Smad6信号干扰对MSCs骨向分化中Smad5及Smurf1基因表达的影响

目的研究在骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)骨向分化中Smad6信号干扰对Smad5、Smurf1基因表达的影响。方法培养小鼠骨髓MSCs,并分为3组:A组为对照细胞;B组细胞用携带绿色荧光蛋白(GFP)的空白载体病毒转染+BMP-2骨向诱导;C组细胞用Smad6重组RNA干扰载体转染+BMP-2诱导。结果病毒转染后GFP在MSCs中有效表达,病毒转染效率接近100%。与A组比较,BMP-2诱导24h显著提高了B组Smurf1 mRNA水平(P<0.01);而Smad6信号干扰在两个时间点则进一步提高了C组Smurf1 mRNA水平,并显著高于B组(P<0.01)。C组磷酸化的Smad5(pSmad5)和Smurf1水平在两个时间点也显著高于B组(P<0.01),而Smad5蛋白水平则未受影响。结论在BMP-2诱导的MSCs骨向分化中,Smad6 RNA干扰可促进Smad5磷酸化,并引起Smurf1基因表达代偿性增高。     

Smad6信号干扰对MSCs骨向分化的影响

目的研究Smad6信号干扰对骨形态发生蛋白2（BMP-2）诱导的骨髓间充质干细胞（MSCs）骨向分化的促进效应。方法培养小鼠MSCs,用BMP-2诱导骨向分化。细胞分为3组：A组细胞用携带绿色荧光蛋白（GFP）的Smad6重组RNA干扰载体转染;B组细胞用空白载体转染;C组细胞作为对照。结果病毒转染后GFP在MSCs中有效表达,病毒转染效率达98．5％。与B组比较,Smad6RNA干扰显著提高了A组细胞AIP活性和骨钙素水平（P〈0．01）,而C组ALP活性和骨钙素水平均显著低于其他2组（P〈0．01）。茜素红染色显示,A组矿化结节数目显著多于B组（P〈0．05）,而c组无矿化结节形成。结论Smad6RNA干扰可有效促进BMP-2诱导的MSCs骨向分化,该研究为骨组织工程中骨缺损修复提供了一个极具价值的手段。     

人脐血MSCs的分离培养及向神经的诱导分化

目的探讨人脐血中分离所得到间充质干细胞（MSCs）向神经组织细胞诱导分化的实验条件。方法淋巴细胞分离液分离正常人脐血单个核细胞,利用差速消化法通过多次传代得到MSCs,流式细胞仪测定细胞表型。取2至4代的MSCs加入含有维甲酸（RA）与神经生长因子（NGF）的诱导分化培养基将其定向诱导,免疫细胞化学染色检测诱导后的MSCs神经元和神经胶质细胞标志的表达。结果脐血MSCs每传一代,细胞数量增加约2～3倍。流式细胞仪检测,脐血MSCs不表达CD34,表达CD25、CD29、CD105、CD106。诱导后的细胞不仅形态类似神经元和神经胶质细胞,而且表达神经丝蛋白200（NF）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）。结论从人脐血中可以分离得到与骨髓相似的MSCs,并且能够在体外分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞。     

RNA干扰PPAR-α基因表达对HepG2细胞部分脂代谢信号及炎症因子IL-6的影响

目的研究RNA干扰抑制PPAR-α基因表达对Hep G2部分脂代谢信号及炎症因子IL-6影响。方法在脂质体lipofectamineTM2000介导下将PPAR-αsi RNA瞬时转入人肝细胞癌Hep G2细胞,用RT-PCR方法检测转染效率及转染后LPL m RNA、IL-6m RNA、CPT-1 m RNA的表达变化。结果成功转染PPAR-αsi RNA后,与空白对照组比,转染试剂组Hep G2细胞LPL m RNA表达增高（0.002605±0.000213 vs 0.003920±0.000324,P〈0.05）、CPT-1m RNA表达稍降低（2.25831±0.06151 vs 2.06625±0.05091）,差异无统计学意义,IL-6m RNA表达显著增高（0.01604±0.00118 vs 0.02458±0.001718,P〈0.01）。结论在人肝细胞癌Hep G2细胞中抑制PPAR-α基因表达可促进LPL m RNA、IL-6 m RNA表达,促进脂蛋白酯酶合成而诱发炎症,但对线粒体氧化途径的关键酶CPT-1表达无明显影响。     

5-Aza-dC及TSA对人小细胞肺癌细胞系中hMLH-1基因表达的影响

目的：探讨5-Aza—dC及TSA对人小细胞肺癌细胞系中抑癌基因基因表达的影响。方法：5-Aza—C及TSA处理体外培养的人小细胞肺癌细胞系NCI—H446,应用逆转录PCR（RT-PCR）方法检测人小细胞肺癌细胞系NCI—H446药物干预前后抑癌基因hMLH-1表达情况的变化。结果：NCI-H446细胞系经TSA,5-Aza—dC及联合作用后使原来不表达的抑癌基因hMLH-1重新表达或表达增强。结论：hMLH-1基因的异常甲基化是肺癌发生、发展过程中的频繁事件。肺癌细胞系中抑癌基因hMLH-1启动子甲基化可能是导致其基因失活的主要原因,5-Aza-dC单独作用和5—Aza—dC及TSA联合应用效果相似,均能显著增强甲基化的肿瘤抑制基因的重新表达。     

柚皮苷在促大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化过程中对丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

目的 分析补肾活血治则指导下柚皮苷促进骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化及骨段迁移修复能力。方法 对60只6月龄双侧卵巢摘除术后12周的大鼠,行单侧胫骨水平切开术,处死后,在无菌条件下取其双侧股骨和胫骨,进行传代培养。培养的第1、2、3、5、7、9、11 d,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定并绘制生长曲线,探讨大鼠MSCs增殖能力。采用MTT法检测第三代MSCs(生长状态良好)被柚皮苷(浓度：10^-8mol/L、10^-7mol/L、10^-6mol/L、10^-5mol/L、10^-4mol/L)干预后的吸光度(A)值,筛选最优促增值浓度,确认柚皮苷诱导MSCs向成骨细胞分化的能力。结果 MTT法测定生长曲线成S形,培养第3天后呈对数生长,第9天后进入平台期。不同浓度柚皮苷对MSCs增殖影响及磷性磷酶酶(ALP)染色阳性细胞表达率两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 柚皮苷可促进实验大鼠骨髓基质细胞的分化与增殖,增加骨钙素的表达,改善卵巢切除大鼠的骨质疏松...     

硫酸氨基葡萄糖对ATDC5细胞分化和细胞外基质基因表达的影响

目的研究硫酸氨基葡萄糖对软骨细胞株ATDC5增殖分化及细胞外基质基因表达的影响。方法将软骨细胞株ATDC5分为硫酸氨基葡萄糖组(A组)和空白对照组(B组)。阿利新蓝染色检测蛋白多糖(GAG)含量,碱性磷酸酶染色(ALP)检测碱性磷酸酶活性,逆转录-聚合酶链反应检测Col2及Smad2、Runx2等。结果硫酸氨基葡萄糖抑制了碱性磷酸酶的活性及Smad2和Runx2基因的表达,促进了GAG的合成与Col2基因的表达。结论硫酸氨基葡萄糖不仅促进软骨基质的合成,同时也影响软骨细胞株ATDC5分化。     

5-Aza-CdR对HT29细胞DLC-1基因表达及生物学行为的影响

目的 研究去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)对人结肠癌HT29细胞株牛物学行为及肝癌缺失基因1(DLC-1)表达的影响.方法 5-Aza-CdR处理HT29细胞72 h;RT-PCR检测DLC-1 mRNA的表达;MTT、平板克隆实验、Transwell小室实验分别检测药物处理前后的HT29细胞增殖、侵袭、迁移能力的变化.结果 经5-Aza-CdR作用后,HT29细胞DLC-1恢复表达,细胞增殖活性降低,侵袭能力与迁移能力下降.结论 5-Aza-CAR可抑制HT29细胞增殖、侵袭、迁移,可能与DLC-1基因恢复表达有关.     

黄芪总黄酮对高血压大鼠肾脏TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的：研究黄芪总黄酮对自发性高血压大鼠肾脏的影响以及其可能的机制。方法：原发性高血压大鼠20只,随机均分为模型组和黄芪总黄酮治疗组,10只正常SD大鼠为正常对照组。取正常大鼠、原发性高血压大鼠及黄芪总黄酮治疗后的原发性高血压大鼠的肾脏,进行免疫组织化学染色和蛋白印迹实验,观察黄芪总黄酮对高血压大鼠TGF-β1、Smad2/3、Smad7的影响。结果：模型组与正常组比较,大鼠肾脏免疫组织化学染色及蛋白印迹显示TGF-β1、Smad2/3的表达显著升高（P<0.01）,Smad7的表达显著降低（P<0.01）;黄芪总黄酮治疗组与模型组比较, TGF-β1、Smad2/3的表达显著降低（P<0.01）,Smad7的表达显著升高（P<0.01）。结论：黄芪总黄酮对高血压大鼠肾脏TGF-β1/Smad信号通路有显著影响,黄芪总黄酮可能通过调节TGF-β1/Smad信号通路产生了对高血压大鼠肾脏的保护作用。     

桂郁金对肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的:探讨桂郁金对肝纤维化的作用机制。方法:用血小板衍生生长因子(PDGF)诱导肝星状细胞HSC-T6活化,随后采用桂郁金醇提取物进行干预;采用ELISA法测定细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量,采用半定量RT-PCR法检测细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3 m RNA的表达水平。结果:与空白组相比,模型组中上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量明显增高(P0.01),TGF-β1、Smad2、Smad3 m RNA的表达均呈现显著增高(P0.01);与模型组相比,桂郁金醇提取物低浓度组、高浓度组上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量均有所下降(P0.05),TGF-β1 m RNA的表达水平存在差异(P0.05),Smad3 m RNA的表达水平在高浓度组中存在差异(P0.05)。结论:桂郁金可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通络,起到抗肝纤维化的作用。     

中药川贝对哮喘模型小鼠气道重塑及TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的：观察中药川贝对哮喘模型小鼠气道重塑及转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad信号通路的影响,探讨其治疗哮喘的作用机制。方法：BALB/c小鼠,随机分为正常组、模型组、高剂量组、低剂量组、阳性对照组。除正常组外,其他各组用卵蛋白（OVA）建立小鼠哮喘模型。造模成功后高剂量组和低剂量组分别按18.0 mg·kg^-1和9.0 mg·kg^-1剂量给予中药川贝灌胃;阳性对照组雾化吸入0.5 mg·kg^-1地塞米松;正常组和模型组等量生理盐水灌胃,每天 1次,连续28 d。观察各组小鼠支气管管壁厚度和平滑肌厚度的变化以及支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞（EOS）计数的变化;酶联免疫吸附剂测定（ELISA）检测BALF和血清中TGF-β1浓度;蛋白印记分析（Western-blot）检测肺组织TGF-β1、磷酸化Smad2（p-Smad2）、Smad2、磷酸化Smad3（p-Smad3）、Smad3的表达;实时荧光定量PCR（Real Time-PCR）检测肺组织TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA的表达。结果：模型组小鼠支气管管壁厚度和平滑肌厚度,BALF中EOS计数,BALF和血清中TGF-β1浓度,肺组织TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3的表达,肺组织TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA的表达均明显高于对照组（P<0.01）,高剂量组,低剂量组和阳性对照组上述指标则明显低于模型组（P<0.05或P<0.01）。结论：中药川贝可改善哮喘模型小鼠气道重塑状态,其机制可能与其抑制TGF-β1/Smad信号通路有关。     

巴戟天多糖对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化的影响

目的通过观察巴戟天多糖对骨髓间充质干细胞骨髓间质干细胞(BMSCs)增殖和骨向分化的影响。方法利用髓贴壁法分离培养BMSCs,并通过形态学、流式细胞仪检测细胞表面标志物以鉴定所取得的细胞;采用细胞计数(CCK-8)法检测不同浓度巴戟天多糖对BMSCs增殖情况的影响;对硝基苯磷酸盐法(p NPP)检测不同浓度巴戟天多糖对BMSCs碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,以确定其最佳促分化的剂量。后续实验分空白组、巴戟天多糖组、成骨诱导组,在培养第7,14,21天分别收集各组细胞上清液,检测其ALP活性;培养第21天采用茜素红染色法检测各组BMSCs矿化情况。结果随着培养时间的延长,巴戟天多糖高、中浓度组可显著提高BMSCs的增殖(P0.05),其中高浓度组效果最佳。与空白组相比,巴戟天多糖组可提高BMSCs上清液中ALP活性(P0.05),增加其矿化结节数(P0.05)。结论巴戟天多糖能促进BMSCs的增殖及向成骨细胞分化的能力。     

3种牙髓生物活性材料对小鼠间充质干细胞骨向分化的影响

目的 评估3种牙髓生物活性材料——三氧化聚合物（MTA）、Bioaggregate（BA）和Biodentine（BD）的生物相容性并观察其各自对小鼠间充质干细胞（MSCs）向成骨分化的影响。方法 采用XTT实验和ALP染色检测小鼠MSCs生存能力、分化矿化能力,观察MTA、BA及BD对小鼠MSCs向成骨分化的影响。结果 BD的细胞生存能力在浓度1、1/2、1/4时明显低于MTA和BA（P<0.001）,3种材料的细胞生存能力在材料浓度降至1/10和1/50时,差异无统计学意义（P>0.05）。MTA、BA和低浓度BD在显示分化矿化能力的ALP染色检测方面,与对照组相比染色值均升高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 MTA、BA以及低浓度BD与小鼠MSCs有良好的生物相容性;MTA、BA和低浓度BD在小鼠MSCs向成骨方向分化过程中有促进分化矿化作用,可以作为根管的根尖封闭材料。     

微小 RNA-218-5p靶向 Jagged 1调控人牙周膜干细胞的活性和骨向分化

目的 研究微小RNA-218-5p(miR-218-5p)对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)活性和骨向分化的影响并探讨其机制,为牙周炎的治疗提供研究基础.方法 将anti-miR-218-5p组(转染anti-miR-218-5p)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-JAG1组(转染pcDNA-JAG1)、anti-miR-218-5p+si-NC组(共转染anti-miR-218-5p和si-NC)、anti-miR-218-5p+si-JAG1组(共转染anti-miR-218-5p和si-JAG1),用脂质体法转染至hPDLSCs细胞;运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中miR-218-5p、Ⅰ型胶原蛋白(Col-1)、骨钙素、Runt相关转录因子2(Runx2)的表达;蛋白质印迹法(Westrn blotting)检测细胞中Jagged 1(JAG1)的蛋白表达;MTT法检测细胞活性;茜素红染色实验检测细胞的矿化结节;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性.结果 与anti-miR-NC组相比,anti-miR-218-5p组hPDLSCs细胞培养48、72 h时,细胞活性升高[48 h:(0.44±0.04)比(0.62±0.06);72 h:(0.53±0.05)比(0.83±0.08);P<0.001],细胞的矿化结节明显升高,Col-1[(0.26±0.03)比(0.74±0.07)]、骨钙素[(0.21±0.02)比(0.54±0.05)]、Runx-2[(0.29±0.03)比(0.61±0.06)]蛋白相对表达量均显著升高(均P<0.001).与pcDNA组相比,pcDNA-JAG1组hPDLSCs细胞培养48、72 h时,细胞活性显著升高[48 h:(0.42±0.04)比(0.59±0.05);72 h:(0.55±0.05)比(0.81±0.08);P<0.001],Col-1[(0.34±0.03)比(0.71±0.07)]、骨钙素[(0.23±0.02)比(0.48±0.04)]、Runx-2[(0.25±0.03)比(0.56±0.05)]蛋白表达量均显著升高(均P<0.001).miR-218-5p可靶向调控JAG1的表达.抑制JAG1可逆转抑制miR-218-5p对hPDLSCs的活性和骨向分化作用.结论 抑制miR-218-5p可促进人牙周膜干细胞活性和骨向分化,其机制与靶向JAG1有关.     

神经生长因子诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化过程中相关基因表达的研究

目的 通过检测神经生长因子(NGF)定向诱导神经干细胞(NSC)分化为胆碱能神经元过程中Neurod、Hes1基因的表达变化,探讨NSC的定向诱导分化机制.方法 Wistar大鼠海马形成原代克隆球后传代第3代检测.应用不同浓度(5,10,50,100 μg/L)的NGF对NSC进行诱导分化.免疫荧光检测胆碱乙酰转移酶(ChAT)的表达.实时定量聚合酶链反应(PCR)分析NSC诱导分化1周时Neurod、Hes1基因的表达变化.结果 培养获稳定状态的NSC,并具有多向分化能力.NSC经不同浓度的NGF诱导1周后,免疫荧光检测ChAT阳性率最高25％,50 μg/L NGF具最显著的诱导作用.实时定量PCR技术检测50 μg/L组NeuroD mRNA的达量最高[(1.010±0.024)];高于其他各低浓度组[5μg/L(0.130 ±0.013),10 μg/L(0.510±0.016)],差异有统计学意义(P＜0.01);Hes1 mRNA的表达量在50 μg/L组最低[(0.080±0.010)],低于各低浓度组[5 μg/L(0.220 ±0.014),10μg/L(0.130±0.012)],差异有统计学意义(P＜0.05).结论 ①在体外环境下 NGF具有较强的诱导NSC向胆碱能神经元分化的作用.②Neurod和Hes1基因的表达变化与NGF诱导NSC向胆碱能神经元的分化过程密切相关,改变bHLH正负调控基因的表达的平衡点可能对NSC分化为胆碱能神经元有重要调控作用.     

特异性免疫治疗对哮喘大鼠转化生长因子-β1／Smad信号通路的影响

目的：探讨特异性免疫治疗（specificimmunotherapy,SIT）对哮喘大鼠转化生长因子-β1（TGF-β1）及信号转导分子Smads表达的影响。方法：40只健康雄性清洁级Wistar大鼠随机均分成正常对照组、哮喘组、SIT对照组和SIT治疗组等4组,每小组10只。通过卵蛋白（OVA）雾化吸入的方法对致敏大鼠进行SIT,用双抗体夹心ELISA法测定血清和BALF中TGF—目浓度,免疫组化方法检测肺组织TGF-β1以及磷酸化Smad2／3（P—Smad2／3）、Smad7蛋白表达水平。结果：哮喘组和SIT治疗组的血清、BALF中TGF-β1．浓度均分别高于正常对照组,但SIT治疗组与哮喘组相比,两者的TGF-β1浓度则均有所下降;哮喘组肺组织TGF-β1和P—Smad2／3蛋白表达较正常对照组和SIT治疗组增高,而Smad7蛋白表达下降。结论：SIT通过抑制哮喘大鼠体内TGF-β1和P-Smad2／3的过度表达及上调Smad7,从而阻断TGF-β1的胞内信号转导,可在一定程度上减轻哮喘大鼠气道炎症和抑制气道重塑的发生发展。     

特异性免疫治疗对哮喘大鼠转化生长因子-β1／Smad信号通路的影响

目的：探讨特异性免疫治疗（specific immunotherapy,SIT）对哮喘大鼠转化生长因子-β1（TGF—β1）及信号转导分子Smads表达的影响。方法：40只健康雄性清洁级Wistar大鼠随机均分成正常对照组、哮喘组、SIT对照组和SIT治疗组等4组,每小组10只。通过卵蛋白（OVA）雾化吸入的方法对致敏大鼠进行SIT,用双抗体夹心ELISA法测定血清和BALF中TGF-β1浓度,免疫组化方法检测肺组织TGF-β1以及磷酸化Smad2／3（P—Smad2／3）、Smad7蛋白表达水平。结果：哮喘组和SIT治疗组的血清、BALF中TGF—β1浓度均分别高于正常对照组,但SIT治疗组与哮喘组相比,两者的TGF-β1浓度则均有所下降;哮喘组肺组织TGF-β1和P-Smad2／3蛋白表达较正常对照组和SIT治疗组增高,而Smad7蛋白表达下降。结论：SIT通过抑制哮喘大鼠体内TGF—β1和P—Smad2／3的过度表达及上调Smad7,从而阻断TGF-β1的胞内信号转导,可在一定程度上减轻哮喘大鼠气道炎症和抑制气道重塑的发生发展。     

白花丹醌对大鼠肝星状细胞活性氧及TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的研究白花丹醌对大鼠原代分离肝星状细胞(HSC)活性氧(ROS)水平、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7蛋白表达的影响。方法分离原代大鼠HSC,接种活化期HSC,进行α-SMA免疫荧光鉴定,分为空白组、TGF-β1组、NADPH氧化酶抑制剂组(DPI)、白花丹醌低、中、高剂量(2、4、8μmol·L~(-1))组。MTT检测白花丹醌对HSC增殖的影响;显微镜下观察白花丹醌对HSC形态学的影响;荧光探针法测定HSC内ROS表达水平;Western blot检测HSC中Smad2/3、p-Smad2/3和Smad7蛋白表达。结果经α-SMA免疫组织荧光鉴定,阳性率达91%,表明获得高纯度的大鼠原代HSC。MTT测定白花丹醌最佳给药浓度为2、4、8μmol·L~(-1);DPI组和白花丹醌各浓度组可不同程度下调HSC内ROS的表达;Western blot结果显示,与模型组比较,DPI和白花丹醌给药组Smad2/3、p-Smad2/3的蛋白表达降低,Smad7蛋白表达增加。结论白花丹醌可能是通过下调ROS水平,进而降低Smad2/3和p-Smad2/3的表达,从而发挥抗HSC活化的作用。     

辛伐他汀对成骨细胞分化和成骨基因的影响

目的 探讨辛伐他汀对成骨细胞分化及成骨基因表达的影响.方法 选取成骨肉瘤细胞株 MG-63,采用不同浓度辛伐他汀（0.0625、0.125、0.25、0.5和 1.0 μmol/L）处理成骨细胞,ALP活性检测辛伐他汀对成骨细胞分化作用的影响;实时定量 RT-PCR和免疫印迹检测细胞成骨基因 mRNA的表达.结果 通过不同浓度辛伐他汀处理成骨细胞后,不同浓度辛伐他汀组与对照组比较,成骨细胞ALP 活性差异均有统计学意义 （ P〈0.05）,其中 0.25 μmol/L 浓度组作用对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响最为显著.采用 0.25 μmol/L辛伐他汀处理成骨细胞后,辛伐他汀组与对照组比较,成骨细胞骨钙蛋白、ALP、I型胶原 mRNA表达差异均有统计学意义 （ P〈0.05）.结论 辛伐他汀可能通过上调成骨基因mRNA的表达水平来促进其分化,这为他汀类药物治疗骨质疏松症提供新的干预靶点.