注射用清开灵冻干粉体外抗菌活性研究

目的：研究注射用清开灵冻干粉对临床分离致病菌的体外抗菌活性。方法：注射用清开灵冻干粉与市售清开灵注射液作比较，采用二倍稀释法，测定注射用清开灵冻干粉浓缩液对临床分离的47株致病菌的最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（憾），观察注射用清开灵冻干粉体外抗菌活性。结果：对金葡菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢菌、肺炎克雷伯菌，注射用清开灵冻干粉与市售清开灵注射液均显示出良好的体外抗菌活性，注射用清开灵冻干粉体外抗菌活性强于市售清开灵注射液。按药液稀释度计算，注射用清开灵冻干粉浓缩液对金葡菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢菌、肺炎克雷伯菌的MIC和MBC分别为市售清开灵注射液的1／4-1／2。结论：注射用清开灵冻干粉对临床分离的致病菌，具有较好的抗菌活性，且略优于市售清开灵注射液。     

HMGN2分离制备及其趋化性研究

目的:建立分离天然HMGN2的方法并研究其抗菌性与对中性粒细胞的趋化活性。方法:5%高氯酸对子宫纤维囊腺瘤组织进行萃取,萃取物通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)直接进行分离,Tricine-SDS-PAGE,AU-PAGE和Western-Blot对蛋白分子进行鉴定,采用Transwell实验检测HMGN2对中性粒细胞的趋化性。结果:分离出高纯度的HMGN2,HMGN2对大肠杆菌有杀菌活性但HMGN2在体外不能趋化中性粒细胞运动。结论:建立简单、直接分离高纯度的天然HMGN2的方法,有助于对其进一步研究,我们发现HMGN2对大肠杆菌有杀菌活性但它不能通过趋化中性粒细胞发挥作用。     

人T-bet基因的表达、纯化及其免疫原性分析

目的：利用载体pQE30在大肠埃希菌（M15）原核表达人T-bet基因全长序列，并对表达产物进行纯化、免疫动物和制备多克隆抗体。方法：利用PCR技术从克隆载体pGEM-T／T-bet获得人T-bet的全长编码序列，并将其亚克隆至原核表达载体pQE30，形成重组表达质粒pT-bet；酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌JM109，测序鉴定后转化M15，经IPTG370C诱导4h后，SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色判断以包涵体形式存在的带有6×His标签的融合蛋白（表达产物），用Ni^2＋ -IMAC层析柱对融合蛋白进行纯化；将纯化的蛋白免疫BALB／c小鼠，制备人T-bet的多克隆抗体。结果：成功表达和纯化了人T-bet，并制备了多克隆抗体，ELISA和Western blot结果显示了血清抗体的高效价（1：100000）和高度特异性。结论：成功构建了原核表达载体pT-bet，并在工程菌M15中获得大量表达，经纯化后获得高纯度的人T-bet蛋白，制备了效价和特异性良好的多克隆抗体，为进一步研究T-bet的生物学功能奠定了的基础。     

透皮免疫佐剂LTB及LTK63的表达与鉴定

目的 研究新型的透皮免疫佐剂。方法 从大肠埃希菌E．coli H10407中扩增出大肠埃希菌不耐热肠毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）全长基因，并用基因工程的方法表达出了无毒性的A亚单位蛋白LTKA及B亚单位蛋白LTB。将表达产物纯化后用SDS-PAGE、GMI-ELISA等方法进行鉴定。结果 表达的LTB亚单位仍具有和神经节苷脂GMI特异结合的生物学活性，LTK63已经不具有毒素活性。结论 LTB和LTK63有希望成为候选的透皮免疫佐剂。     

注射用头孢拉宗钠的体内外抗菌活性研究

目的评价注射用头孢拉宗钠的体内外抗菌活性。方法选取663株临床分离致病菌为实验菌,以头孢美唑、头孢西丁、头孢替坦、头孢米诺、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢吡肟为对照药物,分别采用平皿二倍稀释法测定药物最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）、绘制杀菌曲线（KCs）并行诱导耐药实验,观察头孢拉宗的体外抗菌作用;建立小鼠腹腔感染模型,评价头孢拉宗皮下给药对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌感染小鼠的体内疗效。结果头孢拉宗对多种革兰阴性菌具有较高的抗菌活性,尤以对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的抗菌活性更为突出,其MIC50、MIC90分别为0.5、8μg/ml,对产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的抗菌活性也较强,其MIC50、MIC90分别为4、8μg/ml;头孢拉宗对革兰阴性菌的抗菌作用大多优于头孢西丁、头孢美唑、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢替坦和头孢呋辛,而对革兰阳性菌的抗菌活性较弱,与头孢替坦和头孢米诺相近。MBC和KCs测定结果表明,头孢拉宗对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌均具有杀菌作用。以1/4MIC剂量诱导20d后,头孢拉宗对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的抗菌活性无明显改变。头孢拉宗皮下给药对大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌1515、肺炎克雷伯杆菌7、肺炎克雷伯杆菌9613感染小鼠的体内疗效明显优于头孢美唑和头孢唑啉（均P〈0.01）;对金黄色葡萄球菌感染小鼠的体内疗效与头孢美唑相近（P〉0.05）,但弱于头孢唑啉（P〈0.01）。结论注射用头孢拉宗钠对多数革兰阴性菌,特别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌具有较强的体外抗菌活性;同时对大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌腹腔感染小鼠的体内疗效也较好。     

医院内泌尿道感染患者的病原菌耐药性分析

目的 了解湖北省襄阳市第一人民医院住院患者泌尿系感染的主要病原菌分布与抗生素对常用菌的 耐药率。方法 回顾性收集湖北省襄阳市第一人民医院2017年1月~12月住院患者1580份尿培养样本,采用全自动微生物鉴定仪480份阳性标本进行鉴定及药敏试验。应用WHONET5.6对数据进行分析。结果 480株病原菌中,革兰阴性杆菌353株（73.54%）,以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌为主;革兰阳性球菌85株占（17.71%）,以肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌为主;真菌40株（8.33%）。检出的病原菌对各种抗生素的耐药率不同,所有分离的大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌对三代头孢菌素和喹诺酮类耐药率均大于50%,并且外科系统分离的大肠埃希菌株耐药率高于内科系统;铜绿假单胞菌对β内酰胺酶抑制剂耐药率大于30%,高于其他病原菌对此类抗生素耐药率。未发现分离的革兰阳性菌对万古霉素和利奈唑胺耐药,凝固酶阴性葡萄球菌对苯唑西林耐药率达82.60%。结论 本院泌尿系统感染中,以大肠埃希菌感染为主,β内酰胺酶抑制剂可用于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌常规治疗。     

HMGN2分子体外抗乙型肝炎病毒活性研究

目的： 我们先前的研究证明HMGN2（high mobility group nucleosomal-binding domain 2）是人LAK细胞抗菌的一个新的效应分子,本研究欲检测其体外抗乙型肝炎病毒的活性。方法: 应用反向高效液相色谱技术从人淋巴结组织酸溶性提取物中分离纯化批量HMGN2分子,用质谱精确分子量测定、Western blotting和抗菌试验对分离纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。采用MTT法检测HMGN2分子对稳定转染复制型HBV重组质粒的肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞的细胞毒性;用不同浓度HMGN2分子作用于HepG2.2.15细胞,分别在第3 d和第6 d收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）,采用实时荧光定量PCR法检测上清液HBV DNA的含量。结果: 从人淋巴结组织中分离纯化获得纯度较高的HMGN2蛋白;在检1-100 mg/L范围内,HMGN2分子对HepG2.2.15细胞无细胞毒性;HMGN2分子在1-5 mg/L水平即可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,可显著降低HBV DNA拷贝数。结论: HMGN2分子在体外具有较强的抗HBV活性。     

2013-2016年广东省腹泻患者致泻性大肠埃希菌病原学监测北大核心CSCD

目的了解广东省腹泻患者致泻性大肠埃希菌（DEC）的感染状况及菌株的血清型分布、药物敏感性和分子特征。方法采集粪便标本进行传统分离培养,对疑似菌株进行多重PCR毒力基因鉴定和生化鉴定,获得阳性菌株进行血清学分型、药物敏感试验和脉冲场凝胶电泳（PFGE）。结果腹泻患者中DEC的总阳性率为6.26%,肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC）、肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）和肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）的阳性率分别为2.47%、1.54%、1.32%、0.62%和0.09%,以0～〈7岁的儿童感染为主。血清分型率为52.54%,EHEC分子血清分型率为15.00%。DEC对亚胺培南、环丙沙星、头孢他啶和头孢噻肟的敏感率较高。DEC多重耐药率为58.45%,EPEC多重耐药现象最严重。广东省腹泻患者ETEC、EHEC、EPEC和EAEC的PFGE图谱呈现高度多态性。结论EPEC是广东地区DEC流行的优势型别,首选三代头孢菌素为儿童感染治疗用药,成人还可选用环丙沙星。DEC多重耐药现象严重,应加强DEC的病原学监测和耐药性监测。     

革兰阴性菌对头孢替坦的耐药性分析

目的了解临床分离革兰阴性菌对头孢替坦的耐药性。方法收集2012年1月至2013年6月从医院各种临床标本中分离的革兰阴性菌,使用VITEK2-compact微生物全自动分析仪进行鉴定和药敏试验,对结果进行回顾性调查。结果分离出革兰阴性菌1 045株,其中肠杆菌科细菌627株,占60.0%;非发酵菌402株,占38.5%。分离前3位的细菌分别为大肠埃希菌（27.7%）、铜绿假单胞菌（20.2%）、肺炎克雷伯菌（14.5%）。肠杆菌科细菌对头孢替坦耐药率低,53.3%的大肠埃希菌和29.6%的肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢替坦耐药率均低于6.0%。非发酵菌中铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对头孢替坦的耐药率均高于90.0%。结论头孢替坦可以作为临床治疗产ESBLs细菌感染性疾病的一种经验性治疗方案。     

新型重组人IFN-λ2的高效表达、纯化与抗病毒活性研究

目的在大肠埃希菌中高效表达重组人干扰素λ2(rhIFNλ2),并对其抗病毒活性进行初步研究。方法根据大肠埃希菌的偏爱密码子人工设计合成人干扰素λ2(hIFNλ2)的高表达基因,将其克隆到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌中进行表达,表达产物经变性、复性、阳离子交换层析及分子筛层析纯化,测定其抗病毒活性、种属特异性及抗HBV活性。结果在大肠埃希菌表达的目的蛋白占细胞总蛋白量的15%左右,纯化后的纯度达到90%以上,在WISH细胞上抗VSV活性约为1.5×106IU/mg。与rhIFNα2b比较,表达产物在非灵长类细胞上的抗病毒活性较在灵长类细胞上弱,目的蛋白在HepG2.2.15细胞上表现有与rhIFNα2b相似的抗HBV活性。结论hIFNλ2可以在大肠埃希菌内实现高效表达,表达产物具有抗病毒活性,有与rhIFNα2b相似的抗HBV活性,本型IFN有较严格的种属特异性。     

HMGN2基因干扰质粒构建及干扰效率测定

目的：构建HMGN2基因的干扰质粒,为深入研究HMGN2基因在信号通路中的作用提供有效手段。方法：根据文献选择两个HMGN2基因的干扰位点,合成两个干扰片段定向克隆到psilencer-4．1的干扰载体并测序验证。将干扰质粒转染至A549细胞,并通过检测RT-PCR产物量以获得干扰效率。结果：RT—PCR产物检测结果显示干扰质粒psilencer-4．1-HMGN2—2干扰效率最高,其HMGN2表达量降低了70％左右。结论：成功构建了对HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer-4．1-HMGN2干扰质粒,为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。     

带标签的高迁移率蛋白N2(HMGN2)重组质粒用于亚细胞定位分析

为进行HMGN2的亚细胞定位分析,提取人LAK细胞总RNA,设计合成相应引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HMGN2cDNA,以pcDNA3.1-myc-his和pEGFP-N1为载体,成功构建出HMGN2真核表达载体,转染HeLa细胞,转染效率达70%~80%,用抗六组氨酸臂的单克隆抗体经免疫细胞化学染色显示经pcDNA3.1-myc-his-HMGN2转染的HeLa细胞除细胞核外,胞浆亦明显着色,未转染的Hela细胞无论细胞核还是细胞浆均显阴性;用兔抗人HMGN2多克隆抗体进行的免疫细胞化学染色显示转染的HeLa细胞与用抗六组氨酸臂的单克隆抗体检测结果相同,而未转染的Hela细胞核内和胞浆也均有着色。用两种抗体行ELISA分析在细胞培养上清亦检测到HMGN2。激光共聚焦显微镜下观察pEGFP-N1-HMGN2转染的HeLa细胞发现绿色荧光主要在核内,但核外也同样存在。本实验结果证明HMGN2不仅存在于细胞核中,而且分布于细胞浆,亦可分泌到细胞外。     

Age and Organ Dependent Variations in the Number of Thymus Derived Rtla Bearing Cells

The identification of a thymus antigen on rabbit cells has made it possible to determine the number and proportion of RTLA (rabbit thymus lymphocyte antigen) bearing thymus derived cells in various lymphoid tissues. In an earlier study, this has been measured by complement mediated cell kill. In this report, the proportion of thymus and bursa-equivalent cells was obtained by means of immunofluorescenf staining. The proportion of RTLA cells is in agreement with that found by cytotoxicity. Age dependent changes in the organ content of RTLA bearing and of Ig bearing cells are described.     

人单核细胞系THP-1中HMGN2的分离纯化及其抗菌活性

 目的 从人单核细胞株THP-1中分离与纯化HMGN2抗菌肽,应用微量琼脂糖弥散法检测抗菌活性,以探讨HMGN2分子的抗菌作用。方法 采用HPLC分离纯化, 琼脂糖弥散法筛选纯化有抗菌活性的组分,用Tricine-SDS-PAGE电泳初步测定其分子质量,以质谱法进行分子质量的精确分析。结果 从人THP-1细胞中分离纯化出HMGN2抗菌肽, 琼脂糖弥散法检测显示其对大肠杆菌氨苄青霉素耐药株ML-35p有较强的抑菌活性,对大肠杆菌标准株ATCC25922和临床分离株54080亦有较强的抗菌活性,而对金黄色葡萄球菌ATCC25923未检测出抗菌活性。结论：HMGN2是一种抗菌分子,可能参与了体内的天然免疫防御作用。     

影响肺炎克雷伯菌粘附上皮细胞作用的研究

目的:研究不同理化及生物因素对肺炎克雷伯菌粘附宿主细胞的影响,探讨其粘附宿主细胞的可能机制。方法:用肺炎克雷伯菌临床分离株K.pnueumoniae 03183(K.p03183)建立粘附宿主细胞模型,通过结晶紫染色及扫描电镜观察其粘附效率;以不同理化及生物因素预处理K.p03183,平板菌落计数法观察上述因素对K.p03183粘附细胞的影响;用基因芯片技术,检测HMGN2蛋白预处理细菌对于其粘附相关基因表达的影响。结果:K.p03183可粘附至A549、T24、HeLa等3种上皮细胞系,其粘附率与E.coli 25992接近;氯化锂和盐酸胍、高碘酸钠及热预处理可明显降低K.p03183对于A549和T24的粘附率(P0.05);同时,胃蛋白酶及HMGN2蛋白预处理K.p03183,也可抑制其对A549和T24的粘附(P0.01);但胰蛋白酶预处理却能增加细菌对于A549细胞的粘附(P0.05);同时,HMGN2还可通过上调dksA基因表达,从而干扰细菌粘附细胞。结论:肺炎克雷伯菌可能借助细胞壁及其表面蛋白和碳水化合物等成分粘附至宿主上皮细胞,通过非共价键结合表面蛋白或消除碳水化合物成分,抑制细菌粘附至宿主细胞。     

人单核细胞株THP-1中HMGN2的分离纯化

目的:从人单核细胞株THP-1中分离与纯化HMGN2抗菌肽,探讨HMGN2分子抗菌作用。方法:采用HPLC分离纯化,琼脂糖弥散法筛选纯化组分的抗菌活性,对活性组分进行Tricine-SDS-PAGE电泳初步测定分子量。结果:从人THP-1细胞中分离纯化出的HMGN2抗菌肽,对致病性大肠杆菌54080有抗菌活性。结论:HMGN2是一种抗菌分子,可能参与了体内的天然免疫防御作用。     

HMGN2: a novel antimicrobial effector molecule of human mononuclear leukocytes?

Leukocytes are a central cellular element of innate-immune defense in mammals. In addition to the generation of toxic oxygen radicals and nitric oxide, leukocytes express and secrete a broad array of antimicrobial proteins and peptides. In the study, an antimicrobial polypeptide was isolated and purified from human peripheral blood mononuclear leukocytes in the presence of interleukin (IL)-2. Microsequencing provided that its N-terminal amino sequence was PKRKAEGDAK, which was identical to high mobility group nucleosomal-binding domain 2 (HMGN2). Mass spectrometric value and Western blot also indicated its individual character of HMGN2. The antimicrobial assays showed that the Escherichia coli-based production of HMGN2 had a potent antimicrobial activity against E. coli ML-35p, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, and to some extent, against Candida albicans ATCC 10231. The HMGN2 alpha-helical domain had the same antimicrobial activity as HMGN2. The immunocytochemistry staining, enzyme-linked immunosorbent assay, and Western blot revealed that HMGN2 was present in the cytoplasm of mononuclear leukocytes and released to the extracellular environment when stimulated with IL-2. These results suggest that HMGN2 would be a novel antimicrobial effector molecule of human mononuclear leukocyte.