人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的：研究人胚胎神经干细胞的培养条件及体外分化情况。方法：从12周龄人胚胎脑皮质分离细胞，采用无血清培养技术，协同应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(ECF)和重组人白血病抑制因子(rhLIF)进行培养；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记检测细胞的增殖能力，间接免疫荧光化学法检测细胞的分化情况。结果：培养得到的大量半悬浮生长的神经干细胞球能够传代培养；BrdU标记阳性，可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论：人胚胎脑皮质分离细胞培养得到的细胞群具有神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

神经干细胞的分离培养及体外分化

目前 ,脊髓损伤的修复和治疗 ,仍然是一个难以解决的世界性难题。虽然在动物实验中已取得了一些令人鼓舞的进展 ,但至今未找到一种能用于临床的有效方法。神经干细胞(neuralstemcells ,NSCs)的发现为中枢神经系统 (centralner voussystem ,CNS)损伤修复及某些疾病的治疗带来了新的希望。因其具有很强的分裂、增殖和自我更新能力 ,人们把它视为中枢神经系统移植和替代治疗的理想材料。近年来神经干细胞的研究作为生命科学界的热点受到广泛关注。本文就神经干细胞的分离、培养及其体外分化作一综述 ,重点在于人神经干细胞的研究。1　啮齿动…     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性粘附、分离和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论:运用Ⅳ型胶原粘附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。     

人表皮干细胞的体外分离和培养

目的:建立人表皮干细胞的体外分离和培养体系的方法,探索表皮干细胞体外大量扩增的途径.方法:采用0.375%的DispaseⅡ和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,采用MTF法筛选表皮细胞基础培养基和表皮细胞生长因子(epidermal growthfactor,EGF)的最适浓度,建立表皮干细胞培养的干预体系.逐日观察培养的细胞呈表皮干细胞样的形态,免疫组化方法检测β1整合素和角蛋白19的表达.结果:以表皮细胞数量和活性作指标,不同浓度EGF干预条件细胞活性不同,以15 ng/mL EGF的无血清SFM培养液为最适培养液,可使细胞呈表皮干细胞克隆样生长,β1整合素和角蛋白19表皮干细胞活性表达呈阳性.结论:采用0.375%的Dispase Ⅱ和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,以15 ng/mL EGF的无血清SFM培养液培养,此方法是一种简便、快速、经济的表皮干细胞分离和培养的方法.     

人胚神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

目的 探讨人胚神经干细胞（hNSC）移植治疗脊髓损伤（SCI）的可行性。方法 分离、培养和鉴定hNSC；用5溴-2脱氧尿苷嘧啶（BrdU）标记hNSC，并将其移植到14只T10半横断的Wistar大鼠损伤脊髓内（另外14只T10半横断损伤的大鼠作为对照组，仅损伤脊髓内注射DMEM／F12培养液），用BrdU的FITC免疫荧光染色检测移植细胞的存活和迁徙，用NF-200、GFAP免疫组织化学鉴定移植细胞的分化，BBB评分评定大鼠功能恢复情况。结果 （1）获得了大量的hNSC；（2）用免疫组织化学可以检测到移植的hNSC能在体内长时间存活（达2个月）并向远处迁徙，并分化为神经元和胶质细胞；（3）检测到实验组大鼠BBB得分明显高于对照组大鼠（P〈0．01），在SCI后第10周时实验组和对照组BBB得分最大差距达到2．1分。结论 hNSC移植能促进SCI大鼠后肢功能恢复，它是SCI移植治疗较有价值的细胞资源。     

人表皮干细胞的体外分离与培养

目的 探索人表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）的分离方法和培养体系。方法 用Ⅳ型胶原纯化、富集ESCs，将黏附细胞（实验组）和未黏附细胞（对照组）分别接种在Ⅳ型胶原摹质（实验组为A1，对照组为A2）和3T3细胞滋养层（实验照组为B1，对照组为B2），培养体系为：低糖无钙DMEM培养基（添加10％胎牛血清、表皮生长因子10μg／L、氯化钙0．05mmol／L、氢化可的松0．8mg／L），观察细胞能否呈克隆状生长，用流式细胞仪和免疫细胞化学染色，对ECSs周期和表型进行分析。结果 实验组细胞呈克隆状生长，G0／G1期细胞和α6^briCD71 dim细胞百分率明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05），实验组角蛋白19免疫细胞化学染色呈阳性，对照组呈刚性。结论 人ESCs可通过Ⅳ型胶原快速黏附分选，并可在适当的培养体系里扩增。     

长期培养人胚神经干细胞对兔脊髓损伤的修复作用

[目的]观察长期培养人胚神经干细胞（hNSCs）的体外生长特性与转染EGFP基因后移植治疗兔脊髓横切损伤模型在体内的生物学活性及对神经结构修复和功能恢复的影响。[方法]体外分离、培养并鉴定hNSCs，用逆转录病毒介导的增强绿色荧光蛋白基因（EGFP）进行转染；制备兔T9全横断脊髓损伤模型；观察hNSCs移植对脊髓损伤后神经结构修复和功能恢复的影响。[结果]从胎龄10～20周的新鲜人胚脑皮层中成功分离出神经干细胞，该细胞具有连续克隆传代能力，诱导分化后表达分化细胞的特异抗原。本实验室已成功连续培养10个月（17代），转染EGFP基因后，仍保持未分化状态，能够自我更新形成新的神经球；移植入兔SCI模型后，hNSCs能在体内存活、迁移、分化并增殖。与对照组相比，hNSCs移植组明显促进了脊髓神经的再生、结构的修复和下肢运动功能的恢复。[结论]hNSCs移植促进了脊髓损伤后神经结构的修复和功能的恢复，是治疗急性脊髓损伤的一种有效方法。     

大鼠胚胎脊髓神经干细胞的分离培养及其向神经细胞的诱导分化

目的 分离培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞（SNSCs），研究其体外增殖分化的特点，模拟大鼠胚胎时期脊髓发育的微环境诱导SNSCs向神经细胞定向分化。方法显微机械分离孕10～11d胚胎大鼠脊髓神经干细胞，无血清悬浮培养，以复合添加剂N4定向诱导分化，并拍照记录不同时期细胞分化的形态；用不同荧光剂进行细胞免疫荧光染色，并计算阳性细胞的平均分化比例。结果 显微机械分离SNSCs方法，所分离的SNSCs具有较高的增殖能力，经复合添加剂N4诱导可以分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞。结论采用显微机械分离SNSCs方法简单、效率高，N4添加剂可以高效诱导SNSCs分化为神经细胞，且分化的细胞中神经元比例高。     

Lentivirus介导表达多基因的人胚基因工程神经干细胞的实验研究

目的：探索以Lentivirus为载体，构建同时携带并表达多基因的基因工程人胚神经干细胞(human neural stem cell，hNSC)的可行性，为脊髓损伤治疗的研究提供材料。方法：培养和鉴定hNSC：用携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)和神经营养因子-3(neurotrophic factor-3，NT-3)的Lentivirus转染hNSC；用荧光显做镜观察、鼠胚背根神经结培养(dorsal root ganglion，DRG)和Slot blot等方法检测基因工程hNSC的多基因表达情况。结果：培养获得了大量的hNSC；荧光显微镜观察到几乎100％的hNSC表达GFP：基因工程hNSC的培养液能促使大鼠DRG旺盛生长；Slot blot检测到基因工程hNSC能高效分泌NT-3蛋白。结论：以Lentivirus为载体能构建同时携带并稳定表达多基因的基因工程hNSC．为脊髓损伤治疗的基础研究及进一步临床应用提供了有价值的细胞资源。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养和分化的研究

目的探讨脊髓源性神经干细胞的培养方法和体外分化特性. 方法从孕龄15天的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清限定性培养基培养并进行干细胞体外分化,细胞免疫荧光化学方法鉴定分化结果. 结果胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,培养10天左右可获得干细胞球;用细胞免疫荧光化学法鉴定干细胞分化,可见其中含有神经元和星形胶质细胞. 结论无血清限定性培养基是脊髓源性神经干细胞的良好培养基;脊髓源性神经干细胞体外可诱导分化为神经元和神经胶质细胞.     

人脐血CD133+血管内皮祖细胞的培养、鉴定与分化研究

目的探讨从人脐血中分离、体外培养CD133^＋血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及其生长特性和鉴定。方法采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133^＋细胞,进行流式细胞仪检测纯度,予EBM-2培养液接种培养,观察其生长特性;利用Dil-LDL及FITC-Lectin摄取实验、细胞免疫组织化学等进行鉴定。结果经流式细胞仪检测CD133^＋细胞平均占单核细胞的（1．13±0．10）％,磁珠分选所得CD133^＋细胞平均纯度为（91．45±1．04）％;CD133^＋细胞贴壁生长,可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落;CD133^＋细胞培养过程中Dil-LDL及FITC-Lectin摄取阳性,双染阳性率为（95．83±1．72）％;CD133^＋细胞培养1周后经免疫组织化学检测CD34、Ⅷ因子阳性率分别为（95．83±2．23）％和（95．92±1．43）％,与人脐静脉内皮细胞比较差异无统计学意义;CD133^＋细胞体外培养4d、1周可形成小血管结构。结论免疫磁珠分选法可获取较高纯度CD133^＋血管内皮祖细胞,在生长因子作用下诱导其分化为成熟血管内皮细胞。     

人诱导性多能干细胞的无饲养层培养及鉴定

目的：探索人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）的无饲养层培养方法,并对此方法培养的iPSCs进行鉴定。方法将人iPSCs接种于玻璃粘连蛋白（Vitronectin XF）包被的培养皿上培养,采用EDTA消化传代。倒置显微镜下观察iPSCs的生长状态;碱性磷酸酶（ALP）染色鉴定;采用PCR和免疫荧光检测iPSCs多能性基因SSEA?1、Nanog、Sox2的表达情况。结果倒置显微镜下可见iPSCs呈典型的克隆状生长,克隆呈圆形或椭圆形,边界清晰、整齐;ALP染色结果阳性;PCR结果显示人iPSCs强表达多能性基因SSEA?1、Nanog、Sox2;免疫荧光结果显示多能干细胞特异性指标SSEA?1、Nanog、Sox2均呈阳性。结论无饲养层培养体系培养人iPSCs,细胞能稳定增殖,保持自我更新潜能及多能性。     

小鼠胚胎神经干细胞的长期培养和分化

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和分化条件,为神经干细胞的深入研究奠定基础。方法：无菌条件下分离小鼠胚胎脑皮质,制成单细胞悬液,种植在N2培养基中培养,培养基中加入20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（每次实验用1－2只小鼠胚胎,实验重复8次）。采用机械方法传代,常规方法冻存和复苏。用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。结果：成功培养出小鼠的神经干细胞,神经干细胞呈悬浮状态生长,形成典型的神经球。细胞表达巢蛋白和波形蛋白2种神经干细胞的标志物。细胞在胎牛血清的诱导下,可分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,它们所占的比例分别为7％、85％－90％和2％－4％。结论:鼠的神经干细胞可以在体外稳定地培养和传代,为细胞治疗提供了一个理想的细胞来源。     

胆管癌干细胞的分离、培养及鉴定

目的:从人胆管癌细胞系QBC-939中分离具有干细胞特征的肿瘤细胞,为后续胆管癌干细胞的研究提供材料。方法:用无血清培养法及流式细胞分选法从QBC-939细胞中分离得到具有干细胞特征的CD133+Ep CAM~(high)干细胞样细胞,继续在无血清培养基中培养,观察其成球能力,并比较CD133+Ep CAM~(high)干细胞样细胞与QBC-939细胞单克隆形成率、耐药性,增殖能力,干细胞相关核转录因子OCT-4、Bmi-1、E-cadherin蛋白表达情况,以及BALB/c小鼠皮下移植后的成瘤能力。结果:在无血清培养基中,CD133+Ep CAM~(high)干细胞样细胞具有较强的成球能力。与QBC-939细胞比较,CD133+Ep CAM~(high)干细胞样细胞克隆形成率、洛铂耐药性、增殖明显增加;干细胞相关核转录因子OCT-4、Bmi-1表达明显增加,而E-cadherin表达明显降低;皮下移植瘤形成率明显增加。以上差异均有统计学意义(均P0.05)。结论:从人胆管癌QBC-939细胞中分离的干细胞样细胞具有肿瘤干细胞特性,可用于胆管癌干细胞的研究。     

小鼠羊水间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的  探讨小鼠羊水间充质干细胞（AF-MSC）的分离、培养及鉴定。方法  在无菌条件下获取孕鼠子宫,收集羊水后进行过滤和离心,对沉淀细胞团进行培养并传代。观察AF-MSC的形态,分析AF-MSC的增殖特点,采用流式细胞术鉴定AF-MSC的表面标志物,检测AF-MSC的三系分化能力及冷冻复苏后的细胞活力。结果  小鼠AF-MSC呈典型的梭形,融合度 > 80%时会出现典型的漩涡状结构。小鼠AF-MSC传代培养无明显潜伏期,培养2~3 d进入对数增长期,增长速度最快,之后增殖速度减慢,进入平台期。AF-MSC表达干细胞抗原（Sca）-1、CD29、CD44,不表达CD34、CD45。小鼠AF-MSC成骨分化后,矿化结晶被茜素红染成深红色的点状;成软骨分化后,分泌的酸性粘多糖被阿利新蓝染成淡蓝色;成脂分化后,胞质脂滴被油红O染成红色。细胞冷冻复苏后存活率 > 95%,生长状态良好,6 d时增殖能力高于冻存前（P < 0.05）,其他时间增殖能力与冻存前比较,差异无统计学意义（均为P > 0.05）。结论  本实验成功分离了小鼠AF-MSC,过程简便、成本低,且分离的细胞可随传代次数的增加而纯化,冻存不影响其增殖能力。     

大鼠胚胎肝干细胞的分离、鉴定及转染绿色荧光蛋白基因的研究

目的 分离、培养大鼠胚胎肝干细胞,检测肝干细胞表面标志CD49f,c-Met,建立携带示踪标记的大鼠肝干细胞.方法 Percoll梯度离心法分离孕14 d大鼠胚胎肝细胞,体外培养后采用流式细胞术(FACS)检测CIM9f和c-Met,pAcGFP1-N1质粒提取并经电泳鉴定后用脂质体法转染细胞.结果 成功分离并纯化了孕14 d大鼠胚胎肝细胞;CIM9f和c-Met阳性细胞的比例分别为65.0%和85.9%;电泳鉴定质粒正确,成功转染细胞后荧光显微镜观察到大量表达绿色荧光蛋白(GFP)的肝干细胞.结论 从孕14 d大鼠胎肝中成功分离并鉴定肝干细胞,成功转染pAeGFP1-N1质粒,建立携带稳定表达GFP示踪标记的大鼠肝干细胞.     

表皮干细胞的分离培养和鉴定

目的分离培养和鉴定人表皮基底层干细胞。方法中性蛋白水解酶选择性的消化表皮与真皮之间的细胞连接,采用改良的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法分离、培养表皮中的干细胞,观察培养第2、4、6天时a6、β1整合素、K19、K14、p63、Nestin、CD34、PCNA及K10在表皮干细胞中的表达差异。结果改良过的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法能够有效地促进表皮干细胞的贴壁和伸展。原代分离的表皮基底层干细胞a6、β1整合素,K19,K14,p63,Nestin,CD34及PCNA表达为强阳性而K10不表达。这些细胞具有干细胞的特点,可以形成克隆。随着培养时间的增加,表皮干细胞形态发生变化,a6、β1整合素、K19、K14,表达逐渐减弱,K10表达逐渐增强。此外,在原代分离的细胞中可见单个核样干细胞表达a6、β1整合素,K19,K14,p63,Nestin,CD34及PCNA,这些细胞形态相似体积较表皮基底层干细胞大,胞核为肾形,染色较深。结论中性蛋白水解酶消化合并改良过的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法能够高效地分离表皮中的干细胞。分离的细胞具有干细胞的特点,可以形成集落。此外,原代分离培养的表皮干细胞中仍然可见单个核样干细胞,这些细胞形态相似,类似血液系统来源的单核细胞,胞质内均匀分布着粗大的阳性颗粒。单个核样干细胞可能与皮肤的发生、发育以及创伤修复有关。     

Isolation and primary culture of urothelial cells from normal human bladder

Summary Trypsinization (WT) was employed to disaggregate urothelial cells from normal human urinary bladder mucosa for the preparation of primary cultures. Urinary bladders of two male adults both 25 years old were obtained autopsy 1–2 h after death. The mucosa was incubated in HBSS containing 0.25% trypsin at 37°C. Mean cell yield, viability, and attachment were 14.6×10⁷, 76%, and 42.5% after WT. In histologic sections of treated mucosa, most of the urothelium was removed by WT. Following plating and attachment, cells obtained by WT formed a monolayer of flattened epithelial-like cells. When stained with polyclonal antikeratin antibody using the indirect immunoperoxidase technique, all of the cells were immunoreactive indicating an epithelial origin. In conclusion, based on morphology and immunocytochemistry, WT removed virtually all of the urothelial cells from the mucosa and no contamination by mesenchymal cells resulted from this procedure. Thus, WT is an appropriate technique for the isolation of urothelial cells and initiation of primary cultures of normal human urothelial cells for subsequent study.This work was supported by NIH Grant CA-28013     

BALB/c小鼠精原干细胞长期培养和移植的实验研究

目的 建立小鼠精原干细胞(SSC)长期培养体系,探讨SSC体外增殖分化的关键因子.方法 收集出生4～6 d BALB/c绿色荧光小鼠睾丸,采用改良两步消化法获得细胞悬液,3次差速贴壁去除体细胞获得富集的精原细胞,采用添加生长因子的无血清基础培养液重悬,种植到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养.基础培养液为StemPro-34 SFM干细胞培养基并补充15种添加成分;生长因子为10 ng/ml碱性成纤维细胞因子、20 ng/ml胶质细胞源性神经营养因子和200 ng/mlGDNF家族受体a1.取4～5周龄BALB/c雄性小鼠15只,腹腔注射40 mg/kg的白消安建立受体模型,采用三维显微注射系统将培养的SSC移植到受体左侧睾丸精曲小管内,右侧睾丸作为自身对照;分别采用体视荧光显微镜观察和HE染色检测细胞移植后睾丸生精功能恢复情况.结果 改良消化富集法消化后细胞活性>98%,SSC富集约18.5倍.饲养层培养1～2 d后细胞成对称或线形排列,细胞间可见明显的胞质桥连接.3～4 d后精原细胞增殖形成典型的克隆,为边缘不清楚的团块;小鼠SSC能在该培养体系中稳定培养、传代3个月.移植后2个月,体视荧光显微镜下受体睾丸内可见明显绿色阳性克隆,HE染色证实移植的SSC在受体睾丸内克隆增殖并分化产生成熟的精子.结论 成功建立了BALB/c小鼠SSC培养体系,为研究SSC增殖分化调控机制及SSC移植治疗男性不育提供了实验依据.