modulating the expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha mRNA in PC-3 cells. FK228 induced the highest acetylation of histone H3 and H4 in the P2 region of the VEGF promoter, which includes the hypoxia-inducible factor-1 alpha binding site that plays an important role in regulating the expression of VEGF gene. Moreover, FK228 reduced the amount of VEGF and bFGF protein, and their mRNA levels in PC-3 xenograft implanted in nude mice, but did not reduce them in ACHN xenograft. In conclusion: (i) FK228 showed a suppressive effect on the expression of angiogenesis factors, such as VEGF and bFGF, in PC-3 xenograft but not in ACHN xenograft, which suggests that the effect on the expression of angiogenesis factors is important for the antitumor efficacy of FK228; (ii) FK228 caused histone acetylation of the VEGF promoter regions, which may contribute to the suppression of VEGF gene expression.