β-榄香烯对K562细胞周期与细胞凋亡的影响及其机制探讨

目的探讨β-榄香烯(β-ELE)对人慢性髓性白血病细胞株K562细胞周期及细胞凋亡的影响及其机制。方法K562和不同浓度的β-ELE共同培养后,应用流式细胞仪技术和Hoe-chest33258/PI荧光染色法检测β-ELE对K562细胞周期及凋亡的影响,应用RT-PCR技术测定野生型p53活化片段(P21wild-type p53 activated fregmentl,P21WAF1)、Survivin mRNA水平。结果不同浓度β-ELE能使K562细胞阻滞于G1期,G1期细胞百分比增加,S期细胞百分比明显下降,呈剂量、时间依赖性,且与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。β-ELE作用于K562细胞24h,48h后,在G0/G1期前,可见明显的亚二倍体(凋亡峰),其凋亡率呈剂量、时间依赖性,与对照组比较有显著意义(P<0.01)。Hoechest33258/PI免疫荧光技术发现β-ELE能使凋亡细胞数目明显增多(P<0.01)。RT-PCR结果显示β-ELE能下调K562细胞Survivin mRNA表达,上调P21WAF1mRNA的表达(P<0.01)。结论β-ELE能够阻止细胞K562细胞从G1期向S期转换。β-ELE可以诱导K562细胞凋亡,呈剂量、时间依赖性。β-ELE导致细胞周期阻滞可能与上调P21WAF1mRNA的表达有关;促进K562细胞凋亡机制可能与下调Survivin mRNA的表达有关。随着药物浓度的增加,P21WAF1mRNA表达增加,而SurvivinmRNA表达下降。     

RNA干扰联合小剂量阿糖胞苷对K562细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨利用RNA干扰(RNAi)技术沉默同源盒(HOX)A10基因联合小剂量阿糖胞苷(Ara-C)对K562细胞增殖、凋亡的影响,为白血病的基因治疗提供实验依据。方法设计合成针对HOXA10的特异性短发卡RNA寡核苷酸链,构建pGPHI/GFP/Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞。RNAi与小剂量Ara-C单独和联合应用后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果成功构建pGPHI/GFP/Neo-HOXA10载体,并转染K562细胞,结果显示该载体能有效降低HOXA10 mRNA表达水平,HOXA10/β-actin灰度比值(ODR)为(38.86±4.49)%;RNAi联合小剂量Ara-C作用于K562细胞后,细胞增殖能力明显下降,细胞增殖抑制率(IR)为(75.58±8.11)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);荧光显微镜可见红色荧光凋亡细胞明显增加,凋亡率显著升高,可达(29.71±1.24)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向HOXA10的RNAi技术联合小剂量Ara-C能有效抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡,有望成为白血病基因治疗的新方案。     

盐酸吉西他滨对K562细胞增殖、凋亡及bcr/abl mRNA表达的影响

目的 观察盐酸吉西他滨对K562细胞增殖、凋亡及bcr/abl基因表达的影响,探讨盐酸吉西他滨用于慢性粒细胞白血病急变期治疗的可行性. 方法 采用水溶性四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测盐酸吉西他滨对K562细胞增殖的影响,采用凋亡的原位酶标记检测(TUNEL)法检测盐酸吉西他滨对K562细胞凋亡的影响,采用半定量RT-PCR技术检测盐酸吉西他滨作用于K562细胞后bcr/abl融合基因mRNA表达变化. 结果 0.1 mg/L、1.0 mg/L 、10.0 mg/L盐酸吉西他滨分别作用K562细胞12 h、24 h、48 h、72 h 后,K562细胞增殖受到抑制,抑制作用随质量浓度及时间增加而增强,但48 h和72 h比较无显著性差异,10.0 mg/L吉西他滨组作用K562细胞48 h抑制率达(29.3±0.008)%.吉西他滨组对K562细胞的抑制作用明显强于同质量浓度同时间的阿糖胞苷组,二者比较有显著性差异(P<0.01).TUNEL实验结果 显示10.0 mg/L吉西他滨作用于K562细胞48 h,凋亡率为15.3%,明显高于阿糖胞苷组 3.7%(P<0.05)和空白对照组2.0%(P<0.05).RT-PCR结果 显示10 mg/L吉西他滨作用48 h对K562细胞bcr/abl融合基因mRNA的表达有明显抑制作用,与同剂量阿糖胞苷组比较无显著性差异.结论 盐酸吉西他滨对K562细胞有一定的增殖抑制及促凋亡作用,且具有剂量和时间依赖性.10 mg/L吉西他滨能够明显下调慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因mRNA表达,有望联合应用于慢性粒细胞白血病急变期的治疗.     

全反式维甲酸诱导K562细胞铁代谢变化的研究

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对K562白血病细胞中铁代谢相关基因表达产物(H-Fn、TfR及IRP2)的影响及其相互关系.方法 应用联苯胺、瑞氏、非特异性酯酶、硝基四氮唑蓝还原试验4种染色方法 ,观察ATRA对K562细胞的诱导分化特点;应用流式细胞术检测经ATRA处理后,K562细胞表面抗原CD71及CDl3表达水平的变化;应用RNA/蛋白带移动分析方法 (RNA/protein band-shift assay)检测铁调节蛋白(IRP)的结合活性;采用放射免疫分析法测定K562细胞内铁蛋白含量的变化;采用RT-PCR方法 对ATRA处理的K562细胞H-Fn、TfR及IRP2 mRNA水平的表达进行检测,同时对RT-PCR产物克隆测序.结果 K562细胞经ATRA诱导,出现粒系分化的形态学特征,中幼粒细胞及以后阶段的细胞数明显增多.细胞表面抗原CD71下降而CD13表达升高.ATRA处理组的H-Fn mRNA水平较对照组升高,而IRP2及TfR mRNA减少;处理组IRP结合活性较对照组明显下降,但铁蛋白含量升高.结论 ATRA诱导K562细胞向粒系方向分化过程中,伴有一系列铁代谢相关基因表达产物的改变,其上游调控机制有待进一步探讨.     

降低ATM的表达促进儿童AML细胞增殖和G0/G1向S/G2期细胞转化

目的研究ATM基因在急性髓系白血病细胞(AML)中的表达对细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用定量PCR检测儿童AML白血病细胞中ATM基因的表达情况。采用siRNA转染AML白血病细胞株NB4及K562降低ATM基因的表达。采用CCK-8计数法检测ATM基因对人AML细胞系增殖的影响,采用流式细胞术分析细胞周期情况。结果ATM基因在儿童AML白血病细胞中表达明显降低,与对照组相比差异有显著性(P0.05)。CCK-8检测结果显示,降低ATM基因的表达可以促进白血病细胞增殖,且可以促进白血病细胞细胞周期转变,促进G0/G1期细胞向S及G2期细胞转变。结论儿童AML白血病细胞中ATM基因低表达,抑制ATM基因表达可以促进AML细胞增殖及G0/G1期细胞向S及G2期细胞转变。因此,ATM基因在AML中起"抑癌基因"作用。     

Zebularine对Jurkat、K562细胞p53基因表达的影响

目的了解药物zebularine对白血病细胞株Jurkat、K562细胞p53基因表达的影响,探讨其作用机制及在白血病基因治疗中的价值。方法根据zebularine作用终浓度将白血病细胞株Jurkat、K562各分为3组:对照组、250μmol/L组、500μmol/L组,分别用RT-PCR、Western-blot方法检测Jurkat、K562细胞在药物干预48 h后p53 mRNA和蛋白的表达情况。根据检测结果,探讨其作用机制及应用价值。结果在zebularine干预48 h后,在对照组和250μmol/L组均检测不到p53mRNA表达,而在500μmol/L组中检测到有p53mRNA表达,差异有显著性(P<0.05);6组细胞样品中均检测到p53蛋白表达,在500μmol/L组中表达上升,差异有显著性(P<0.05)。结论Zebularine可促进Jurkat、K562白血病细胞株p53的表达,并有一定的浓度依赖性,提示zebula-rine的干预激活了p53的表达,为zebularine治疗白血病提供了实验室依据。     

甲状腺激素T3诱导K562细胞铁蛋白表达与细胞凋亡和生长的关系

目的：探讨甲状腺激素T3对K562细胞铁蛋白表达及其对细胞凋亡和增殖的影响。方法：收集各组细胞胞浆蛋白，用放射免疫法检测铁蛋白含量，并和流细胞术分析各组细胞凋亡百分率及细胞周期变化。结果：中等浓度及高浓度的T3均能增加K562细胞铁蛋白表达。与空白对照相比有显著性差异（P＜0．05），且随T3浓度增加，铁蛋白的表达亦增高。同一浓度T3与K562细胞共培养，随时间延长，铁蛋白表达增加，与空白对照相比具有显著性差异（P＜0．01）。24h培养组细胞凋亡率较空白对照略有下降，差异有统计学意义，72h培养组T3＝200nM时凋亡百分率明显下降。T3各处理组中S＋G2期细胞比例较空白对照组明显减少（P＜0．01），且72h各组G2＋S细胞百分率较24h明显下降。结论：甲状腺激素T3能诱导K562细胞铁蛋白表达增加，且能干预细胞凋亡和细胞增殖周期。     

槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响

目的 观察槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用以及对相关基因表达的影响,探讨槐耳清膏联合羟基脲抗白血病作用的效果及分子作用机制.方法 取体外培养、对数生长期的白血病细胞株K562细胞用于实验研究;应用四甲基偶氮唑盐比色法和细胞形态学观察槐耳清膏联合羟基脲对体外培养的K562细胞的增殖抑制作用;应用流式细胞术观察槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞的凋亡诱导作用;采用RT-PCR技术检测K562细胞bcr-abl、bax和bcl-xl mRNA表达水平的变化.结果 槐耳清膏单用及联合羟基脲均对K562细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用,且两药联合应用具有协同作用;两药单独应用均可不同程度下调bcl-xl mRNA的表达并上调bax mRNA的表达,联合应用时具有协同作用;槐耳清膏亦可下调bcr-abl mRNA的表达,而羟基脲对其表达无明显影响,两药联合对bcr-abl mRNA表达未见有协同作用.结论 槐耳清膏可协同羟基脲抑制K562细胞增殖及诱导K562细胞凋亡;槐耳清膏诱导K562细胞凋亡可能与下调K562细胞bcr-abl, bcl-xl mRNA的表达并上调bax mRNA的表达有关;槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞的抑制增殖和诱导凋亡的协同作用机制可能与两药协同下调bcl-xl mRNA的表达并上调bax mRNA的表达有关,而两药联合应用的协同作用机制并不是通过调节bcr-abl mRNA表达而实现的.     

二烯丙基二硫诱导人白血病K562细胞凋亡及其对Fas、FasL及caspase-8表达的影响

目的：探讨二烯丙基二硫（DADS）诱导白血病 K562 细胞凋亡的作用及其机制。方法：采用 Hoechst 33258 染色法观察细胞凋亡形态学变化;流式细胞术分析不同浓度及不同作用时间 DADS 对 K562 细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR法检测DADS作用48 h后 Fas、FasL、caspase-8 mRNA的表达。结果：DADS可诱导K562 细胞凋亡。DADS(作用细胞24 h)浓度从10 mg/L增至40 mg/L时,其对K562细胞的凋亡率由（11.60±0.83）%增至（37.94±0.87）%;DADS(40 mg/L浓度组)作用时间从24 h增至72 h,其对K562细胞的凋亡率由（37.94±0.87）% 增至（47.02±0.66）%,各实验组随时间、浓度增加凋亡率明显增加 (P<0.05)。DADS作用48 h后,Fas、caspase-8 mRNA 表达水平较对照组上调;FasL mRNA 较对照组下调（P＜0.05）。结论：DADS 呈时间和浓度依赖性诱导白血病K562 细胞凋亡,其凋亡机制可能与上调 Fas、caspase-8,下调 FasL有关。     

甲基化抑制剂对CEM细胞EphB4基因表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨甲基化抑制剂5-氮杂-2'脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine,5aza-CdR）对人急性淋巴细胞白血病细胞株CEM中抑癌基因EphB4的转录调控作用及对CEM细胞增殖凋亡的生物学影响,为寻找肿瘤治疗新靶点提供实验依据。方法：采用亚硫酸氢盐修饰后测序法检测EphB4基因甲基化水平,荧光定量PCR法(Q-PCR)和Western blot方法检测5-aza-CdR处理前后EphB4基因mRNA及蛋白表达水平;MTS法检测不同剂量(1.0、2.5、5.0 μmol/L) 的5-aza-CdR作用于CEM细胞0 h、24 h、48 h、72 h、96 h对CEM细胞存活率的影响,流式细胞仪分析5-aza-CdR作用96 h对CEM细胞周期及凋亡的影响。结果：CEM细胞中存在EphB4基因的甲基化,甲基化水平为31.4%;不同浓度5-aza-CdR作用后CEM细胞甲基化水平均下降。5-aza-CdR作用使CEM细胞中EphB4 基因的mRNA和蛋白表达上升;5-aza-CdR明显抑制CEM细胞增殖,并与药物浓度及作用时间呈正相关。5-aza-CdR处理 96 h后,早期凋亡由4.1%上升为24.8%。用药96 h后,CEM细胞G1期由62.4% 降至46.8%,G2期由2.1%升至16.2%,细胞阻滞于G2期。结论：特异性甲基化转移酶抑制剂5-aza-CdR能使CEM细胞中沉默的EphB4基因重新表达,并可抑制白血病细胞增殖和诱导其凋亡。     

Islet cell transplantation

Islet transplantation has become a promising treatment for selected patients with type 1 diabetes. Here we provide an overview of the procedure including its history, the process of donor selection, and the techniques and procedures involved in a successful transplant. A brief overview of the current immunosuppressive regimens, the long-term follow-up and the reported outcomes will also be discussed. While islet transplantation is currently generally reserved for adults with type 1 diabetes with severe hypoglycemia or glycemic lability, we herein consider the possibility of its application to the pediatric population.     

Beta cell nesidioblastosis

Two patients with severe hypoglycemia since birth are described. In both hyperinsulinism was demonstrated during spontaneous hypoglycemic attacks or could be provoked by various tolerance tests. In case I considerable obesity and psychomotor retardation was present at the age of one year whereas in case II weight gain was normal and development unaffected.Immunofluorescence microscopic and electron microscopic examination of the pancreas after subtotal pancreatectomy revealed diffuse islet cell hyperplasia with nesidioblastosis in case I and -cell nesidioblastosis in case II. The hyperplastic and nesidioblastotic areas consisted mainly of -cells. In addition, an accumulation of somatostatin producing cells was observed in case I, and some cells were found with ultrastructural signs of both endocrine and exocrine function.In both cases, pancreatic insulin release was inhibited by a prolonged somatostatin infusion. The results of tolerance tests did not allow a diagnosis of the underlying pancreatic lesion. In case II, leucine-sensitive hypoglycemia detected soon after birth, was present even after subtotal pancreatic resection.Therapeutic trials with diazoxide in case I and a leucine-restricted diet in case II were only of temporary benefit. After subtotal pancreatectomy there was clinical improvement in both cases, but case II still needs a leucine-restricted diet. The familial occurrence of persistent hypoglycemia in both cases suggests that -cell nesidioblastosis may be a hereditary disorder.With support of the Landesamt für Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen     

Expression of cell cycle-related gene products in Langerhans cell histiocytosis

BACKGROUND The pathogenesis of Langerhans cell histiocytosis (LCH), a disease characterized by an abnormal accumulation of the dendritic Langerhans cells, is still unknown. Based on the monoclonality of the CD1a+ cell and reports of familial clustering, it is hypothesized that a genetic alteration at a cellular level may be causative. This genetic change may have an effect on the cellular mechanisms controlling proliferation and apoptosis.MATERIALS AND METHODS LCH-lesions were studied for the expression of Ki-67, present in the nucleus of proliferating cells. Furthermore, the expression of cell cycle-related gene products TGF-beta receptor I and II, MDM2, p53, p21, p16, Rb, and Bcl2 were studied. The TGF-betaR genes play a role in tumor suppression, whereas Bcl2 inhibits apoptosis. The remaining genes are part of either the p53-p21 and/or p16-Rb pathways, which induce cell cycle arrest or apoptosis in response to DNA damage.RESULTS In 30 biopsies the diagnosis of LCH could be confirmed on the basis of CD1a positivity (27 bone and 3 skin). All cases showed scattered nuclear-positive staining for the proliferation marker Ki-67. In more than 90% (n >/=27) of these cases, expression of TGFbeta receptor I and II, MDM2, p53, p21, p16, Rb, and Bcl2 was detected in lesional LCH cells. The overexpression was in general heterogeneous, ranging from limited focal staining of scattered cells within the lesion to strong diffuse staining.CONCLUSIONS These findings suggest that the cellular mechanisms that sense and respond to DNA-damage, namely the p53-p21 pathway and the p16-Rb pathway, are activated. The expression of Ki-67 indicates that the cells in LCH are proliferating. The observed overexpression of Bcl2 may play a role in the activation of p53 and p16 and/or the arrest of apoptosis.     

神经母细胞瘤细胞系血细胞分化抗原的表达

神经母细胞瘤(NB)是儿童最常见的颅外实体瘤，预后相对较差。NB细胞系是由形态和生化特性多样的细胞群组成。NB细胞系从形态可分为三种类型的细胞：神经母细胞型(N型)、许旺细胞型(S型)和中间型(I型)。