HSP70单抗诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡及其机制

目的探讨HSP70诱导人宫颈癌Hela细胞的凋亡作用及其分子机制。方法本文通过不同浓度HSP70单抗干预人宫颈癌Hela细胞,采用MTT法检测药物对Hela细胞的增殖抑制率;TUNEL法检测细胞凋亡;Real-time PCR和Western blot检测细胞凋亡相关蛋白p53和Caspase-9的表达。结果HSP70单抗可引起体外培养的Hela细胞的增殖抑制及凋亡;在10、20、40μl/ml HSP70单抗干预下,p53和Caspase-9的表达量与HSP70单抗浓度呈现一定的剂量关系。结论推测p53和Caspase-9的表达受HSP70调控。     

HSP70-骨肉瘤肽复合物激活树突状细胞诱导抗骨肉瘤免疫的研究

目的使用热休克蛋白70(HSP70)和骨肉瘤肽修饰树突状细胞(dentritic cell,DC),研究其作用规律,探讨通过DC提呈途径降低肿瘤抗原肽用量诱导抗骨肉瘤免疫的可行性.方法于体外使HSP70和骨肉瘤抗原肽结合,修饰DC,检测DC的代谢活性及分泌的细胞因子;检测注射DC和HSP70-骨肉瘤肽对小鼠肿瘤的抑制作用.结果 HSP70结合骨肉瘤肽可使DC成熟;以HSP70结合骨肉瘤肽修饰后成熟的DC注射免疫,注射量达到8×104 DC时,即可产生明显的抑瘤效应,其抑瘤作用呈数量依赖关系.结论 DC提呈抗原肽激活淋巴细胞的途径能够有效杀伤肿瘤.     

原发性肝癌HSP70和MHCI类分子的表达

采用免疫组化法检测11例未经治疗的原发性肝癌(HCC)手术组织标本MHCI类分子、HSP70的表达。结果发现，肝癌组织细胞MHCI类分子的表达与多数肿瘤细胞不同，其表达呈阳性，不存在MHCI类分子低表达或丢失的情况；与癌旁组织相比，肝癌细胞HSP70脑浆、脑膜表达呈强阳性，推测其原因可能是原位于脑浆的HSP70与MHCI类分子结合后被运输至细胞表面，并由此可能增强肝癌细胞的免疫原性，这将促使我们重新审视HCC疫苗设计的构思和考虑其治疗对策。     

人消化道癌组织HSP70的检测及其多肽复合物的分离研究

目的 分析人消化道癌组织蛋白表达谱的差异并分离纯化食管癌组织中HSP70-多肽复合物.方法 提取人食管、胃及大肠的癌组织、癌旁组织和正常组织的蛋白质,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行电泳分析;同时以食管癌组织为材料,通过层析柱分离纯化HSP70-多肽复合物.结果 相同器官的不同组织中不同分子量蛋白的种类基本一致,但丰度则表现出差异;同时分离到食管癌细胞的HSP70-多肽复合物.结论 不同分子量的蛋白质在不同组织中表达的丰度不同,可能与组织细胞生命活动状态相关.HSP70-多肽复合物的分离为提取肿瘤HSPT0-多肽复合物提供了具体方法,为深入研究和利用HSP70蛋白奠定了基础.     

缺氧诱导热休克蛋白70-2表达的分子机制

目的 观察缺氧对HepG32细胞中热休克蛋白(HSP)70-2(基因名为HSPA2)表达的影响,探讨缺氧条件下缺氧诱导因子(HIF)-1在转录水平调控HSP70-2表达的具体机制. 方法 以物理缺氧法和化学缺氧诱导剂(DFO或CoC12)诱导法分别模拟肿瘤缺氧环境,Western blot检测HIF-1α和HSP70-2蛋白表达的变化,荧光素酶报告基因分析技术检测缺氧对HSPA2基因的激活作用.HIF-1α抑制剂(YC-1)或HIF-1α小干扰RNA(siRNA)处理后检测缺氧HepG2细胞中HSP70-2的表达变化.构建一系列截短和突变的HSPA2基因启动子荧光素酶报告基因质粒,将其与HIF-1α siRNA共转染HepG2细胞,荧光素酶分析技术检测HSPA2启动子活性的变化,寻找HIF-1在HSPA2启动子上的结合位点.各组间比较用方差分析,两组间比较用t检验. 结果 缺氧培养6 h后,HepG2细胞中HIF-1α和HSP70-2表达增加,其表达量随着缺氧培养时间的延长而逐渐增加(F=77.369,P<0.01;F=108.854,P<0.01).各组分别加终浓度为0、50、100 μmol/L的化学缺氧诱导剂DFO或终浓度为0、100、200 μmol/L的CoCl2,培养24 h后检测,随着DFO浓度增加,HIF-1α和HSP70-2蛋白表达逐渐增加(F=443.174,P<0.01;F=589.238,P<0.01);随着COCl2浓度增加,HIF-1 α和HSP70-2蛋白表达也逐渐增加(F=637.724,P<0.01;F=692.918,P<0.01).与常氧培养相比,缺氧培养后HSPA2启动子活性增加7.09倍(t=43.551,P<0.01).随着YC-1浓度升高,HIF-1α表达受到明显抑制(F=883.614,P<0.01),HSP70-2表达水平也相应下降(F=218.112,P<0.01).转染HIF-1α siRNA后HIF-1α表达受到明显抑制(F=577.130,P<0.01),HSP70-2表达水平也相应下降(F=465.598,P<0.01).构建系列截短的HSPA2启动子报告基因载体转染HepG2细胞后检测,转染HSPA2(-1114/+62)-LUC和HSPA2(-653/+62)-LUC细胞的相对荧光素酶活性无明显改变,但转染HSPA2(-385/+62)-LUC细胞的相对荧光素酶活性较前明显降低(t=13.717,P<0.01).分别构建突变缺氧反应元件(HRE)1和HRE2的HSPA2启动子报告基因载体,转染HepG2细胞后检测,突变HRE1后HSPA2启动子活性显著降低(t=10.954,P<0.01),但是突变HRE2后HSPA2启动子活性无明显改变.结论 缺氧显著上调HepG2细胞中HSP70-2的表达,其机制可能是HIF-1与HSPA2启动子上HRE1结合后激活该基因的转录.     

冬凌草甲素通过激活ATM蛋白诱导人肝癌HepG2细胞G_2/M细胞周期阻滞

目的研究冬凌草甲素诱导肝癌HepG2细胞G2/M细胞周期阻滞的机制。方法不同浓度的冬凌草甲素(16、32、64μmol/L)处理HepG2细胞48 h后,流式细胞仪检测冬凌草甲素诱导肝癌HepG2细胞的细胞周期。Western印迹检测不同浓度冬凌草甲素作用肝癌HepG2细胞后H2AX蛋白的磷酸化。免疫荧光实验检测Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦点。结果彗星实验结果表明不同浓度的冬凌草甲素(16、32、64μmol/L)处理HepG2细胞48 h后,可发生G2/M细胞周期阻滞,并且随浓度增加细胞周期阻滞增加。Western印迹检测不同浓度冬凌草甲素作用肝癌HepG2细胞后,H2AX蛋白发生磷酸化,γ-H2AX随着浓度增加表达增大。免疫荧光实验发现Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦点随着浓度增加表达量增加。结论冬凌草甲素可以诱导肝癌HepG2细胞G2/M细胞周期阻滞,H2AX蛋白发生磷酸化,诱导DNA损伤的发生。     

华蟾素注射液诱导人胰腺癌细胞阻滞于G2/M期抑制细胞增殖的实验研究

目的 通过观察华蟾素注射液(Cmobutacini)对人胰腺癌细胞株SW 1990、BxPC3细胞周期的影响以探讨其抑制肿瘤细胞增殖的作用机理.方法 采用CCK-8法检测法在不同的时间点(12h、24 h、48 h、72 h和96 h)检测华蟾素注射液对人胰腺癌细胞株SW1990、BxPC3细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测对细胞周期的影响.结果 华蟾素注射液对人胰腺癌细胞株SW1990、BxPC3具有抑制细胞增殖的作用,并具有时间及剂量依赖性.其中对SW1990的半数抑制率浓度(IC50)为(8.92±1.98) mg/mL,对BxPC3的半数抑制率浓度(IC50)为(5.00 ±0.66)mg/mL.流式细胞术检测发现,华蟾素注射液可使人胰腺癌细胞株SW1990、BxPC3阻滞于的G2/M期.结论 华蟾素注射液能通过诱导人胰腺癌细胞SW1990、BxPC3阻滞于G2/M期以抑制细胞增殖,为临床应用华蟾素注射液治疗胰腺癌提供实验依据.     

HSP70-肿瘤肽复合物的纯化及其对肝癌细胞株HepG-2增殖的作用

目的:应用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统从肝癌组织中分离和纯4EHSP70-肽复合物,并研究其对肝癌细胞系HepG-2增殖的影响．方法:将组织进行匀浆、高速离心提取总蛋白后依次进行ConA-Sepharose亲和层析和 DEAE-Sephacel子交换层析分离纯化,所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行蛋白分子质量及性质鉴定,Bradford 法测定蛋白浓度;利用MTT方法检测HSP70- 肽复合物对HepG-2细胞增长的情况．结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯量蓝鉴定为单一带, 分子质量为70 kDa;Western blot结果证实为 HSP70,每10 g组织最终获得1．5 mg的HSP70; HSP70刺激组12,48,72 h与对照组的A值之间有显著差异(0．1 mg／L:t=-0．2500,P=0．00; t=-0．1777,P=0．001:t=-0．3094,P=0．001; 0．5 mg／L:t=-0．2878,P=0．00;t=-0．2044,P= 0．00;t=-0．3285,P=0．00;1 mg／L:t=-0．3118, P=0．00;t=-0．2592,P=0．00;t=-0．1994, P=0．025;5 mg／L:t=-0．4007,P=0．00;t= -0．1302,P=0．016;t=-0．2537,P=0．005),细胞存活率明显高于对照组(P<0．01)．结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度 HSP70肽复合物;HSP70肽复合物可以促进 HepG-2细胞的生长．     

靶向cyclinE小干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:以cyclinE基因编码区为靶位,构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,观察转染后对HepG2细胞的影响.方法:针对cyclinE基因序列构建表达siRNA的真核表达载体pSilencer3.1-H1hygro,利用脂质体Metafectene转染CyclinE基因高表达的肝癌细胞株HepG2.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR和Western blot法观察转染后细胞cyclinE基因表达.结果:成功构建了表达siRNA的真核质粒载体,转染后cyclinE基因mRNA及蛋白表达水平分别下降了79%和65%.结论:靶向cyclinE基因的siRNA可有效沉默HepG2细胞高表达的cyclinE基因,从而抑制肝癌细胞的增殖并促进凋亡.     

丝裂霉素诱导肝癌细胞Survivin基因表达的研究

研究肝癌细胞HepG2内凋亡抑制基因Survivin在化疗药物丝裂霉素作用下的表达变化,探讨肝癌细胞可能的耐药机制。在体外培养的肝癌细胞株HepG2中加入低浓度丝裂霉素,于不同时间收集细胞后运用RT-PCR以及免疫印迹法检测Survivin的表达变化。发现加入丝裂霉素12小时未见Survivin明显表达改变,24、48小时后SurvivinmRNA表达较加药前分别增加1.33、1.93倍,蛋白质表达增加1.25、2、10倍。丝裂霉素诱导肝癌细胞Survivin表达升高具有时间效应,Survivin表达升高可能在肝癌细胞耐药过程中发挥了一定作用。     

Polymorphisms of the MCP-1 and HSP70-2 Genes in Korean Patients with Alcoholic Chronic Pancreatitis

Alcoholic chronic pancreatitis (ACP) develops in only a small number of alcoholics. Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and heat-shock protein 70-2 (HSP70-2) polymorphisms have been reported to be associated with the severity of acute pancreatitis. However, their role in pathogenesis of ACP has not been investigated. A genetic association study for susceptibility and severity was performed on 79 male Korean ACP patients and 82 male controls. MCP-1 and HSP70-2 genotypes were determined using a fluorescence polarization detection method. The genotypes and G allele frequencies were no different in patients and controls. However, MCP-1 G allele had an effect on the development of severe ACP, when its frequency was compared in mild to moderate and severe ACP (29.6 vs. 56.0%, P = 0.02). The MCP-1 and HSP70-2 polymorphisms do not play a major role in the development of ACP in Koreans. However, MCP-1 polymorphism may be associated with the severity of ACP.     

沉默热休克蛋白70-2基因经线粒体依赖通路介导肝癌细胞凋亡

目的 探讨沉默热休克蛋白(HSP)70-2对肝癌细胞生长、凋亡的影响,以及诱导肝癌细胞凋亡的详细作用机制. 方法 Westem blot、免疫细胞化学法检测HSP70-2在4种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达.设计合成针对HSP70-2基因的特异性短发夹状RNA(shRNA),构建真核表达载体HSP70-2 shRNA1和HSP70-2 shRNA2.转染肝癌细胞后,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖,膜联蛋白/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡情况,罗丹明染色检测细胞线粒体跨膜电位变化,Western blot检测多聚ADP-核糖聚合酶、caspase-3、caspase-9蛋白切割情况,以及细胞色素C、Bax,Bcl-2蛋白的表达变化. 结果 HSP70-2在4种肝癌细胞中均高表达,在L02细胞中仅有微量表达.HSP70-2 shRNA1、shRNA2均能有效抑制肝癌细胞中HSP70-2的表达.沉默HSP70-2基因显著抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,转染48 h后,shRNA1和shRNA2诱导HepG2细胞的凋亡指数分别为55.8%±1.8%和57.1%±1.6%,诱导Huh细胞凋亡指数分别为54.9%±1.1%和60.2%±2.6%,与对照组相比,差异均有统计学意义,P值均＜0.01.转染HSP70-2 shRNA 48 h后,肝癌细胞线粒体跨膜电位显著下降,细胞色素C从线粒体释放到胞质中,caspase-3、caspase-9激活,多聚ADP核糖聚合酶被剪切降解,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达明显增加.结论 沉默HsP70-2能通过激活线粒体凋亡通路导致肝癌细胞凋亡.     

HSP70反义寡脱氧核苷酸促进MRC-5细胞衰老的研究

目的 采用反义寡核苷酸技术了解HSP70与细胞衰老之间的关系.方法 设正义组、反义组,在转染后12,24 h,3,5 d,分别用流式细胞技术和免疫荧光技术检测HSP70蛋白水平、凋亡细胞比例和细胞周期.在转染后第2、4、6天,分别收集正义组、反义组和空白对照组细胞爬片进行SA-β-Gal染色.结果 各时间点反义组蛋白表达均低于正义组（P＜0.05）,凋亡细胞比例均高于正义组（P＜0.05）.随观察期延长,处于G1期的细胞数逐渐增多,但反义组均高于正义组（P＜0.05）.相同时间点反义组SA-β-Gal染色阳性细胞（蓝染细胞）数均较正义组和空白对照组多,随观察期延长,各组蓝染细胞均增多.结论 HSP70反义寡脱氧核苷酸下调MRC-5细胞HSP70的表达,使细胞出现G1期阻滞,促进细胞衰老.     

热休克蛋白70的表达与 HBV 相关肝细胞癌临床病理学特征的相关性分析

目的：分析 HBV 相关肝细胞癌（HCC）肿瘤组织中热休克蛋白（HSP）70表达水平与 HCC 临床病理学特征的相关性。方法通过基因表达数据库（GEO）获取资料,对 HSP70基因表达与 HCC 临床病理学特征进行统计学分析。分类变量采用频数（构成比）进行统计描述,统计分析采用χ2检验或 Fisher 确切概率法。HSP 与 HCC 临床病理学特征相关性分析采用单因素及多因素 Logistic 回归分析,单因素分析显示 P ＜0．10的变量纳入多因素分析。结果HSPA4L、HSPA6、HSPA13高表达患者 HCC 主瘤体＞5 cm 的比率明显高于低表达组（P 值均＜0．05）;HSPA1A、HSPA6低表达组合并肝硬化的比率明显低于高表达组（P 值均＜0．05）;HSPA5、HSPA13高表达组 AFP ＞300 ng／ml 的比率明显高于低表达组（P 值均＜0．01）。合并肝硬化和（或）主瘤体＞5 cm 的 HCC 患者生存率明显降低（P 值均＜0．05）。经 Logistic 多因素分析,HSPA4L 高表达可促进 HCC 瘤体生长[OR ＝1．019,95％可信区间（95％CI）：1．006～10．032,P ＝0．003];HSPA1B 高表达的 HCC 患者合并多发结节的风险较大（OR ＝1．002,95％CI：1．000～1．004,P ＝0．003）。结论HSPA4L 及 HSPA1B 的表达与 HCC 临床病理学特征存在一定的相关性,可能为 HCC 治疗靶点及预后预测因子。     

益脑颗粒对亚急性衰老大鼠慢性脑缺血模型脑组织中HSP70表达的影响

目的 观察益脑颗粒对慢性脑缺血大鼠脑组织中HSP70表达的影响,探讨益脑颗粒治疗慢性脑缺血的作用机制.方法 采用D-gal注射诱导亚急性衰老大鼠模型,永久性双侧大鼠颈总动脉结扎术(2VO)制备亚急性衰老大鼠慢性脑缺血模型.给予高、低剂量益脑颗粒灌胃,并以尼莫地平为对照,免疫组化法观察大鼠脑组织中HSP70表达.结果 模型组脑组织中HSP70表达无明显改变(P>0.05),益脑颗粒高、低剂量组表达升高(P<0.01),尼莫地平组无明显改变(P>0.05).结论 益脑颗粒能通过增加缺血脑组织中HSP70的表达,改善慢性脑缺血.     

亚低温对大鼠脑缺血再灌注损伤后HSP70 、TNF-α、NF-κB表达及损伤神经细胞凋亡的影响

目的：观察亚低温对大鼠脑缺血再灌注损伤后HSP70（热休克蛋白70），TNF－α（肿瘤坏死因子－α），NF－κB（核蛋白因子－κB）表达及损伤神经细胞凋亡的影响，方法：采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，大脑中动脉阻塞2h，再灌注损伤10h，用免疫组织化学法和原位缺口末端标记（TUNEL）法分别检测假手术组，对照组和亚低温组HSP70，TNF－α，NF－κB表达水平和凋亡细胞百分率。结果：亚低温组HSP70表达水平对照组显著升高（P＜0．05），而TNF－α，NF－κB表达水平和凋亡细胞百分率明显低于对照组（P＜0．05），结论：亚低温下调大鼠脑缺血再灌注损伤后TNF－α，NF－κB表达水平和上调HSP70表达水平可能与其抗损伤神经细胞凋亡作用有关。     

HSP70-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建小鼠热休克蛋白70(HSP70)重组原核表达质粒,获取小鼠HSP70-GST融合蛋白。方法先用RT-PCR方法从小鼠脑基因组中扩增出HSP70基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pMD—Tvector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1 中进行表达。结果表达产物经Western Blot分析,在109 KD处有一明显特异带,与预期结果相符。结论构建重组融合表达载体pGEX—HSP70,用基因工程的方法在原核细胞中成功表达出小鼠 HSP70-GST融合蛋白。     

氟桂利嗪对高血压大鼠脑缺血再灌注后HSP70表达的影响

目的探讨高血压大鼠急性脑缺血再灌注后氟桂利嗪对热休克蛋白70(HSP70)表达的影响.方法将大鼠用双肾动脉狭窄术制成高血压大鼠模型,喂养2个月.随机分为氟桂利嗪组、缺血再灌注组和假手术组.除假手术组大鼠外,其他大鼠均制成大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,MCAO时间均为2小时,再灌注时间为1天.经免疫组化染色后用病理图像分析仪测出HSP70阳性细胞数,并计算阳性细胞率.比较三组HSP70阳性细胞率.结果氟桂利嗪组HSP70表达高于缺血再灌注组(P＜0.05).结论氟桂利嗪能促进HSP70表达,对缺血再灌注引起的受损脑组织起保护作用.     

溶藻弧菌热休克蛋白70基因的克隆及序列分析

目的通过测定溶藻弧菌热休克蛋白70(HSP70)基因序列,结合GenBank登录的其他弧菌HSP70核苷酸序列,分析溶藻弧菌HSP70特点以及与其他弧菌HSP70之间的同源性。方法根据GenBank中同类蛋白序列设计特异PCR引物,首次从溶藻弧菌中扩增热休克蛋白70ORF全长基因片段,并对该片段进行克隆、测序和分析。结果扩增的溶藻弧菌HSP70ORF全长基因片段长1914bp,与已登录的其他弧菌的同源性在90.4%～96.2%之间,包含完整的HSP70ORF,编码637个氨基酸。与GenBank中其他弧菌HSP70的氨基酸序列比较,溶藻弧菌HSP70含有Dnak特征基序DLGTT-S-V(8-16残基);整个分子的保守性N端最高,到C端保守性降低。结论溶藻弧菌与哈维弧菌(Vibrioharveyi)热休克蛋白70有较高同源性,该热休克蛋白70属于Dnak类型。