高脂饮食对自身免疫性肝炎肝损伤与焦亡的研究CSCD

目的探讨高脂饮食（high-fat diet, HFD）对小鼠自身免疫性肝炎（autoimmune hepatits, AIH）肝脏损伤的影响。方法50只C57BL/6雄性小鼠选取6只为S-100制备组,剩余小鼠用随机数字法随机分成标准饮食组（standard chow, SC）、HFD组、AIH＋SC组及AIH＋HFD组,喂饲1周后进行AIH造模,4周后处死小鼠,收集小鼠肝脏、脾脏、血清,进行HE染色观察肝组织病理学改变;检测小鼠血清中ALT和AST变化;蛋白质印迹法和实时PCR法检检测肝组织中Nod样受体蛋白3（NLR pyrin domain containing 3, NLRP3）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-1）的表达;ELISA试剂盒检测血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量;流式细胞仪分析脾脏中Th17细胞的数量。各组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,每两组间比较方差齐性采用SNK-q检验,方差不齐采用非参数检验。结果HFD组肝组织可见少许脂肪空泡形成,AIH＋SC组可见血管周围炎性反应,AIH＋HFD组可见炎性反应加重,出现少许空泡样脂肪变性。与SC组小鼠相比,AIH＋SC组和HFD组小鼠的血清ALT和AST水平有所增加,AIH＋HFD组上升最为明显,各组均数相比差异均具有统计学意义（F值分别为57.12和37.58,P均〈0.05）。SC组外周血中Th17占CD4＋T细胞的比例为（2.98±0.90）%,HFD组为（6.89±0.99）%,AIH＋SC组为（6.47±1.08）%,AIH＋HFD组为（9.96±0.83）%,各组之间比较及两两比较差异有统计学意义（F＝54.05,P〈0.05）。SC组各血清细胞因子浓度分别为IL-1β [（7.62±2.81） ng/L]、IL-6 [（106.54±53.08） ng/L]、TNF-α [（107.26±36.20） ng/L];HFD组分别为IL-1β [（25.06±7.09） ng/L]、IL-6 [（220.11±47.41） ng/L]、TNF-α [（273.77±33.62） ng/L];AIH＋SC组分别为IL-1β [（17.49±5.68） ng/L]、IL-6[（260.73±50.29） ng/L]、TNF-α [（250.49±81.63） ng/L];AIH＋HFD分别为IL-1β [（52.04±10.22） ng/L]、IL-6 [ （785.93±70.91） ng/L]、TNF-α [（913.97±64.57） ng/L],各组之间差异均有统计学意义（F值分别为44.66、242.15、233.49,均P〈0.05）。HFD组和SC组相比、AIH＋HFD组与AIH＋SC组相比,NLRP3、Caspase-1表达明显上升,差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论HFD促进AIH,可能是通过促炎因子分泌、促进Th17细胞活化和促进炎症小体NLRP3激活进而促进细胞焦亡。     

TLR4/MyD88在实验性自身免疫性肝炎小鼠中的表达和意义

目的研究Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)在实验性自身免疫性肝炎(experimental autoimmune hepatitis,EAH)小鼠中的表达情况,探讨TLR4/MyD88在自身免疫性肝炎发病中的作用。方法以同种系小鼠肝组织制备的肝抗原S-100与弗氏完全佐剂等体积混合,腹腔注射免疫C57BL/6小鼠建立EAH模型,并设立正常对照组。在EAH组小鼠免疫后28d取肝组织,行石蜡包埋,病理HE染色及Masson胶原染色,免疫荧光检查血清中自身抗体,采用实时荧光定量PCR方法检测各组小鼠肝脾组织TLR4、MyD88mRNA相对表达水平,免疫组化检测肝组织中TLR4蛋白水平表达情况。结果与正常组小鼠相比,EAH小鼠肝脏中TLR4、MyD88mRNA明显升高,脾脏中TLR4、MyD88mRNA表达水平下降,肝脏中TLR4蛋白表达增加。结论 TLR4和MyD88在自身免疫性肝炎小鼠肝脏中表达水平升高,可以通过TLR4/MyD88依赖型信号途径发挥作用,并可能促进肝纤维化,在自身免疫性肝炎发生发展过程中发挥重要作用。     

模拟代谢性内毒素血症对肝损伤小鼠肝组织TLR4信号通路的影响

目的：观察持续4 w的模拟代谢性内毒素血症对小鼠肝脏组织病理和4型Toll样受体（TLR4）信号通路的影响。方法将30只雄性C57BL/6J 小鼠随机分为正常组（n=10）和内毒素组（n=10）,均予以普通饲料喂养,和高脂组（n=10）,予以高脂饲料喂养。内毒素组小鼠同时经腹部皮下植入的微泵注入内毒素300μg·kg-1·d-1,连续4 w,正常组小鼠皮下微泵持续注入生理盐水作为对照。4 w后测定小鼠血清内毒素水平,对肝组织切片行HE染色后进行非酒精性脂肪性肝病评分（NAS）,采样Real time PCR法测定小鼠肝组织TLR4及其下游的MyD88和TRIF-related adaptor molecule （TRAM） mRNA水平。结果内毒素组小鼠血清内毒素水平（0.62±0.04 EU/ml）显著高于正常组（0.50±0.06 EU/ml,P〈0.05）和高脂组（0.49±0.05 EU/ml,P〈0.05）;内毒素组小鼠肝组织主要表现为单纯性脂肪变性,NAS积分为（2.30±0.49）,高脂组小鼠肝组织炎症较明显,NAS积分为（4.20±1.61）,显著高于内毒素组（P〈0.05）;与正常组相比,内毒素组小鼠肝组织TLR4 mRNA 水平上调5.12倍（P＜0.01）,TRAM mRNA水平上调3.46倍（P＜0.01）,而MyD88 mRNA水平与正常组比,无显著差别。结论持续4 w的模拟代谢性内毒素血症可诱导小鼠肝脏单纯性脂肪变性,TLR4 mRNA 和TRAM mRNA水平上调,而MyD88 mRNA水平无显著变化。     

辅助性T淋巴细胞22及其效应因子IL-22在自身免疫性肝炎小鼠模型中的表达及意义

目的研究自身免疫性肝炎(AIH)小鼠模型中辅助性T淋巴细胞(Th)22细胞水平及其功能因子IL-22的表达情况,探索其在AIH发病中的意义。方法选取30只4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(n=6)、AIH组(n=14),剩余10只用于提取肝脏特异性抗原S100。在实验第1天和第7天通过腹腔注射法将新鲜提取的S100与等体积弗氏完全佐剂混合液注射到小鼠腹腔内,第28天成功建立AIH小鼠模型(造模期间AIH组有7只小鼠因注射不当、出现腹水、感染等原因死亡)后,将小鼠经腹腔注射5%水合氯醛(0.1 ml/10 g)麻醉后摘取眼球取血,收集小鼠脾脏采用流式细胞术检测Th22细胞数,RT-PCR检测AHR mRNA水平;收集肝组织用于HE染色观察肝脏病理变化,RT-PCR和免疫印迹法检测肝组织IL-22、IL-22R表达情况;ELISA法检测血清中IL-22细胞因子水平。2组间比较采用t检验。结果对照组小鼠肝组织排列整齐,肝小叶结构清晰,AIH组小鼠汇管区有大量炎症细胞浸润,肝组织出现点状甚至碎片状坏死。AIH组Th22细胞数较对照组明显升高[(0.083±0.052)%vs(1.555±0.812)%,t=-4.405,P0.05]。AIH组小鼠脾脏中Th22转录因子AHR mRNA的相对表达量较对照组有明显升高(0.485±0.096 vs 1.268±0.366,t=-5.452,P0.05)。AIH组肝组织中IL-22 mRNA和IL-22R mRNA的相对表达量均较对照组明显升高(IL-22 mRNA:1.146±0.227 vs 3.813±0.478,t=-12.458,P0.001;IL-22R mRNA:0.276±0.037 vs 1.734±0.248,t=-15.333,P0.001);AIH组肝组织的IL-22及IL-22R的蛋白相对表达量均明显高于对照组(1.040±0.261 vs 0.410±0.077,t=-6.324,P0.05;1.432±0.304 vs 0.830±0.146,t=-6.316,P0.05)。AIH组血清IL-22水平较对照组升高,且差异有统计学意义(t=-15.799,P0.05)。结论 AIH小鼠Th22细胞及IL-22因子的表达水平均明显升高,其可能在AIH的发病中起重要作用。     

白介素23受体在支气管哮喘小鼠脾源性CD4^＋T细胞中的表达及意义

-23R）的表达及在哮喘发病中的作用。方法建立急性哮喘小鼠模型,免疫磁珠分离小鼠脾源性CD4^＋T细胞,培养24h后,检测CD4^＋T细胞表面IL-23R的表达、Th17细胞的阳性率及细胞培养上清液中的IL-17水平。结果哮喘小鼠脾脏CD4^＋T细胞表面IL-23R的表达明显高于正常组（P〈0．01）;哮喘小鼠脾脏CD4^＋T细胞中Th17细胞的阳性率明显高于正常组（P〈0．01）;哮喘小鼠脾脏CD4^＋T细胞分泌IL-17浓度明显高于正常组（P〈O．01）;小鼠脾脏CD4^＋T细胞表面IL-23R的表达与Th17细胞的阳性率和IL-17的浓度呈正相关。结论IL-23R在急性哮喘的发病机制中可能起重要作用。     

白介素-17在自身免疫性肝炎中的作用及其机制研究

目的：探讨IL（白细胞介素）-17在自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）患者和AIH小鼠中的作用及其机制。方法：选取AIH患者和健康者各12例,分离其外周血单个核细胞（PBMC）,实时定量PCR方法检测PBMC中IL-17的表达。将S-100肝抗原与弗氏完全佐剂经腹腔注入到C57BL／6小鼠体内而建立AIH小鼠模型,通过尾静脉注入IL-17中和抗体,观察小鼠肝功能变化和肝脏病理组织学变化。结果：与健康者相比,AIH患者PBMC中IL-17的表达明显增高。AIH小鼠模型中,IL-17中和抗体明显地降低了血清中ALT水平,并且减轻了小鼠肝脏炎症反应。结论：IL-17在AIH患者血清中明显升高。采用IL-17中和抗体干预后,其AIH小鼠的肝功能及肝脏损伤明显好转。证实了IL-17在AIH的发病过程中起了极其重要的作用。     

Th17在自身免疫性肝炎病理形成中的作用

自身免疫性肝炎（AIH）是T细胞介导的一种慢性肝脏炎症性疾病,以肝脏特异性组织学改变、高免疫球蛋白、循环自身抗体及对免疫抑制剂治疗有反应为其主要特征,基因易感性、病毒分子模拟、自身免疫反应等均被认为与AIH发病机制相关,目前AIH的治疗以抑制肝脏免疫反应为主,但AIH的发病机制至今仍尚未完全明确。Th17细胞为近年来新近发现的Th辅助细胞,它所分泌的细胞因子在多种自身免疫性疾病中均有不同程度的升高,虽然在肝脏疾病中的作用仍处于研究阶段,但Th17的发现无疑对免疫介导的肝脏疾病乃至AIH发病机制的进一步研究有所帮助,也为疾病的治疗提供了新的线索。     

大黄牡丹汤含药血清对 LPS 刺激的小鼠肺巨噬细胞 TLR4和 MyD88表达的影响

目的：探讨大黄牡丹汤含药血清（以下简称含药血清）对脓毒症的治疗机制。方法体外培养小鼠肺巨噬细胞株RAW264．7并随机分为空白组,模型组,含药血清高、中、低浓度组,每组3个复孔。除空白组外,其余四组均予细菌脂多糖（ LPS）5μg/mL刺激24 h,含药血清高、中、低浓度组分别同时给予高、中、低浓度的含药血清进行干预。干预后于37℃、5％CO2培养箱中培养24 h。分别采用半定量RT-PCR和Western blot法测定Toll样受体4（TLR4）及髓样分化因子88（MyD88）mRNA和蛋白表达。结果模型组TLR4和MyD88 mRNA和蛋白表达均显著高于空白组（P＜0．01）;含药血清中浓度组与高浓度组TLR4和MyD88表达无显著差异,但均显著低于模型组（P＜0．01）。结论含药血清治疗脓毒症的机制可能为抑制TLR4和下游MyD88表达。     

刺槐素对小鼠Th17细胞的分化功能的影响及其机制的初步探讨

目的建立小鼠Thl7细胞的体外诱导及培养方法并探索刺槐素（Acacetin）对Th17细胞的分化、功能的影响及其机制的初步探索。方法分离、纯化BABL／c小鼠脾脏%细胞,用转化生长因子8、IL-6、IL-23等促进%细胞向Thl7细胞分化。培养的Th17细胞分为五组：正常组、模型对照组、Acacetin1μM组、Acacetin10μM组、Acacetin30pM组。流式细胞术检测Thl7细胞的比例,酶联免疫吸附试验检测IL-17A的表达,实时荧光定量聚合酶链反应检测IL-17AtuRNA及ROR-γtmRNA的表达。结果该培养方法可使Th17细胞的比例明显升高（P〈0．01）。与模型对照组相比,AcacetinlμM组、Acacetin10μM组、Acacetin30肛M组的Thl7细胞的比例呈剂量依赖性降低（P值均〈0．05）。IL-17A蛋白的表达也呈剂量依赖性降低（P值均〈0．05）,IL-17AmRNA和ROR-γtmRNA的表达与模型对照组比较明显降低（P〈0．05）,以Acacetin（30uM）组最明显（P〈0．01）。结论Acacetin在体外可以抑制小鼠脾脏%细胞向Thl7细胞的分化,并抑制IL-17AmRNA和IL-17A蛋白的表达,其机制可能与抑制细胞内孤儿受体ROR-γt的表达有关。     

细粒棘球蚴感染小鼠髓源抑制性细胞与Th17细胞比例的变化

目的分析细粒棘球蚴感染小鼠体内髓源抑制性细胞(MDSCs)和Th17细胞比例的变化及意义。方法将20只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为感染组和对照组,每组10只。感染组每只小鼠腹腔注射细粒棘球绦虫原头节约2 000个,对照组注射等体积生理盐水。感染后8个月(感染晚期)收集感染组和对照组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞和腹腔细胞,采用流式细胞术检测小鼠MDSCs及其亚型(M-MDSCs、PMN-MDSCs)和Th17细胞比例,采用Pearson相关性分析MDSCs、M-MDSCs、PMN-MDSCs与Th17细胞比例的相关关系。结果感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中MDSCs比例分别为(14.72±4.27)%、(57.04±6.78)%和(15.35±5.56)%,对照组分别为(8.84±2.12)%、(30.53±1.58)%和(1.74±0.63)%,感染组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05);感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中M-MDSCs比例分别为(1.29±0.24)%、(6.27±2.11)%、(2.14±0.94)%,对照组分别为(0.72±0.25)%、(2.11±1.27)%、(0.25±0.06)%,感染组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05);感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中PMN-MDSCs比例分别为(9.31±2.65)%、(46.72±5.67)%、(7.06±2.36)%,对照组分别为(7.07±3.20)%、(25.42±2.05)%、(1.08±0.40)%,感染组与对照组间外周血白细胞和腹腔细胞的PMN-MDSCs比例差异有统计学意义(P0.05)。感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中Th17细胞比例分别为(1.31±0.38)%、(1.85±0.77)%和(2.90±0.24)%,对照组分别为(0.59±0.07)%、(0.35±0.15)%和(0.41±0.12)%,感染组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05)。Pearson相关性分析结果显示,感染组小鼠脾脏、外周血和腹腔细胞中MDSCs与Th17细胞比例之间无相关关系(r=-0.354、-0.746、0.801,P0.05),感染组小鼠脾脏M-MDSCs与Th17细胞比例呈负相关关系(r=-0.896,P0.05)。结论在细粒棘球蚴感染小鼠8个月后MDSCs与Th17细胞比例均增加,感染组小鼠脾脏M-MDSCs与Th17细胞比例呈负相关关系。     

脂多糖对约氏疟原虫感染DBA/2小鼠感染早期的免疫调节作用

目的本文主要探讨脂多糖（LPS）在致死型约氏疟原虫（Plasmodium yoelii 17×L,Pyl7×L）感染早期的调节作用。方法 6～8w、雌性DBA/2小鼠,随机分为实验组和对照组,经腹腔接种1×106 Pyl7XL寄生的红细胞。实验组于感染后d2静脉给予LPS（25μg/只）。动态观察两组小鼠的原虫血症水平,小鼠脾脏树突亚群及其表面TLR4和活化T细胞的表达水平。结果 （1）两组小鼠于感染后约d15均自愈,LPS处理组小鼠的原虫血症水平在感染后d5-8显著低于对照组;（2）与对照组相比,在感染后d3和d5,LPS处理组小鼠脾脏DCs亚群表达水平显著升高,在感染后d3,TLR4表达水平显著升高。在感染后d5,LPS处理组小鼠脾脏细胞培养初始活化T表达水平显著升高。结论在P.y17×L感染早期,LPS可通过激活TLR4强化DC成熟进一步强化Th1免疫应答反应,降低原虫血症,这将为疫苗的开发提供新的靶点。     

复方丹参注射液对变应性哮喘小鼠脾巨噬细胞TLR2和TLR4 mRNA表达的研究

目的通过观察卵清蛋白（OVA）诱导的变应性哮喘小鼠脾脏巨噬细胞中TLR2和TLR4 mRNA的表达变化,探讨复方丹参注射液（Complex Salvia Mihiorrhiza Injection,SA）对其作用的机制。方法将30只雄性BALB／c小鼠随机分为对照组、模型组和SA组,每组各10只。各组按要求处理于20天后取脾脏,贴壁法分离脾巨噬细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）,检测TLR2和TLR4 mRNA以及GAPDH cDNA的荧光域值循环数,观察SA对TLR2和TLR4 mRNA水平表达的影响。结果与对照组相比,模型组TLR2 mRNA表达明显下调,差异有统计学意义（P〈0．05）,而TLR4 mRNA表达无变化（P〉0．05）;模型组与SA组比较,SA组TLR2和TLR4 mRNA表达均上调,且有统计学差异（P〈0．05）。结论SA能使变应性哮喘模型小鼠脾巨噬细胞中TLR2和TLR4 mRNA水平表达上调,为中药在哮喘治疗中的应用提供了科学依据。     

哮喘小鼠HMGB1表达和中性粒细胞计数、IL-17水平的相关性研究

目的探讨哮喘小鼠肺组织中HMGB1表达和中性粒细胞计数、IL-17水平相关性的研究。方法采用OVA致敏和激发模式建立Th2优势哮喘小鼠模型;采用LPS联合OVA致敏和OVA激发模式建立Th17优势哮喘小鼠模型;将HMGB1拮抗剂rHMGB1-Abox经鼻滴人至Th17优势哮喘小鼠,建立HMGB1阻断的哮喘小鼠模型。实验设立正常对照组、Th2优势哮喘组、Th17优势哮喘组以及HMGB1阻断组,每组小鼠各10只,共40只。应用免疫组织化学SP法检测肺组织HMGB1的表达,收集肺泡灌洗液进行中性粒细胞计数,ELISA法检测肺组织匀浆中IL-17含量。采用SPSS13．0软件分析HMGB1表达和中性粒细胞数目、IL-17表达的相关性。结果Th17优势哮喘组小鼠HMGB1表达增强,并定位于气道上皮中。Th17优势哮喘组小鼠HMGB1表达、中性粒细胞计数和IL-17水平的表达与对照组、Th2优势哮喘组相比,均显著升高（P均〈0．01）;HMGB1阻断组小鼠HMGB1表达、中性粒细胞计数和IL-17水平与Th17优势哮喘组相比,均明显降低（P均〈0．05）。HMGB1表达与中性粒细胞计数呈正相关（r=0．82,P〈0．05）,HMGB1表达与IL-17水平呈正相关（r=0．74,P〈0．05）。结论Th17优势哮喘小鼠气道上皮HMGB1表达增强,并和中性粒细胞计数、IL-17水平呈正相关,HMGB1可能在调节哮喘Th17极化中发挥重要作用。     

细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞免疫功能的影响北大核心CSCD

目的探讨不同剂量细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞(natural killer T cells)免疫功能的影响。方法经肝门静脉注射细粒棘球蚴建立C57BL/6小鼠感染模型,对照组注射生理盐水。感染组分为低剂量组(50个原头蚴,LD)、中剂量组(500个原头蚴,MD)和高剂量组(2 000个原头蚴,HD)。于造模后12周采集小鼠肝脏和脾脏标本,采用HE及Masson染色检查肝脏病灶和纤维化程度;采用流式细胞术检测小鼠脾脏NKT细胞表型、不同NKT亚群比例,以及相关细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-17A)的表达情况。结果不同剂量细粒棘球蚴感染组小鼠肝脏均可见囊泡结构样病灶,病灶周围出现胶原沉积,对照组肝脏仅汇管区可见少量胶原沉积。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT细胞比例分别为(1.34±0.27)%和(1.33±0.21)%,与对照组(2.54±0.43)%和低剂量组(2.41±0.53)%比较差异有统计学意义(F=16.451,P<0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69^(+)CD4^(+) NKT细胞比例分别为(15.6±2.00)%和(17.5±3.98)%,与对照组(11.1±2.82)%和低剂量组(11.1±1.31)%比较差异有统计学意义(F=8.130,P<0.05)。高剂量感染组小鼠脾脏CD69^(+)CD8^(+) NKT细胞比例为(70.1±7.52)%,与对照组(85.3±2.68)%和低剂量组(83.1±3.90)%比较差异有统计学意义(F=12.42,P<0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69^(+)DN NKT细胞比例分别为(29.3±2.02)%和(27.2±5.20)%,与对照组(35.6±4.26)%比较差异有统计学意义(F=3.277,P<0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT1型细胞分泌IFN-γ比例低于对照组和低剂量组(F=40.00,P<0.01)。高剂量感染组小鼠脾脏NKT2型细胞分泌IL-4比例高于对照组、低剂量组和高剂量组(F=10.54,P<0.001)。中、高剂量感染组脾脏NKT17型细胞分泌IL-17A比例低于对照组和低剂量组(F=13.00,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏NKT10型细胞分泌IL-10比例高于对照组(F=45.59,P<0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT1型细胞分泌IFN-γ比例分别为(14.55±2.12)%和(10.43±0.85)%,与对照组(25.88±6.82)%和低剂量组(22.13±4.36)%比较差异有统计学意义(F=16.73,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT2型细胞分泌IL-4比例分别为(10.14±1.00)%、(10.64±0.73)%和(12.97±1.66)%,与对照组(7.07±0.72)%比较差异有统计学意义(F=19.99,P<0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT17型细胞分泌IL-17A比例分别为(2.46±0.72)%和(2.26±0.57)%,与对照组(4.11±1.07)%和低剂量组(4.56±0.91)%比较差异有统计学意义(F=10.54,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT10型细胞分泌IL-10比例分别为(8.42±1.38)%、(12.65±4.19)%和(15.7±3.72)%,与对照组(4.66±0.87)%比较差异有统计学意义(F=15.78,P<0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD8^(+)NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=20.08,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD8^(+)NKT型细胞分泌IL-10与高于对照组比较差异有统计学意义(F=24.41,P<0.01或P<0.001)。中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=26.82,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IL-10比例与对照组比较差异有统计学意义(F=22.96,P<0.05)。结论细粒棘球蚴感染中期,不同剂量感染诱导小鼠机体产生的细胞免疫反应由NKT1型和NKT17型模式转向NKT2型和NKT10型亚群优势,导致NKT细胞亚群之间的偏移失衡,造成细粒棘球蚴在宿主体内慢性寄生。     

性激素和Treg/Th17失衡在自身免疫性肝炎中的作用及研究进展

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)是一种典型的自身免疫介导的肝脏疾病,大多数患者起病隐匿,无特定的临床表现,且检出率呈逐年上升趋势。其发病机制与T淋巴细胞介导的免疫调节紊乱,尤其是Treg/Th17失衡密切相关。AIH好发于围绝经期女性,性激素在免疫反应中起重要作用,其可通过影响免疫细胞的表达进而引起AIH的发生、发展。本文就性激素和Treg/Th17失衡在AIH中的作用及研究进展作一综述。     

乙型肝炎病毒抑制巨噬细胞TLR3、Mda-5和RIG-I表达

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）与巨噬细胞上模式识别受体（PRR）的相互作用。方法以不同载量HBV刺激佛波酯（PMA）诱导的单核源巨噬细胞,实时定量PCR检测刺激2、4、12及24h后巨噬细胞Toll样受体3（TLR3）、黑色素瘤分化相关基因5（Mda-5）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）表达;以poly I：C刺激与HBV共培养12h的巨噬细胞,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定poly I：C刺激4h后培养上清液中β干扰素（IFNβ-）的分泌水平。结果不同病毒载量组巨噬细胞TLR3表达在2、4、12、24h较对照组下调,且高病毒载量组表达低于低病毒载量组（F值分别为123.64、24.50、6.69、7.61,P均〈0.01）;Mda-5和RIG-I在上述4个时间点的表达为高病毒载量组低于低病毒载量组（F值分别为36.44、48.58、46.59、12.77;67.68、74.54、18.18、17.76;P均〈0.01）。IFNβ-的表达为：阳性对照组〉低病毒载量组〉高病毒载量组〉阴性对照组（F=78.42,P〈0.01）,表达量分别为（497.2±43.7）、（294.2±48.4）、（92.5±12.3）、（40.4±9.9）pg/mL。结论 HBV能抑制巨噬细胞TLR3、Mda-5和RIG-I表达,致IFN-β分泌下降,可能是其逃逸机体天然免疫的机制之一。     

血脉通颗粒对动脉粥样硬化小鼠外周血单核细胞TLR4、IL-6、TNF-α的影响

目的 观察血脉通颗粒对动脉粥样硬化（AS）小鼠外周血单核细胞Toll样受体4（TLR4）表达及血浆白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平的影响.方法 选择apo E基因敲除（apo E-/-）小鼠,采用高脂饮食法建立AS模型;造模成功后随机分为血脉通组和对照组,每组11只.血脉通组给予血脉通颗粒3.808 mg/（g·d）灌胃,对照组给予相同剂量生理盐水灌胃.6周后处死,眼眶静脉丛采血.采用RT-PCR法检测小鼠外周血单核细胞TLR4 mRNA,流式细胞术测算单核细胞表面TLR4平均荧光强度,ELISA法检测小鼠血浆IL-6和TNF-α.结果 血脉通组外周血单核细胞中TLR4 mRNA的相对表达量为0.22 ±0.07,TLR4荧光强度为25.45±8.30,血浆IL-6、TNF-α水平分别为（10.86 ±4.41）、（36.94±9.46） pg/mL;对照组分别为34.04 ±7.31、0.31±0.09及（18.24±8.21）、（52.82±13.78） pg/mL;两组比较,P均＜0.05.小鼠血浆IL-6、TNF-α水平与单核细胞表面TLR4的表达均呈正相关（r =4.86、0.509,P均＜0.05）.结论 血脉通颗粒可降低AS小鼠单核细胞TLR4表达和血浆IL-6、TNF-α水平,这可能是其抑制血管炎症、治疗AS的机制之一.     

细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞免疫功能的影响

目的探讨不同剂量细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞(natural killer T cells)免疫功能的影响。方法经肝门静脉注射细粒棘球蚴建立C57BL/6小鼠感染模型,对照组注射生理盐水。感染组分为低剂量组(50个原头蚴,LD)、中剂量组(500个原头蚴,MD)和高剂量组(2 000个原头蚴,HD)。于造模后12周采集小鼠肝脏和脾脏标本,采用HE及Masson染色检查肝脏病灶和纤维化程度;采用流式细胞术检测小鼠脾脏NKT细胞表型、不同NKT亚群比例,以及相关细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-17A)的表达情况。结果不同剂量细粒棘球蚴感染组小鼠肝脏均可见囊泡结构样病灶,病灶周围出现胶原沉积,对照组肝脏仅汇管区可见少量胶原沉积。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT细胞比例分别为(1.34±0.27)%和(1.33±0.21)%,与对照组(2.54±0.43)%和低剂量组(2.41±0.53)%比较差异有统计学意义(F=16.451,P0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69~+CD4~+ NKT细胞比例分别为(15.6±2.00)%和(17.5±3.98)%,与对照组(11.1±2.82)%和低剂量组(11.1±1.31)%比较差异有统计学意义(F=8.130,P0.05)。高剂量感染组小鼠脾脏CD69~+CD8~+ NKT细胞比例为(70.1±7.52)%,与对照组(85.3±2.68)%和低剂量组(83.1±3.90)%比较差异有统计学意义(F=12.42,P0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69~+DN NKT细胞比例分别为(29.3±2.02)%和(27.2±5.20)%,与对照组(35.6±4.26)%比较差异有统计学意义(F=3.277,P0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT1型细胞分泌IFN-γ比例低于对照组和低剂量组(F=40.00,P0.01)。高剂量感染组小鼠脾脏NKT2型细胞分泌IL-4比例高于对照组、低剂量组和高剂量组(F=10.54,P0.001)。中、高剂量感染组脾脏NKT17型细胞分泌IL-17A比例低于对照组和低剂量组(F=13.00,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏NKT10型细胞分泌IL-10比例高于对照组(F=45.59,P0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT1型细胞分泌IFN-γ比例分别为(14.55±2.12)%和(10.43±0.85)%,与对照组(25.88±6.82)%和低剂量组(22.13±4.36)%比较差异有统计学意义(F=16.73,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT2型细胞分泌IL-4比例分别为(10.14±1.00)%、(10.64±0.73)%和(12.97±1.66)%,与对照组(7.07±0.72)%比较差异有统计学意义(F=19.99,P0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT17型细胞分泌IL-17A比例分别为(2.46±0.72)%和(2.26±0.57)%,与对照组(4.11±1.07)%和低剂量组(4.56±0.91)%比较差异有统计学意义(F=10.54,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT10型细胞分泌IL-10比例分别为(8.42±1.38)%、(12.65±4.19)%和(15.7±3.72)%,与对照组(4.66±0.87)%比较差异有统计学意义(F=15.78,P0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD8~+NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=20.08,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD8~+NKT型细胞分泌IL-10与高于对照组比较差异有统计学意义(F=24.41,P0.01或P0.001)。中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=26.82,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IL-10比例与对照组比较差异有统计学意义(F=22.96,P0.05)。结论细粒棘球蚴感染中期,不同剂量感染诱导小鼠机体产生的细胞免疫反应由NKT1型和NKT17型模式转向NKT2型和NKT10型亚群优势,导致NKT细胞亚群之间的偏移失衡,造成细粒棘球蚴在宿主体内慢性寄生。     

泡球蚴感染对小鼠脾脏CD8+ T细胞免疫功能耗竭的影响

目的　观察不同时间、不同剂量泡球蚴感染对小鼠脾脏CD8+ T细胞免疫功能耗竭的影响。方法　采集泡球蚴原头蚴虫体,经肝门静脉建立低（50个原头蚴）、中（500个原头蚴）和高剂量（2 000个原头蚴）泡球蚴感染小鼠模型,并设生理盐水对照组。于感染后早（2周）、中（12周）、晚期（24周）分别取小鼠脾脏,研磨分离淋巴细胞。流式细胞术检测不同实验组小鼠脾脏中记忆性CD8+ T细胞表型、免疫抑制性分子2B4表达水平,及其分泌γ?干扰素（IFN?γ）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、白细胞介素?17A（IL?17A）和IL?10的能力。结果　在感染早期,高剂量泡球蚴感染诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞以中心记忆性表型为主,其比例为（35.50 ± 2.00）%,显著高于对照组（25.90% ± 2.46%）（P < 0.01）;在感染晚期,中、高剂量泡球蚴感染均诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞以效应记忆性表型为主,其比例分别为（25.70 ± 4.12）%和（28.40 ± 4.12）%,均显著高于对照组（10.50% ± 6.45%）（P均 < 0.05）。高剂量泡球蚴感染中期和晚期,中心记忆性CD8+ T细胞比例显著低于感染早期（P均 < 0.01）;高剂量泡球蚴感染晚期,效应记忆性CD8+ T细胞比例显著高于感染早期和中期（P均< 0.05）。低、中剂量泡球蚴感染早期,脾脏CD8+ T细胞分泌IFN?γ和IL?17A能力显著增强,而高剂量泡球蚴感染虽然促进小鼠脾脏CD8+ T细胞分泌IFN?γ和TNF?α能力,但感染晚期其分泌IFN?γ和TNF?α能力显著低于早期和中期（P均< 0.05）。此外,中、高剂量泡球蚴感染晚期小鼠脾脏CD8+ T细胞表面免疫抑制性分子2B4呈高表达,其比例分别为（4.73 ± 1.56）%和（4.94 ± 1.90）%,均显著高于低剂量组（2.49% ± 0.58%）和对照组（2.92% ± 0.60%）（P 均< 0.05）。结论　在低、中剂量泡球蚴感染中期和晚期,机体利用自身免疫应答能力对虫体起到杀伤和清除;而高剂量泡球蚴感染晚期可诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞上调2B4分子表达,导致免疫耗竭,造成慢性寄生。     

果蝇样受体4介导游离脂肪酸调节人血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1的表达

目的探讨软脂酸对人主动脉血管平滑肌细胞（HA—VSMC）单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因表达的调节及果蝇样受体4（TLR4）信号通路的作用。方法采用不同剂量的软脂酸（100、200、400μmol/L）处理HA—VSMC6、12、24h,采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测细胞MCP．1mRNA表达,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测MCP-1蛋白表达,观察软脂酸调节MCP-1表达的剂量依赖关系和时间效应;采用蛋白激酶C（PKC）抑制剂白屈菜红碱、磷脂酰肌醇3激酶（P13K）抑制剂wortmannin、神经酰胺抑制剂myriocin和核因子KB（NF—KB）抑制剂parthenolide分别处理细胞30min,再加入软脂酸（400μmol/L）处理细胞6h后,实时荧光定量PCR检测MCP-1mRNA的表达水平,ELISA检测MCP-1的蛋白表达水平,研究软脂酸调节MCP-1表达依赖的信号通路;构建TLR4短发夹RNA（shRNA）腺病毒pGSadeno-TLR4并感染HA—VSMC沉默TLR4基因表达,实验同时设空白对照组（PBS缓冲液）和对照病毒（pGSadeno-GFP）组。细胞感染96h后更换培养基,再加入软脂酸（400μmoL／L）处理细胞6h,采用实时荧光定量PCR检测MCP-1mRNA表达水平,ELISA检测MCP-1的蛋白表达水平。提取细胞核蛋白,采用ELISA检测NF—KBp65亚基活性,观察TLR4／NF-KB通路在软脂酸调节HA-VSMCMCP-1基因表达中的作用。组间均数比较采用单因素方差分析。结果采用软脂酸处理细胞6h后,对照组及100、200和400μmoVL软脂酸组MCP-1mRNA表达分别为1．00±0．02、3．30±2．84、8．21±4．31和11．25±2．73（F=7．57,P〈0．05）;MCP-1蛋白表达分别为（127±10）、（147±10）、（163±18）和（194±14）ng／L（F=7．81,P〈0．05）。软脂酸可促进HA-VSMCMCP-1mRNA和蛋白表达且具有明显的剂量依赖关系。细胞培养12h和24h后,随着软脂酸浓度的增加,MCP-1mRNA和蛋白表达水平呈逐渐增加趋势,但时间效应则不明显。采用不同的信号通路抑制剂和软脂酸处理细胞6h后,对照组、软脂酸组、软脂酸＋parthenolide组、软脂酸＋白屈菜红碱组、软脂酸＋wortmannin组和软脂酸＋myriocin组MCP-1mRNA表达分别为1．00±0．02、10．80±1．23、3．49±0．28、10．84±0．24、11．24±0．27和10．62±0．36（F=1313．07,P〈0．05）;MCP-1蛋白表达分别为（132±8）、（218±12）、（152±4）、（213±12）、（225±7）和（226±9）ng／L（F=106．83,P〈0．05）。成功地构建并获得TLR4shRNA腺病毒pGSadeno—TLR4,采用pGSadeno-TLR4感染HA—VSMC阻断TLR4信号后,软脂酸＋pGSadeno．TLR4组的NF—KB065结合活性、MCP-1mRNA和蛋白表达均显著低于软脂酸组[分别为0．48±0．12比1．24±0．16、1．88±0．33比10．80±1．23、（154±10）比（218±12）ng／L;F=591．86、659．16、118．37,均P〈0．01]。而对照病毒pGSadeno．GFP对软脂酸诱导的NF—KB065结合活性和MCP：I表达均无明显影响。结论TLR4／NF—KB信号通路介导了软脂酸诱导的人主动脉血管平滑肌细胞MCP-1基因表达。