利用培养乳鼠心肌细胞建立缺血再灌注损伤实验模型的探讨

利用培养乳鼠心肌细胞，复制缺血再灌注损伤模型，通过观察细胞三磷酸腺苷（ＡＴＰ）、细胞内钙离子（［Ｃａ＾２＋］ｉ）、脂质过氧化物（ＬＰＯ）、乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）及心肌细胞扫描电镜变化，发现：①缺血３ｈ培养液中ＬＤＨ及［Ｃａ＾２＋］ｉ、ＬＰＯ轻度上升，ＡＴＰ耗竭明显，细胞严重水肿；②再灌注早期ＬＤＨ、［Ｃａ＾２＋］ｉ及ＬＰＯ急剧增加，ＡＴＰ含量逐渐升高，再灌注１ｈ细胞水肿减轻。结果提示：①在常温、缺氧     

热休克蛋白70基因转染抗心肌细胞凋亡对缺氧/复氧损伤的保护作用

目的 观察比较热休克蛋白70对心肌细胞急性实验性缺氧/复氧损伤的保护作用及其与热休克心肌细胞保护模型之间作用的异同.方法 进行大鼠乳鼠原代心肌细胞培养,分为4组:空白组(对照),缺氧/再灌组(A/R),热休克蛋白组(A/R+HS)和pCDNA热休克蛋白质粒组(pCDNA HSP70).用脂质体对pCDNA HSP70质粒包裹,并转导入相关心肌细胞内.RT-PCR检测HSP70 mRNA表达、Western印迹检测HSP70蛋白质表达.检测心肌细胞存活率(四甲基偶氮唑蓝比色法)、培养液中乳酸脱氢酶活性、心肌细胞超微结构改变(透射电镜)及凋亡指数观察心肌细胞损伤程度.结果 A/R+HS组和A/R+pCDNA HSP70组细胞存活率显著提高(71.8±10.3)%、(73.4±12.2)%;(LDH)活性明显降低(14.3±2.6)IU/L、(14.6±2.9)IU/L;细胞超微结构明显改善;A/R组的HSP7o mRNA和蛋白质含量比A/R+HS组和A/R+pCDNA HSP70组,明显偏低(1.87±0.23、2.05±0.34倍P＜0.01).二者的细胞凋亡指数也较A/R组明显降低.结论 HSP70基因高表达能对抗缺氧/复氧对心肌细胞的损伤,其作用与抗细胞凋亡有关.     

葛根素对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的 研究葛根素(Pue)处理后对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制.方法 原代培养新生大鼠心肌细胞,建立缺氧/复氧损伤模型,分为缺氧/复氧对照组和缺氧/复氧 葛根素保护组(葛根素浓度分别为1、0.1、0.01g/L).观察各组心肌细胞形态结构及超微结构的变化,测定心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)含量和一氧化氮(NO)分泌量,以及Pue对上述指标的影响.流式细胞仪计数各组细胞凋亡率.结果 Pue可明显提高SOD和LDH活性,降低MDA含量,减少NO分泌量,差异均有高度统计学意义(均P<0.01);电镜下治疗组心肌细胞结构接近正常;流式细胞仪计数治疗组细胞凋亡率明显低于对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01).结论 葛根素处理对体外培养心肌细胞模拟缺氧/复氧损伤模型有明显的保护作用,其保护机制可能与葛根素稳定心肌细胞膜和减轻氧自由基损伤,并且抑制缺氧/复氧损伤中的心肌细胞凋亡有关.     

缺血后适应对大鼠乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨缺血后适应对大鼠乳鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤的保护作用。方法Wist-ar乳鼠（出生后3～7d）心肌细胞培养3～5d,随机分为四组：正常对照组（N组）,缺血/再灌注组（I/R组）,缺血后适应组（PC组）,PKCε抑制剂组（PKCI组）。采用pH6.8的D-Hands液饱和氮气和含20%新生牛血清的DMEM液复制心肌缺血/再灌注模型。检测各组MTT检测细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）活力和丙二醛（MDA）含量变化,TUNEL染色观察细胞凋亡,Western blot检测PKCε蛋白表达水平。结果I/R组和PKCI组的MTT比色法检测的细胞存活率低于对照组和PC组,而LDH活力和MDA含量高于对照组和PC组。TUNEL染色细胞凋亡结果显示I/R组细胞凋亡显著,凋亡细胞核呈棕褐色,而PC组细胞存活状态良好,心肌细胞核多染成蓝色。同时,PKCI组的PKCε的蛋白表达水平低于PC组。结论缺血后适应对大鼠乳鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤具有保护作用,且PKCε的激活参与其中。     

缺氧复氧对乳鼠心肌细胞的损伤的研究

目的 观察乳鼠心肌细胞的缺氧损伤以及缺氧复氧条件下不同复氧时间对乳鼠心肌细胞损伤的变化.方法 用MTT法检测缺氧损伤及不同复氧时间对乳鼠心肌细胞存活率的影响;LDH、T-SOD/GSH/GSSG试剂盒检测缺氧损伤及不同复氧时间下细胞损伤程度.结果 MTT及LDH、T-SOD、GSH/GSSG可检测到缺氧损伤及复氧损伤,且损伤于复氧1h后趋于稳定.结论 乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤于复氧1h后趋于稳定.     

大蒜素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧复氧延迟保护作用的研究

目的：研究大蒜素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧复氧的延迟保护作用及其机制。方法：采用细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量作为心肌细胞受损指标。观察终浓度分别为5、10、20、50μg/m1的大蒜素预处理以及预处理12、24、36h后对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响，并观察蛋白激酶C(PKC)抑制剂H—7、丝裂素激活蛋白激酶(MAPKs)抑制剂PD 98059对大蒜素预处理的作用。结果：大蒜素能提高细胞存活率，减少LDH漏出和MDA生成。其中20μg/m1浓度作用较强。大蒜素预处理12h后即产生延迟保护作用，24h最强，36h消失。H—7、PD 98059能够完全清除大蒜素预处理的心肌保护作用。结论：大蒜素可以模拟缺血预处理延迟保护作用，其机制涉及PKC及MAPKs信号途径。     

缺血后处理对培养乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤的作用

随着溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、冠脉搭桥术等方法的临床应用,急性心梗后缺血心肌能够重新获得血液供应,心肌缺血性损伤明显减轻.然而随之带来的再灌注损伤,直接影响到患者的预后.如何保护缺血心肌免于再灌注损伤已成为现今研究的重要内容.     

地黄多糖对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用的研究

目的研究地黄多糖(RPS)对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法取出生3天的SD大鼠乳鼠分离心肌细胞,培养72h后分为6组:空白对照组、缺氧/复氧模型对照组、地黄多糖(10、20、40μg/ml)干预组和舒血宁注射液(SXN,100μg/ml)干预组,每组设10个复孔。各组细胞经药物干预6h后,通过倒置光学显微镜观察各组细胞形态变化,通过甲基四唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率,通过流式细胞术测定细胞凋亡率;测定各组细胞培养液中心肌酶[谷草转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)]含量;测定各组细胞中抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)]活性和丙二醛(MDA)含量。结果与缺氧/复氧模型对照组相比,地黄多糖干预组心肌细胞形态明显好转,细胞存活率明显升高、凋亡率显著降低,培养液中AST、CPK、LDH含量显著降低,细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低,其中以地黄多糖40μg/ml干预组效果最为显著,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论地黄多糖能够有效改善缺氧/复氧损伤心肌细胞形态、提高细胞存活率、降低细胞凋亡率、改善抗氧化酶活性、抑制氧化应激损伤,提示地黄多糖对缺氧/复氧损伤心肌细胞具有保护作用。     

乳化异氟醚对缺氧复氧乳鼠心肌细胞的保护作用及bcl-2、bax表达的影响

目的观察乳化异氟醚（8％体积分数）对培养乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2、bax的mRNA与蛋白水平表达的影响。方法利用原代培养的Wistar乳鼠心肌细胞建立模拟心肌缺血再灌注模型，分正常培养组、模型组、脂肪乳组、乳化异氟醚（终浓度0．28mmol／L）。各组心肌细胞做相应分组处理后，利用倒置显微镜观察心肌细胞的生长状态和搏动频率，并用透射电镜观察细胞超微结构改变；流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率；RT-PCR检测心肌细胞凋亡基因bcl-2mRNA、bax mRNA的表达。Western blot定量检测Bcl-2、Bax蛋白表达。结果乳化异氟醚组和脂肪乳组均可显著降低细胞凋亡率（P〈0．05），但乳化异氟醚组与脂肪乳组比较降低更明显（P〈0．05）。乳化异氟醚可显著上调Bcl-2表达（P〈0．05）、下调Bax表达（P〈0．05）；脂肪乳对Bcl-2和Bax表达无影响（P〉0．05）。结论乳化异氟醚及其其中的成分之一脂肪乳可抑制模拟缺血再灌注损伤心肌细胞的凋亡；乳化异氟醚对缺氧复氧损伤的抗凋亡作用与其心肌细胞Bcl-2表达上调和Bax表达下调有关。     

乳化异氟醚对缺氧复氧乳鼠心肌细胞的保护作用及bcl-2、bar表达的影响

目的 观察乳化异氟醚(8%体积分数)对培养乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2、bax的mRNA与蛋白水平表达的影响.方法 利用原代培养的Wistar乳鼠心肌细胞建立模拟心肌缺血再灌注模型,分正常培养组、模型组、脂肪乳组、乳化异氟醚(终浓度0.28 mmol/L).各组心肌细胞做相应分组处理后,利用倒置显微镜观察心肌细胞的生长状态和搏动频率,并用透射电镜观察细胞超微结构改变;流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率;RT-PCR检测心肌细胞凋亡基因bcl-2 mRNA、box mRNA的表达.Western blot定量检测Bcl-2、Bax蛋白表达.结果 乳化异氟醚组和脂肪乳组均可显著降低细胞凋亡率(P＜0.05),但乳化异氟醚组与脂肪乳组比较降低更明显(P＜0.05).乳化异氟醚可显著上调Bcl-2表达(P＜0.05)、下调Bax表达(P＜0.05);脂肪乳对Bcl-2和Bax表达无影响(P>0.05).结论 乳化异氟醚及其其中的成分之一脂肪乳可抑制模拟缺血再灌注损伤心肌细胞的凋亡;乳化异氟醚对缺氧复氧损伤的抗凋亡作用与其心肌细胞Bcl-2表达上调和Bax表达下调有关.     

谷氨酰胺预处理对大鼠肠缺血再灌注后肺损伤的影响

目的探讨谷氨酰胺预处理对大鼠肠缺血再灌注后肺损伤的影响。方法建立大鼠肠缺血再灌注损伤模型,观察谷氨酰胺预处理对大鼠肺组织细胞间黏附分子(ICAM-1)、热休克蛋白-70(HSP-70)基因表达、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)水平以及肺组织病理变化的影响。结果谷氨酰胺预处理可以增强大鼠肺组织HSP-70的表达,抑制ICAM-1的表达,降低肺组织MPO、MDA水平。结论谷氨酰胺预处理对大鼠肠缺血再灌注后肺组织具有保护作用,其机制可能与诱导HSP-70基因表达有关。     

粉防己碱对新生大鼠心肌细胞低氧/复氧损伤中细胞凋亡的影响

目的 :研究粉防己碱对培养心肌细胞模拟缺血 /再灌过程中心肌细胞凋亡的影响 .方法 :采用SD大鼠乳鼠进行心肌细胞培养 ,建立模拟心肌缺血 /再灌注模型 ,实验分 3组 :①正常对照组 ;②模拟缺血 /再灌注组 :细胞缺氧 12 0min ,复氧 2 4 0min ;③ 30 μmol·L-1粉防己碱 +缺血 /再灌注组 .计算台盼蓝摄取率 ,测定乳酸脱氢酶 (LDH)活性 ,以流式细胞仪 (FCM)和透射电镜观察细胞凋亡 .结果 :在正常对照组 ,FCM未发现凋亡峰 ,电镜未发现凋亡细胞 ,而缺血 12 0min/再灌注 2 4 0min组FCM的凋亡率为 15 1% ,电镜可见到典型的凋亡细胞 ,台盼蓝摄取率和LDH活性显著增加 (P <0 0 1) .粉防己碱组则细胞大部分存活 ,凋亡率明显降低 (平均 3 2 % ) .结论 :细胞凋亡参与了心肌缺血 /再灌注损伤 ,粉防己碱可减少缺血 /再灌注损伤中的心肌细胞凋亡     

二氮嗪预处理对培养成年大鼠心肌细胞模拟缺血/再灌注损伤的保护作用及其与剂量的关系

目的探讨二氮嗪预处理对培养大鼠心肌细胞模拟缺血/再灌注损伤的保护作用及其与剂量的关系.方法采用培养成年大鼠心肌细胞模拟缺血/再灌注损伤模型,观察不同浓度的二氮嗪预处理对心肌细胞缺血再灌注损伤后的细胞成活率和肌酸激酶(CK)释放的影响.结果二氮嗪预处理培养大鼠心肌细胞后,对模拟缺血/再灌注损伤要保护作用,能减少心肌细胞的损伤和死亡.在10～200mmol/L的浓度范围内,随着二氮嗪剂量的增加,其预处理心肌细胞的保护效应也相应增加.结论在50～200 mmol/L的浓度范围内,二氮嗪能剂量依赖地产生预处理心肌保护效应.     

左旋卡尼汀对培养乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤的保护作用

目的: 探讨左旋卡尼汀(L-carnitine)对乳鼠心肌细胞在模拟缺血(缺氧)再灌注(缺氧-复氧)状态下发生损伤的保护作用及其可能的机制. 方法: 培养出生1～3 d的SD乳鼠心肌细胞,建立缺血再灌注损伤(I/R)模型,实验分3组:①正常对照组(Control);② I/R组:缺氧120 min,复氧240 min;③左旋卡尼汀组:I/R之前2 h加入不同浓度左旋卡尼汀,使其终浓度分别为1组20 mg/L, 2组50 mg/L, 3组100 mg/L, 4组200 mg/L. 观察指标包括: ①超氧化物酶(SOD)活性;②丙二醛(MDA)含量;③琥珀酸脱氢酶(SDH)活性;④流式细胞仪(FCM)分析细胞凋亡率. 结果: I/R组心肌细胞内MDA含量明显升高,SOD活性显著下降,琥珀酸脱氢酶(SDH)活性明显变低,而且细胞凋亡率也显著增加,与Control组比较具有显著性差异(P＜0.05);但是在药物治疗组,随给药浓度的增加,MDA含量逐渐恢复正常,SOD活性逐渐回升,SDH活性明显升高,而且细胞凋亡率呈下降趋势,各药物治疗组与I/R组比较各实验指标均具有显著性差异(P＜0.05),表明心肌细胞在经左旋卡尼汀预处理之后,抗损伤能力加强,发生损伤的程度减少. 结论: 左旋卡尼汀对心肌细胞具有保护作用,其作用在一定范围内呈剂量依赖关系.     

含饱和氢气灌注液对大鼠肝脏冷缺血再灌注肺损伤的影响

目的：评价合饱和氢气乳酸林格灌注液对大鼠肝脏冷缺血再灌注所引起的肺损伤的影响。方法：健康雄性Wistar大鼠24只,随机分为对照组（s组）、普通灌注液组（I／R组）及含饱和氢气灌注液组（H组）,每组8只,3组给予相应实验处理。3组大鼠均于再灌注6h后经下腔静脉采血离心获取血清,测定血清中肿瘤坏死因子-α（TNF—α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的浓度。经腹主动脉采血监测动脉血气。取血后处死大鼠获取肺脏,检测肺组织丙二醛（MDA）的含量及超氧化物歧化酶（SOD）的活性,光镜下观察肺组织病理学改变。结果：血清中TNF—α、IL-6、IL-113水平为I／R组〉H组〉S组（P〈0．05）;肺组织中MDA浓度为I／R组〉H组〉S组（P〈0．05）;而肺组织中SOD活性S组〉H组〉I／R组（P〈0．05）。各组动脉血PaO2水平为S组〉H组〉I／R组（P〈0．05）,各组中PaC02差异无统计学意义（P〉0．05）。S组肺组织形态结构未见明显异常,I／R、H组均见肺组织损伤,H组损伤较I／R组减轻。结论：含饱和氢气乳酸林格灌注液可以降低炎性反应抑制机体脂质过氧化反应,减轻大鼠肝脏冷缺血再灌注肺损伤,改善肺功能。     

辛伐他汀后处理对内皮细胞缺血再灌注损伤的影响

目的 观察辛伐他汀后处理对牛肺动脉内皮细胞缺血再灌注损伤的影响.方法 对牛肺动脉内皮细胞行5h的氧糖剥夺和1h的再灌注.在再灌注之初立即将不同剂量的辛伐他汀加入到内皮细胞中,抑制剂组加入相应的抑制剂.观察不同剂量辛伐他汀组、氧糖剥夺组、抑制剂组及对照组中LDH的释放水平.结果 辛伐他汀剂量依赖性地降低了氧糖剥夺和再灌注导致的乳酸脱氢酶释放,加入抑制剂可以逆转或消除他汀后处理的保护作用.结论 辛伐他汀后处理可以减少氧糖剥夺和再灌注导致的内皮细胞损伤.     

Rho激酶在乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用

摘要：目的观察Rho激酶在培养乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用,及Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔（fasudil,F）对缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响。方法原代培养出生1～2d的SD乳鼠心肌细胞,并行肌钙蛋白抗体免疫荧光染色鉴定,建立缺血再灌注损伤（I/R）模型。实验分3组：① 正常对照组;② I/R组;③ I/R+F组：建立I/R模型前20min 加入法舒地尔,使其终浓度分别为10μmol/L（F1组）、30μmol/L（F2组）、50μmol/L（F3组）。Western blot分别检测缺血2h,再灌注3h肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1（myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1）磷酸化水平,作为Rho激酶功能活化的标志。应用流式细胞仪Annexin-V/PI双色法检测再灌注3、6h时点心肌细胞的凋亡率。结果再灌注3h后MYPT1的磷酸化水平明显增加,I/R组为正常对照组的 5.7倍(P＜0.01),F1、F2、F3组法舒地尔干预后较I/R组分别减少24.6%、40.1%、60.1%（P＜0.05）;法舒地尔组再灌注3、6h心肌细胞的凋亡率较I/R组同时间点显著下降,随给药浓度的增加,细胞凋亡率呈下降趋势。结论Rho激酶在缺血再灌注心肌细胞中有促凋亡作用,法舒地尔可减少缺血再灌注心肌细胞凋亡的发生,从而发挥良好的心肌保护作用。     

雷帕霉素对大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤的保护作用

目的：评价雷帕霉素（RAPA）对大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤的影响。方法：健康雄性sD大鼠24只随机分为3组,每组8只。假手术组（A组）大鼠仅接受麻醉后开腹,游离肝叶及相关血管后关腹;对照组（B组）采用肝脏冷缺血再灌注模型,分别采用门静脉插管和肝下下腔静脉缺口作为灌注道和流出道,用4℃乳酸林格氏液对肝脏进行冷灌注20min;实验组（C组）大鼠术前连续3d给予10mg／（kg·d）雷帕霉素灌胃,手术操作同B组。3组大鼠均于再灌注24h后经下腔静脉采血离心获取血清,测定血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）浓度及天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）的含量。取血后处死大鼠获取肝脏标本,用于检测肝组织中丙二醛（MDA）的含量及超氧化物歧化酶（SOD）的活性,光镜下观察肝组织病理学改变。结果：B、C组血清中TNF-α和IL-6的浓度、AST、ALT的含量以及肝组织MDA的水平高于A组,而SOD活性降低（P〈0．05）;C组除SOD活性比B组有所升高外,其余指标均低于B组（P〈O．05）。A组肝脏组织形态结构未见异常,B、C组均见肝细胞损伤,C组损伤较B组减轻。结论：术前给予RAPA能减轻大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤。     

促红细胞生成素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制

目的探讨促红细胞生成素（EPO）对大鼠缺血再灌注损伤心肌的影响和可能机制。方法将成年健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、EPO预处理组,各组再灌注2h后血清检测一氧化氮（NO）含量和内皮型NO合酶（eNOS）活性、血清心肌型肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白（cTnI）水平和心肌肌浆网钙泵（SERCA）活性。结果与缺血再灌注组比较,EPO预处理组血清NO含量升高（P〈0.05）,eNOS活性明显增加（P〈0.05）;血清CK-MB和cTnI水平降低（P〈0.05）;SERCA活性升高（P〈0.05）。结论 EPO能增加NO水平、eNOS和SERCA活性,有效减轻缺血再灌注心肌损伤,其机制可能与保护内皮细胞、减轻细胞内钙超载有关。     

七氟烷后处理对大鼠在体心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡的影响

目的研究七氟烷（sevoflurane）后处理对大鼠在体心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响。方法 SD雄性大鼠60只,随机分为5组（n=12）：假手术组（P组）、缺血再灌注组（ischemia-reperfusion,IR组）,小、中、大剂量组（S1、S2、S3组）,建立心肌缺血再灌注模型。光镜下观察各组心肌组织病理变化,检测心肌细胞中Bax、Bcl-2蛋白含量、心肌细胞凋亡指数（AI）。结果与P组相比,IR组、各S组心肌Bax与Bcl-2、AI均显著升高（P〈0.05）,Bcl-2/Bax显著降低（P〈0.05）;与IR组相比,各S组Bax与AI均显著降低（P〈0.05）,Bcl-2与Bcl-2/Bax均显著升高（P〈0.05）;S1组与S3组各指标间无明显差异（P〉0.05）;与S1、S3组相比,S2组Bax与AI均显著降低（P〈0.05）,Bcl-2与Bcl-2/Bax均显著升高（P〈0.05）。结论七氟烷后处理可通过调节Bax与Bcl-2的表达,提高Bcl-2/Bax来发挥心肌保护作用,且中剂量组效果更明显。