复发性外阴阴道念珠菌病患者树突细胞Dectin-1受体的功能研究

目的 对比复发性外阴阴道念珠菌病（RVVC）患者和健康女性树突细胞（DC）表面Dectin-1受体信号传导及功能的差异,分析患者病情反复发作的可能原因。 方法 提取1例RVVC患者和1例健康女性的单核细胞,诱导分化为DC。DC与白念珠菌共培养后,流式细胞仪测定DC表面CD83、CD86和CD80表达水平,分析细胞的成熟率;Western印迹法测定DC的Dectin-1、酪氨酸激酶（Syk）和CARD9蛋白的表达;ELISA法测定DC分泌白细胞介素23（IL-23）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和IL-12水平。 结果 与健康人DC相比,与白念珠菌共培养24 h后,该RVVC患者DC表面CD83、CD86和CD80的表达活化不明显。与健康人DC相比,与白念珠菌共培养2 h后,RVVC患者DC表达的Dectin-1没有显著性差异,但是磷酸化Syk和CARD9活化障碍。与健康人DC相比,与白念珠菌共培养6 h后,RVVC患者DC分泌的IL-23、TNF-α和IL-12升高也不明显。抗人Dectin-1抗体对RVVC患者DC的Syk依赖的信号传导通路和上述细胞因子的分泌都没有进一步抑制作用。 结论 该RVVC患者DC的Dectin-1受体信号传导通路障碍,导致DC成熟率降低,分泌的IL-23、TNF-α和IL-12降低,使得宿主黏膜抗念珠菌感染的天然免疫功能缺陷。     

白念珠菌对人急性单核细胞白血病细胞系产生肿瘤坏死因子α、活化信号分子p38MAPK 的影响

目的：探讨白念珠菌对人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞系）分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）和细胞内信号分子 p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活的影响。方法实时荧光定量 PCR 分析105、106 CFU/ml 灭活白念珠菌及阳性刺激物脂多糖刺激 THP-1细胞1、3、6 h 后 TNF-α mRNA 表达水平变化。40μg/L 地塞米松预先与 THP-1细胞共培养30 min 后,再用106 CFU/ml 白念珠菌、脂多糖刺激6 h 后检测TNF-α mRNA 表达水平。酶联免疫吸附法检测白念珠菌刺激 THP-1细胞24 h 后 TNF-α分泌量。免疫印迹法分析白念珠菌体外作用 THP-1细胞30 min、1 h 后 p38MAPK 和磷酸化 p38MAPK 的水平。结果105 CFU/ml 白念珠菌、106 CFU/ml 白念珠菌、脂多糖刺激 THP-1细胞组以及空白对照组 TNF-α mRNA 表达水平差异有统计学意义（F =110.98,P <0.001）;白念珠菌刺激1、3、6 h 之间差异也有统计学意义（F =701.680,P <0.001）,随培养时间延长,THP-1细胞 TNF-α mRNA 水平增高,呈时间依赖效应。106 CFU/ml 白念珠菌刺激 THP-1细胞后24 h,TNF-α蛋白水平（6385.70±533.99 ng/L）较空白对照组（147.10±0.53 ng/L）明显升高,差异有统计学意义（P <0.01）。106 CFU/ml 白念珠菌作用于 THP-1细胞30、60 min 后磷酸化 p38MAPK 蛋白水平也明显升高。40μg/L地塞米松预先与 THP-1细胞共培养30 min 后,再以106 CFU/ml 白念珠菌刺激6 h 后 TNF-α mRNA 表达水平（3.77±0.62）较未用地塞米松组（208.50±10.50）明显降低,地塞米松可阻断白念珠菌上调 TNF-α mRNA 水平。结论人 THP-1细胞体外与白念珠菌作用后激活信号分子 p38MAPK 并分泌 TNF-α,参与抗念珠菌感染固有免疫反应。     

白念珠菌对人THP-1细胞产生白细胞介素6、活化信号分子IκBα的影响北大核心CSCD

目的 探讨白念珠菌对人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞系）分泌白细胞介素6（IL-6）和细胞内信号分子NF-κB抑制蛋白（IκBα）激活的影响.方法 实时荧光定量PCR分析105、106 CFU/ml灭活白念珠菌刺激THP-1细胞IL-6 mRNA表达水平变化,酶联免疫吸附法检测IL-6分泌量.免疫印迹法分析白念珠菌体外作用THP-1细胞后不同时间IκBα和磷酸化IκBα的水平.结果 105 CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后l、3、6h,IL-6 mRNA水平（2-△△α）分别为1.48±0.06、6.48±0.30、125.34±1.47,刺激3h、6h后明显高于空白对照组（P＜ 0.001）.106 CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后1、3、6h,IL-6 mRNA水平分别为2.96±0.35、8.57±1.27、588.10±2.31,与空白对照组比较,P值分别为0.036、0.001、＜0.001.106 CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后24 h,IL-6蛋白水平为（924.9±30.13） ng/L,与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜ 0.001）.106 CFU/ml白念珠菌作用THP-1细胞后30 min、60 min,磷酸化IκBα蛋白水平显著升高,而IκB α蛋白水平相应降低.结论 人THP-1细胞体外与白念珠菌作用后激活信号分子NF-κB并分泌IL-6,参与抗念珠菌感染固有免疫反应.     

TGF-β1对巨噬细胞抗白念珠菌活性影响的实验研究

目的：探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）对巨噬细胞（MΦ）抗白念珠菌活性的影响及其影响机制。方法：分离纯化小鼠腹腔巨噬细胞，与不同浓度重组人TGF-晶（rhTGF-晶）共同培养24h，收集上清，酶联免疫法测定TNF—α浓度，Griess反应法测定NO的活性；收集培养后的细胞与一定浓度的白念珠菌共同培养4h后，检测每毫升中白念珠菌菌落形成单位（cfu／mL）。结果：rhTGF-β1在10n/mL及100ng／mL时，对MΦ抗白念珠菌活性具有明显抑制作用（P〈0．05），而其在0．1ng／mL-100ng/mL时对MΦ产生TNF—α具有明显抑制作用（P〈0．05）；rhTGF-β1在1ng／mL-100ng／mL时，对MΦ产生NO具有明显促进作用（P〈0．05）。结论：rhTGF-β1可以抑制MΦ的抗白念珠菌活性，这种抑制作用可能与rhTGF-β1抑制MΦ的杀伤活性和影响MΦ的分泌功能有关。     

肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 方法 取对数生长期人单核细胞株U937,采用佛波酯诱导48 h后,分为3组, Mφ组（继续用佛波酯诱导48 h）、M1组（用25 mg/L LPS诱导48 h）、M2组（用15 μg/L IL-4诱导48 h）。酶联免疫吸附试验检测各组巨噬细胞上清中IL-12p70和IL-10表达水平。建立巨噬细胞与恶性黑素瘤A375细胞体外共培养体系,分别设单独培养组、Mφ组（A375细胞和Mφ巨噬细胞共培养）、M1组（A375细胞和M1型巨噬细胞共培养）、M2组（A375细胞和M2型巨噬细胞共培养）,分别运用噻唑蓝法、Transwell小室法观察不同激活途径的巨噬细胞对A375细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。 结果 增殖实验显示,共培养48、72 h后Mφ巨噬细胞、M2型巨噬细胞显著促进A375细胞的增殖,M1型巨噬细胞抑制A375细胞的增殖,各处理组间两两比较,差异有统计学意义（均P < 0.05）,共培养24 h后各组间两两比较A375细胞增殖率差异无统计学意义（P > 0.05）。侵袭实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（147.00 ± 7.92、113.22 ± 8.15）较单独培养组（84.11 ± 6.07）明显增加（P < 0.05）,M1组穿膜细胞（56.44 ± 7.55）明显减少（P < 0.05）。迁移实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（198.33 ± 8.22、156.00 ± 8.83）较单独培养组（123.89 ± 7.01）明显增加（均P < 0.05）,M1组穿膜细胞（97.11 ± 6.75）明显减少（P < 0.05）。 结论 IL-4激活的M2型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起促进作用;脂多糖激活的M1型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起抑制作用。佛波酯诱导的巨噬细胞更倾向于M2型巨噬细胞表型。     

补体受体3在小鼠巨噬细胞识别马尔尼菲青霉中的作用

【摘要】 目的 探讨补体受体3（CR3）在小鼠巨噬细胞识别马尔尼菲青霉中的作用。方法 以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为靶细胞,分别与马尔尼菲青霉灭活分生孢子、灭活酵母细胞、活分生孢子、活酵母细胞在37 ℃,5% CO2培养箱中共同培养1 h后,逆转录PCR检测CR3 mRNA的表达,Western印迹检测CR3蛋白的表达,流式细胞仪检测吞噬率,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测共培养上清中细胞因子水平。siRNA靶向下调巨噬细胞CR3的表达后与马尔尼菲青霉灭活分生孢子共培养,按照前述方法检测吞噬率及各细胞因子水平。采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析（ANOVA）检测各组间指标差异。结果 RAW264.7细胞与马尔尼菲青霉灭活分生孢子、灭活酵母细胞、活分生孢子、活酵母细胞共培养后, 四组之间比较,CR3 mRNA、蛋白表达差异均无统计学意义（P > 0.05）,吞噬率分别为95.14%、89.56%、91.03%、90.78%,各组之间差异无统计学意义（P > 0.05）;共培养后,白介素（IL）2、干扰素（IFN）γ等Th1型,IL-4、IL-10等Th2型细胞因子均呈不同程度升高,但四个共培养组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。siRNA靶向下调CR3表达后,RAW264.7细胞与马尔尼菲青霉共培养,其对马尔尼菲青霉的吞噬率下降为10.89%,与未干扰组比较,差异有统计学意义（P < 0.05）;同时,巨噬细胞分泌细胞因子的水平与未干扰组比较下降。结论 CR3为巨噬细胞识别、介导吞噬马尔尼菲青霉的模式识别受体之一;IL-2、IFN-γ Th1型,IL-4、IL-10 Th2型细胞因子可能均参与巨噬细胞抗马尔尼菲青霉感染免疫。 【关键词】 巨噬细胞; 马尔尼菲青霉; 受体,补体; 疾病模型,动物     

CHK1 shRNA-617与卯巢癌Skov3细胞放疗敏感性的研究

目的：本研究以shRNA干扰CHKl在卵巢癌Skov3细胞中的表达,观察其2Gy照射后细胞凋亡情况。方法：采用shRNA技术沉默Skov3细胞中CHKl的表达,用流式细胞仪观察细胞凋亡率。结果：X射线照射后4hr和28hr,转染CHKlshRNA的Skov3细胞的凋亡百分数为21．53％±2．51％、15．30％±2．57％,显著高于单纯转染CHKlshRNA-617组（P〈0．05）,显著高于转染shNC＋radiation的Skov3细胞照射组（P〈0．01）,显著高于Control组、shNC组、radiation组（P〈0．001）。结论-沉默Skov3细胞中CHKl的表达,可以明显提高卵巢癌细胞对x射线照射的凋亡敏感性。     

不同来源痤疮丙酸杆菌培养上清对THP-1细胞产生TNF-α、IL-12的影响

目的：探讨不同来源痤疮丙酸杆菌培养上清对单核巨噬细胞株THP-1细胞产生TNF—α、IL-12的影响，明确外伤后细菌性致死性肉芽肿分离菌株与标准株刺激机体产生细胞因子的差别。方法：采用ELISA法、RT—PCR的方法观察标准株与从外伤后细菌性致死性肉芽肿分离株的培养上清对THP-1细胞产生TNF—α和IL-12的影响。结果：（1）痤疮丙酸杆菌培养滤液可促进THP-1细胞产生TNF—α和IL-12，和空白对照组相比有显著性差异（P〈0．05），标准株较临床株有较强的刺激THP-1产生TNF—α的能力；（2）所有培养上清均能促进THP-1细胞产生IL-12，标准株较外伤后细菌性致死性肉芽肿分离株培养滤液的刺激THP-1细胞产生IL-12作用弱（P〈0．05）。结论：不同来源痤疮丙酸杆菌培养上清均可促进THP-1细胞产生TNF—α、IL-12，但其能力不同，说明不同来源痤疮丙酸杆菌刺激机体早期免疫应答水平不同。     

Notch-RBP-J信号通路对小鼠黑素瘤细胞B16F10与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7共培养巨噬细胞极化影响的研究北大核心CSCD

目的 探讨小鼠黑素瘤细胞B16F10与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7共培养中Notch-RBP-J信号通路对巨噬细胞表型分化的影响.方法 设计针对CBF1/RBP-Jκ基因的siRNA编码序列,转染至小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞.实验分4组：沉默前共培养组,B16F10细胞与RAW264.7细胞共培养;沉默后共培养组,B16F10细胞与RBP-Jκ基因沉默后的RAW264.7细胞共培养;空白对照组,单独培养的RAW264.7细胞;阳性对照组,白细胞介素4刺激诱导的RAW264.7细胞.Western印迹法、ELISA法及流式细胞仪检测各组巨噬细胞的表型;RT-PCR法检测各组notch1、notch2、DLL1、DLL4及Hes1的表达.采用SPSS17.0软件进行重复测量方差分析及单因素方差分析、线性趋势检验、Bonferroni两两比较.结果 Western印迹结果显示,RAW264.7与B16F10共培养不同时间后,RAW264.7细胞的CD163在空白对照组、共培养24 h、48 h、72 h组、阳性对照组的相对表达量分别为1.016±0.018、1.274±0.034、2.065±0.094、3.615±0.144、3.099±0.071,经单因素方差分析（n=4）,F=527.42,P＜ 0.01,共培养后RAW264.7细胞CD163表达量较空白对照组增加;ELISA检测结果显示,共培养24、48、72 h,RAW264.7细胞培养上清液白细胞介素10的水平分别为（167.610±3.527）、（433.433±5.558）、（679.673±8.101） ng/L.沉默后共培养24、48、72 h,RAW264.7细胞培养上清液白细胞介素10表达量分别为（63.403±0.856）、（103.427±2.072）、（202.297±3.610） ng/L,较未沉默时降低（F=8.01,P＜ 0.05）.Western印迹法及流式细胞仪分别检测沉默后共培养RAW264.7细胞CD163、CD206的表达量,均较未沉默时减少（P＜0.05）.RT-PCR示,沉默后共培养组较沉默前共培养组及对照组的Notch信号通路相关基因mRNA表达均降低.结论 沉默Notch-RBP-J信号通路后共培养组中RAW264.7细胞向M2型极化较未沉默共培养组减少,总体表型仍为M2型;该通路的活化促进RAW264.7细胞向M2型极化.     

ATP1通过调节氧化应激促进白念珠菌逃逸巨噬细胞杀伤的研究

【摘要】 目的 通过反向遗传学方法，探索白念珠菌F1Fo?ATP合酶α亚基编码基因（ATP1）通过清除细胞内活性氧以逃逸巨噬细胞杀伤的生理作用。方法 以白念珠菌ATP1缺失株及其亲本株为研究对象，接种平板培养后计算菌落数评估其体外细胞活性，通过尾静脉接种小鼠后计算肾脏组织形成菌落数评估体内细胞活性。将培养过夜的白念珠菌菌液与巨噬细胞共培养后，接种平板，计算菌落数，测定菌的存活率，通过乳酸脱氢酶释放法测定巨噬细胞乳酸脱氢酶水平；以过氧化氢建立模拟巨噬细胞内氧化应激模型，过氧化氢作用白念珠菌后，通过计算菌落数比较各菌株细胞活性，采用DCFH?DA染色测定细胞内活性氧水平，实时荧光定量PCR检测过氧化氢酶1（CAT1）基因、超氧化物歧化酶4（SOD4）基因和超氧化物歧化酶5（SOD5）基因mRNA水平。采用双因素方差分析或Student t检验对数据进行统计学分析。结果 在体外，亲本株组和ATP1缺失组菌落数随培养时间逐渐增多，24 h后ATP1缺失组菌落数仅为亲本株组的10%，差异有统计学意义（F = 481.84，P < 0.001）。在小鼠体内，亲本株组肾脏组织形成菌落数随时间逐渐增多，但是ATP1缺失组逐渐减少，两组差异有统计学意义（F = 78.27，P = 0.001）。与体内实验结果一致，体外白念珠菌菌体与巨噬细胞共培养后，ATP1缺失组白念珠菌存活率（62.67 ± 3.51）%比亲本株组（82.33 ± 2.52）%显著降低（t = 7.88，P = 0.001），与ATP1缺失组共培养的巨噬细胞乳酸脱氢酶释放百分比（27.80 ± 3.54）%比与亲本株组共培养的巨噬细胞（87.78 ± 0.17）%显著降低（t = 33.89，P < 0.001）。在模仿的巨噬细胞内氧化应激模型中，ATP1缺失组细胞活性比亲本株组显著降低，差异有统计学意义（F = 3 440.65，P < 0.001）。在与巨噬细胞共培养以及模仿的巨噬细胞内氧化应激模型中，ATP1缺失组细胞内活性氧水平均比亲本株组显著增高，差异有统计学意义（均P < 0.001）。ATP1缺失组CAT1、SOD4、SOD5 mRNA水平均比亲本株组降低，差异均有统计学意义（均P < 0.001）。结论 ATP1缺失可能分别通过下调氧化应激和活性氧清除相关基因表达，使白念珠菌抵抗氧化应激和清除活性氧的能力明显减弱，最终不能逃逸巨噬细胞杀灭而被宿主清除。     

Toll样受体与抗白念珠菌感染

Toll样受体蛋白家族属于动物模式识别受体家族,对天然免疫和获得性免疫都有调控作用.与抗白念珠菌感染免疫有关的主要是Toll样受体2和4.Toll样受体2和4可以分别识别病原体,也可以与其他的Toll样受体以二聚体的形式参与识别,或者与其他模式识别受体,如Dectin-1、甘露糖受体等共同识别.免疫细胞表面Toll样受体识别白念珠菌后主要通过MyD88依赖的信号传递途径.激活白细胞的趋化作用,增强吞噬细胞的吞噬、杀伤功能,促进相关细胞因子的释放,从而起到抗白念珠菌的作用.     

白念珠菌诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞焦亡的初步研究

【摘要】 目的 探讨白念珠菌对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）焦亡的影响。方法 通过活细胞工作站实时观察白念珠菌［感染复数（MOI） = 50,下同］体外诱导BMDM后是否发生焦亡;将BMDM分为对照组、白念珠菌组,分别用磷酸盐缓冲液和白念珠菌酵母诱导BMDM 6 h,实时荧光定量PCR检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 （NLRP3）、白细胞介素1β （IL-1β）、IL-18 mRNA表达水平,Western印迹法检测NLRP3、胱天蛋白酶1（Caspase-1）、Gasdermin D（GSDMD）的表达及剪切水平。用白念珠菌诱导BMDM不同时间（0、10、15、20及25 h）后,酶联免疫吸附试验检测IL-1β、IL-18分泌水平。白念珠菌体外诱导野生型（WT）BMDM及 GSDMD 敲除（KO）BMDM 15 min,采用流式细胞仪比较WT、GSDMD KO BMDM对白念珠菌的吞噬率;诱导6 h后,采用流式细胞仪及乳酸脱氢酶（LDH）释放法分别检测WT、GSDMD KO BMDM的死亡率。分别设置空白对照组、对照组、样品最大酶活性对照孔组、IL-1β组、白念珠菌组、IL-1β + 白念珠菌组,用IL-1β和/或白念珠菌酵母诱导BMDM后用LDH释放法分析WT及GSDMD KO BMDM死亡率。采用非配对t检验、Kruskal-Wallis 检验、方差分析等统计学方法进行统计分析。结果 白念珠菌体外诱导BMDM后细胞可出现气球样变及出泡现象,证实焦亡发生;与对照组相比,白念珠菌组诱导BMDM 6 h后NLRP3、IL-1β的mRNA表达水平明显升高（t = 13.02、17.51,P = 或＜0.001）,而IL-18 mRNA表达水平无明显变化（P = 0.486）,且白念珠菌诱导可引起炎症小体NLRP3表达增多及Caspase-1、GSDMD剪切。白念珠菌诱导BMDM不同时间（0、10、15、20及25 h）后IL-1β的分泌水平随时间逐渐升高（H = 12.90,P = 0.012）,而IL-18的分泌水平无明显变化（F = 0.48,P = 0.753）,且GSDMD KO组BMDM的IL-1β分泌水平低于WT BMDM组（F = 24.22,P = 0.008）。白念珠菌体外诱导15 min后,GSDMD KO BMDM［（50.3 ± 1.10）%］对白念珠菌的吞噬率低于WT BMDM［（58.53 ± 1.19）%,t = 5.09,P = 0.007］;白念珠菌体外诱导6 h后,流式细胞仪检测显示GSDMD KO组BMDM的死亡率（38.40% ± 0.50%）高于WT组BMDM（34.37% ± 0.52%）,t = 4.72,P = 0.009;LDH检测同样显示GSDMD KO BMDM的死亡率（22.52% ± 0.18%）高于WT BMDM（12.48% ± 0.15%）,t = 42.36,P＜0.001;IL-1β预处理后予白念珠菌体外诱导的WT BMDM及GSDMD KO BMDM 的细胞死亡率均较单纯白念珠菌诱导组降低（均P＜0.001）。结论 白念珠菌可诱导BMDM发生焦亡,焦亡的发生可促进IL-1β释放,并通过提高巨噬细胞的免疫活性,降低巨噬细胞死亡率。     

白念珠菌与培养人角质形成细胞的相互作用及其分子机理

目的 研究白念珠菌与培养人角质形成细胞直接作用的形态学、生物学反应及其分子机理。方法 （1）将白念珠菌孢子（或煮沸灭活的白念珠菌孢子,直径3.2μm的乳胶颗粒）加入角质形成细胞培养系统中定时用扫描和透射电镜观察;（2）用荧光法和计数法测定白念珠菌等与角质形成细胞共同培养上清液对角质形成细胞生长的影响;（3）用ELISA法测定白念珠菌或乳胶颗粒与角质形成细胞共同培养上清液和角质形成细胞内液中细胞因子的含量。结果 （1）发现与角质形成细胞粘附的白念珠菌随时间经过而增加。灭活的白念珠菌几乎不发生粘附,乳胶颗粒与角质形成细胞粘附后被吞噬,角质形成细胞伸出很多纤维样结构与菌体或乳胶颗粒粘附;92）白念珠菌与角质形成细胞共同培养液在50%浓度下可显著促进角质形成细胞增殖,灭活的白念珠菌或乳胶颗粒与角质形成细胞共同培养液对角质形成细胞增殖有一定的促进作用;（3）白介素1α在白念珠菌或乳胶颗粒与角质形成细胞共同培养液对角质形成细胞增殖有一定的促进作用。（3）白介素1α在白念珠菌与角质形成细胞共同培养上清液中增高,但细胞内液中下降,转化生长因子-α和碱性成纤维细胞生长因子在上清液及细胞内液中水平均增高。结论 角质形成细胞具有非特异性吞噬功能,白念珠菌与角质形成细胞作用可刺激角质形成细胞释放细胞因子,引起炎症反应和细胞生长。     

下调垂体瘤转化基因对皮肤鳞状细胞癌细胞SCL-1细胞增殖及迁移能力的影响

目的 研究下调垂体瘤转化基因（PTTG）的表达对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）细胞SCL-1细胞增殖及浸润转移能力的影响,探讨其相关的分子机制。方法 将SCL-1细胞分为三组（未处理组、转染对照siRNA组及转染PTTG siRNA组）,首先利用CCK-8试剂盒研究下调PTTG对SCL-1细胞增殖能力的影响,并利用Boyden chamber研究三组细胞的浸润转移能力,通过实时荧光定量PCR和Western印迹方法检测MMP-2和MMP-9在三组细胞中的表达。结果 与未处理组和转染对照siRNA组相比,转染PTTG siRNA后能明显抑制SCL-1细胞增殖（P < 0.05）。此外,实时荧光定量PCR结果显示,转染PTTG siRNA后,PTTG、MMP-2和MMP-9的表达均明显下降,表达水平分别是对照组的0.8%、23.2%和21.3%。Western印迹结果表明,转染PTTG siRNA后,PTTG、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平也明显下降（P < 0.05）。转染PTTG siRNA组的细胞穿膜数（51.38 ± 4.71）明显低于未处理组（131.33 ± 6.12）及转染siRNA对照组（127.72 ± 5.20）（P < 0.05）。结论 抑制PTTG的表达能显著抑制SCL-1细胞增殖及迁移,且可下调MMP-2和MMP-9表达。     

C型凝集素1受体参与人中性粒细胞体外杀伤白念珠菌活性的实验研究

【摘要】 目的 探讨人中性粒细胞能否通过C型凝集素1受体（dectin-1）识别白念珠菌细胞壁不溶性β葡聚糖来介导体外杀伤白念珠菌的活性。 方法 100 mg/L β葡聚糖体外作用于中性粒细胞1、6、24 h后,实时荧光定量逆转录PCR分析dectin-1和Toll样受体2 mRNA表达水平。100 mg/L β葡聚糖体外分别刺激中性粒细胞15 min、2 h、6 h,或先用dectin-1抑制剂昆布多糖100 mg/L和50 mg/L预处理30 min后,再予100 mg/L β葡聚糖刺激2 h,微量培养板荧光分析法检测中性粒细胞H2O2释放水平。昆布多糖预处理的中性粒细胞与白念珠菌体外共培养后,检测菌落形成单位（CFU）。结果 β葡聚糖作用中性粒细胞1、6、24 h后,dectin-1 mRNA水平分别为2.8195 ± 0.1669、5.4859 ± 0.7244、3.6041 ± 0.5372,均明显高于空白对照组（均P < 0.01）。β葡聚糖刺激中性粒细胞15 min后H2O2水平为（64.55 ± 15.67） μmol/L,2 h时为（290.34 ± 30.56） μmol/L,6 h时为（208.54 ± 26.88） μmol/L,与空白对照组（22.05 ± 3.99） μmol/L比较,差异均有统计学意义（均P < 0.01）;100 mg/L和50 mg/L昆布多糖预处理组分别为（80.45 ± 22.41） μmol/L和（130.42 ± 44.55） μmol/L,与β葡聚糖刺激组相比,分别降低了73%和45%,差异均有统计学意义（P < 0.01）。昆布多糖能明显抑制中性粒细胞体外杀伤白念珠菌的活性（均P < 0.01）。 结论 Dectin-1参与人中性粒细胞分泌H2O2以及对白念珠菌杀灭活性,为过继性粒细胞转输治疗系统性念珠菌感染提供初步依据。 【关键词】 念珠菌,白色; 中性白细胞; β葡聚糖类; 外源凝集素类,C型; 过氧化氢     

申克孢子丝菌酵母相对人THP-1巨噬细胞样细胞p38MAPK激活及白细胞介素6表达的影响

目的 探讨申克孢子丝菌酵母相对人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)巨噬细胞样细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活化及白细胞介素6(IL-6)表达的影响.方法 实时荧光定量反转录PCR分析申克孢子丝菌酵母相刺激THP-1巨噬细胞样细胞3、6h后IL-6 mRNA表达水平变化,酶联免疫吸附法检测刺激24 h后IL-6分泌量;Western印迹法分析2×106 CFU/ml申克孢子丝菌酵母相体外作用于THP-1巨噬细胞样细胞30 min和60 min后p38MAPK磷酸化水平的变化,同时检测100 nmol/L地塞米松(p38MAPK抑制剂)预处理THP-1巨噬细胞样细胞30 min后p38MAPK磷酸化水平及IL-6 mRNA表达水平的变化.采用SPSS19.0统计软件,进行多因素方差分析、单因素方差分析,组间多重比较采用LSD检验.结果 刺激THP-1巨噬细胞样细胞3h后,酵母相组、凝胶多糖组、空白对照组IL-6 mRNA表达水平分别为56.81±7.36、26.69±1.22、0.97±0.05,刺激6h后分别为378.03±16.67、276.24±39.13、1.02±0.04,组间差异有统计学意义(F=5 552.22,P＜0.001).申克孢子丝菌酵母相刺激6h后IL-6 mRNA表达高于刺激3h后(q=16.74,P＜0.001),申克孢子丝菌酵母相与THP-1巨噬细胞样细胞共孵育24 h后,酵母相组、凝胶多糖组及空白组细胞上清液中IL-6浓度分别为(59.96±18.16)、(91.01±17.27)、(5.50±2.30) pg/L,组间差异有统计学意义(F=26.62,P＜0.01);酵母相组高于空白对照组(P＜ 0.01).地塞米松处理后,酵母相组IL-6 mRNA表达水平(4.46±1.03)低于未用地塞米松处理组(493.52±113.87,P＜0.001).申克孢子丝菌酵母相作用THP-1巨噬细胞样细胞30、60 min后,磷酸化p38MAPK蛋白相对表达量均高于空白对照组(P＜0.01).地塞米松预处理THP-1巨噬细胞样细胞后,磷酸化p38MAPK水平低于未用地塞米松处理组,差异有统计学意义(q=10.81,P＜ 0.01).结论 人THP-1巨噬细胞样细胞体外与申克孢子丝菌酵母相作用后,通过激活p38MAPK信号通路促进IL-6表达.     

念珠菌性包皮龟头炎的菌种分布及其药敏试验分析

目的：了解念珠菌性包皮龟头炎的致病菌种及其对抗真菌药物的敏感性。方法：分别采用沙保罗琼脂平板、法国生物梅里埃公司的酵母样真菌鉴定卡（ID 32C）、酵母样真菌药敏卡（ATB FUNGUS3）对包皮龟头分泌物进行念珠菌的培养、鉴定和药敏试验。结果：1227例患者共培养出356株念珠菌,阳性率为29．0％。其中,白色念珠菌297株（83．5％）、光滑念珠菌41株（11．5％）、热带念珠菌14珠（3．9％）,其它念珠菌4株（1．1％）。白色念珠菌和光滑念珠菌对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的敏感率分别为98％、100％、97．3％、61．3％、100％和95．1％、100％、19．5％、12．2％、95．1％。结论：白色念珠菌是念珠菌性包皮龟头炎的主要致病菌种,不同菌种对药物的敏感性有所不同。     

咪喹莫特促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬及诱生兔肿瘤坏死因子的实验研究

目的研究咪喹莫特促进小鼠巨噬细胞吞噬能力及兔诱生肿瘤坏死因子（TNF）-α的影响,以了解其治疗尖锐湿疣等疾病的作用机制。方法细胞吞噬试验及诱生TNF-α试验的实验动物分别采用小鼠和兔;细胞吞噬试验中,各小鼠处理组每日给药1次,连续3d;兔诱生TNF-α试验中,各大白兔处理组每日给药1次,连续7d。结果小鼠巨噬细胞吞噬能力试验中,咪喹莫特给药组吞噬百分率和吞噬指数均高于正常对照纽（P〈0．05,P〈0．01）;巨噬细胞化学发光试验中,咪喹莫特给药组发光积分值均高于正常组对应时间点的积分值（P〈0．05,或P〈0．01）;大白免给药组诱生TNF-α的结果明显高于正常对照组（P〈0．05,或P〈0．01）,但与经典的阳性对照组相比,诱生能力低于阳性对照组。结论咪喹莫特能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力,并有促进大白兔诱生TNF-α的作用。     

小干扰RNA抑制2型单纯疱疹病毒作用的研究

目的 研究小干扰RNA（siRNA）在体外抑制2型单纯疱疹病毒（HSV-2）的作用。方法 根据HSV-2 VP16和DNA聚合酶基因序列设计、合成siRNA。采用病毒产量减少实验测定siRNA对病毒复制的抑制,在预防性作用研究中,24孔板Vero细胞转染siRNA,4 h后换液并接种HSV-2病毒（0.02 ～ 0.05 PFU/细胞）;在治疗性作用研究中,24孔板Vero细胞接种HSV-2,1 h后转染siRNA。荧光定量RT-PCR测定siRNA对病毒靶基因mRNA水平的影响。结果 分别针对HSV-2 VP16基因及DNA聚合酶基因设计的siRNA--VP2-1和DP2-1,在预防性及治疗性作用研究中均能有效抑制病毒复制,使病毒滴度降低约1个log10 。siRNA VP2-1使病毒VP16 mRNA的水平在感染后6 h和12 h分别降低58.6％和79.5％,而siRNA DP2-1使病毒DNA多聚酶的mRNA水平分别降低59.8％和77.4％。结论 HSV-2 VP16和DNA聚合酶基因的siRNA体外能有效抑制HSV-2复制,VP16和DNA多聚酶基因可以作为RNA干扰抑制HSV病毒复制的靶基因。     

人参皂苷Rb1对紫外线损伤的保护作用及其机制研究北大核心CSCD

目的观察人参皂苷Rb1对中波紫外线（UVB）照射诱导小鼠表皮细胞、培养的HaCaT细胞产生与清除环丁烷嘧啶二聚体（CPD）的影响及对核苷酸切除修复蛋白XPC、ERCC1表达的影响。方法42只去毛BALB／c小鼠分为4组：未处理组（6只）,UVB组（12只）,UVB＋小剂量Rb1组（12只）,UVB＋大剂量Rb1组（12只）。后2组照射前2h在背部按100μl／cm2分别外用含0．5g／L、2g／L人参皂苷Rb1的丙酮溶液,而前2组予以相应丙酮溶液。UVB剂量均为180mJ／cm2,于照射后0．5、16h分别处死半数小鼠,利用免疫组化法检测表皮CPD水平。培养的HaCaT细胞用含人参皂苷Rb1（5、20、50mg／L）的培养基孵育4h,部分细胞于UVB照射（15、30mJ／cm2）后0．5、12h终止培养并提取基因组DNA,通过斑点杂交法检测CPD。其余细胞照射（30mJ／cm2）后0、0.5、2、4、12h终止培养,提取细胞总蛋白,通过免疫印迹法分析XPC、ERCC1蛋白的表达。结果UVB照射小鼠0．5h后,各照光组表皮均产生大量CPD,但组间差异无统计学意义;在照射后16h,UVB＋小剂量Rb1组、UVB＋大剂量Rb1组表皮CPD分别为32．1±8．5、14．6±4．1,均较UVB组（67．3±11.2）显著减少,且大剂量组更为明显（P值均〈0．01）。HaCaT细胞在UVB照射后0．5h,各组CPD总量差异无统计学意义,但照射后12h,给药组CPD水平明显降低。UVB组HaCaT细胞XPC、ERCC1蛋白的表达均随着时间延长不断下降,在照射后即刻、0．5、2、4、12h,XPC／GAPDH蛋白灰度比值分别为0．68±0．11、0．47±0．09（与照射后即刻比较,P〈0．05,下同）、0．45±0．08（P〈0．05）、0．37±0．06（P〈0．01）、0．18±0．03（e〈0．01）,ERCC1／GAPDH分别为0．28±0．03、0．25±0．03（P〉0．05）、0．21±0．02（P〈0．05）、0．14±0．02（P〈0．01）、0．11±0．01（P〈0．01）;加入50mg／L Rb1干预后,XPC、ERCC1蛋白的表达不断增加,XPC／GAPDH分男别为0．56±0．07、0．48±0．14、0．68±0．15、0．97±0．20（P〈0．01）、0．79±0．12（P〈0．05）,ERCC1／GAPDH分别为0．27±0．04、0．24±0．04、0．29±0．05、0．35±0．05（P〈0．05）、0．39±0．05（P〈0．01）。结论人参皂苷Rb1对UVB诱导的CPD的产生无明显影响,但可显著加速其清除,这可能与其上调XPC、ERCC1蛋白的表达有关。