抗人尿激酶受体单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人尿激酶受体单克隆抗体，为今后uＰＡＲ病理生理作用及临床铁研究提供新 的手段。方法 利用杂交瘤技术，用经ＰＭＡ刺激的Ｕ９３７细胞与可溶性尿激酶受体（suＰＡＲ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，与ＳＰ２／０细胞融合。结果 获得国内第１组４株抗人尿激酶受体（uＰＡＲ）单抗，分别命名为ＳＺ－９８、ＳＺ－９９、ＳＺ－１００、ＳＺ －１０１。结论 ４株单抗均能与uＰＡＲ牧民性结合?能与Ｕ９３７细胞及经ＰＭＡ作用     

uPA及其抗uPA抗体和其他因素对U937细胞uPAR的影响

目的 观察ｕＰＡ、抗体等因素对Ｕ９３７细胞表达ｕＰＡＲ的影响。方法 以受体放射配基结合分析法（ＲＢＡ）测定Ｕ９３７细胞的ｕＰＡＲ,并用ｕＰＡ、抗ｕＰＡ抗体、ＰＭＡ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ和放线菌素Ｄ刺激培养细胞。结果 ＰＭＡ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ都能使细胞表达ｕＰＡＲ增多,放线菌素Ｄ具有抑制作用。抗ｕＰＡ抗体使ＰＭＡ非刺激或刺激细胞的ｕＰＡＲ数减少,刺激细胞的粘附贴壁性能下降。外源性ｕＰＡ能增强     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６～４５４ｂｐ一段长５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得的ｕＰＡＲｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细胞株９５Ｄ，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ证实转染细胞克隆有ｕＰＡＲ反义ＲＮＡ的表达。结论重组质粒ｐＵＲＡＳ能在肺癌细胞株９５Ｄ中表达尿激酶受体反义ＲＮＡ，尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ表达质粒的构建获得成功。     

凝血酶对U937细胞uPAR mRNA表达的影响

目的 研究凝血酶通过凝血酶受体（ＴＲ）对细胞ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ表达的影响。方法 在凝血酶、灭活凝血酶、和抗ＴＲ小肽多抗等作用下,以ＲＴ－ＰＣＲ法测定培养Ｕ９３７细胞ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ的表达量。结果 凝血酶增强ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ表达呈现凝血酶剂艇时间的依赖性。其作用机制与凝血酶和细胞膜上ＴＲ间的结合、以及凝血酶的蛋白水解活性有关。高浓度凝血酶或中等浓度凝血酶在延长作用时间长,对Ｕ９３７细胞ｕＰＡＲｍ     

uPAR mRNA测定及其在U937细胞中的表达

目的 研究凝血酶、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ等对Ｕ９３７细胞表达ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ的影响,观察凝血系统、炎症介质与纤溶功能变化间的关系。 方法 建立并应用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法测定培养Ｕ９３７细胞的ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ。 结果：１．经测定批间变异系数（ＣＶ间）确认了ＲＴ－ＰＣＲ法测定ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ的稳定性;２．以不同浓度凝血酶刺激２４ｈ,对Ｕ９３７细胞表达ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ有抑制和促进两种不     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

目的 构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６￣４５４ｂｐ一段为５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果 限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细     

尿激酶受体在大肠杆菌中的表达及其多克隆抗体的制备

构建尿激酶受体表达质粒并在大肠杆菌中表达，用纯化的表达产物ｕＰＡＲ蛋白制德多克隆抗体并初步应用于肿瘤标本的检测。方法 用基因工程的方法构建ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ表达质粒ｐＬＹ４－ｕＰＡＲ，转化重组大肠杆菌在４２℃条件下诱导表达；利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行优化并用纯化后的抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗体，应用制备的抗体对乳腺癌和肝癌中ｕＰＡＲ的分布进行检测。     

抗纤维蛋白-抗尿激酶双特异性单克隆抗体的体内外溶栓效果的研究

目的研究抗纤维蛋白－抗尿激酶双特异性单克隆抗体在体内外的溶栓效力。方法通过分泌抗纤维蛋白单抗的杂交瘤细胞（变异株）与尿激酶免疫小鼠的脾细胞融合，获得分泌双特异性单抗（ｂｓＭｃＡｂｓ）杂交－杂交瘤细胞。采用ＥＬＩＳＡ法检测该ｂｓＭｃＡｂｓ与纤维蛋白和尿激酶的结合力。用１３１Ｉ血浆－血浆凝块溶解率法测定体外溶栓效力。用兔血栓模型测定体内溶栓效力。结果获得８株分泌抗纤维蛋白－抗尿激酶双特异性单抗的杂交－杂交瘤细胞。ＥＬＩＳＡ实验证明ｂｓＭｃＡｂｓ与纤维蛋白和尿激酶均有很强的结合力。体外溶栓实验证明ｂｓＭｃＡｂｓ可使尿激酶的溶栓效力增强１５．５％。体内溶栓实验证明ｂｓＭｃＡｂｓ的溶栓效力为尿激酶的１．６～２．１倍。结论单抗导向溶栓剂具有高度特异性和局部溶栓效力强等优点，值得进一步研究。     

尿激酶受体在大肠杆菌中的表达及其多克隆抗体的制备

目的构建尿激酶受体（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｕＰＡＲ）表达质粒并在大肠杆菌中表达，用纯化的表达产物ｕＰＡＲ蛋白制备多克隆抗体并初步应用于肿瘤标本的检测。方法用基因工程的方法构建ｕＰＡＲｃＤＮＡ表达质粒ｐＬＹ４－ｕＰＡＲ，转化重组大肠杆菌在４２℃条件下诱导表达；利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行纯化并用纯化后的抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗体，应用制备的抗体对乳腺癌和肝癌中ｕＰＡＲ的分布进行检测。结果ｕＰＡＲ表达质粒在大肠杆菌中高效表达，表观Ｍｒ为３０×１０３左右。表达的ｕＰＡＲ占全菌蛋白的２０％左右；获得了效价为１∶３２的ｕＰＡＲ多克隆抗体；发现ｕＰＡＲ主要分布在癌细胞的表面及胞质内，而在癌旁组织中则较弱。结论ｕＰＡＲ在大肠杆菌获得高效表达，并制备得到多克隆抗体。ｕＰＡＲ在癌组织（乳腺癌及肝癌）与癌旁组织间的表达差异提示可将其应用到临床肿瘤的诊断与肿瘤转移的实验性研究中。     

尿激酶型纤溶系统在乳腺癌细胞侵袭中的作用

目的 研究尿激酶型纤溶系统组分ｕＰＡ、ｕＰＡ、ｔＰＡ及ＰＡＩ－１在人乳腺癌细胞侵袭中的作用。方法 以３株具有不同侵袭转移能力的乳腺癌细胞株作为研究对象,应用ＲＴ－ＰＣＲ方法比较纤溶组分在此３株细胞中的表达,牛奶板法检测细胞培养上清中的纤溶活性,用Ｂｏｙｄｅｎ小室模型测定细胞侵袭能力。结果 发现ＭＤＡＭＢ－２３１细胞表达较高水平的ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＰＡＩ－１和中等水平的ｔＰＡ,无血清培养上清中总纤溶     

一组抗人血栓调节蛋白单克隆抗体的建株

用纯化人血栓调节蛋白(TM)免疫Balb/c 小鼠,经细胞融合获得6株抗人TM 单抗,分别命名为SZ—52、SZ—53、SZ—54、SZ—55、SZ—56、和SZ—57。这6株单抗都能与人TM 和内皮细胞结合,并能抑制人TM 活性,而与除TM 外的血浆蛋白无交叉反应。其中SZ—52、SZ—53和SZ—57与红细胞、白细胞和血小板呈阴性反应,为特异性抗人TM 单抗;其余3株单抗则与白细胞或血小板有不同程度的交叉反应。     

放射配基结合分析法对不同细胞uPAR表达的比较研究

目的测定和比较不同正常细胞及人类肿瘤细胞膜上尿型纤溶酶原活化素受体(uPAR)的表达,了解肿瘤细胞表达uPAR的基本性质。方法建立并应用受体放射配基结合分析法(receptor-radio-ligandbindingassay,RBA)测定细胞膜上的uPAR。结果成纤维细胞经不同处理,U937细胞以PMA处理不同时间,测定uPAR的结果无论表达量或平衡解离常数(Kd)的变化均与文献一致。对正常细胞和肿瘤细胞株共10种测定膜上uPAR,结果肺癌、肝癌等5种人类肿瘤细胞比人成纤维细胞、牛内皮细胞等正常组织细胞的表达数明显多。结论本研究进一步证明了uPAR表达增强是多种恶性肿瘤细胞的一种特点。     

SZ-51检测内皮细胞P-selectin表达及其对内皮与粒细胞粘附的影响

目的 观察单克隆抗体SZ—51对内皮细胞P—selectin表达的检测效果及其对中性粒细胞与血管内皮细胞粘附的影响作用。方法 用流式细胞术检测活化内皮细胞P—selectin表达；用虎红染色法检测SZ—51对中性粒细胞与血管内皮细胞粘附的影响。结果 SZ—51能有效检出活化内皮细胞P—selectin表达，但对中性粒细胞与P—selectin、中性粒细胞与脂多糖活化的内皮细胞粘附无影响作用。结论 SZ—51不是P—selectin的阻断抗体。     

和厚朴酚对人白血病细胞系U937细胞增殖和凋亡的影响

 【目的】 探讨和厚朴酚(HNK)对白血病细胞系U937细胞增殖和凋亡的影响｡【方法】 将U937细胞和正常外周血单核细胞分别与HNK共培养,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡形态,用噻唑蓝比色法(MTT)检测HNK对细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测凋亡;罗丹明123检测线粒体膜电位;Caspase3/7活性检测试剂盒检测Caspase3/7活性;荧光定量PCR(FQ-PCR)检测Caspase-3､Caspase-7 mRNA水平变化｡【结果】 HNK对U937的体外增殖有显著抑制作用,48 h半数抑制浓度(IC50)为11.8 μg/mL,而对正常外周血单核细胞的IC50为40.3 μg/mL,Annexin V/PI双标染色显示,细胞凋亡与和厚朴酚呈浓度和时间依赖相关｡HNK明显降低U937细胞线粒体膜电位,增加Caspase3/7活性及mRNA表达水平,但对正常外周血单核细胞的增殖抑制和凋亡作用不明显｡【结论】 HNK可能通过激活caspase-3/7抑制U937细胞增殖､诱导U937细胞凋亡｡     

激发型鼠抗人4-1BBL单克隆抗体的研制

目的鼠抗人4—1BBL单克隆抗体的制备及其生物学特性研究。方法以高表达人4—1BBL分子的基因N-程细胞株L929／4—1BBL为免疫原免疫BALB／c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经过选择性克隆化培养及流式细胞术分析,筛选分泌特异性抗A4—1BBL单抗的杂交瘤细胞株;采用快速定性试纸法鉴定单抗亚类、间接免疫荧光法检测单抗对肿瘤细胞株的识别谱。进而,将所获抗人4-1BBL单抗体外刺激白血病细胞株U937,通过细胞计数法分析单抗对U937生长的影响。结果获得一株持续、稳定分泌鼠抗人4—1BBL单抗的杂交瘤细胞株,并将其分泌的单抗命名为39A8。单抗39A8可有效识别不同肿瘤细胞株表达的4—1BBL,经细胞计数分析,39A8对U937细胞的生长具有明显的促增殖作用。结论单抗39A8是可激发4-1BBL逆向信号的单克隆抗体,是研究4—1BBL分子及其功能的重要工具。     

和厚朴酚对U937/ADR细胞系耐药逆转作用及其机制研究

目的 探讨和厚朴酚（HNK）对白血病细胞U937阿霉素（ADR）耐药细胞系U937/ADR多药耐药逆转作用及其机制。方法 以大剂量（IC₅₀）ADR短时间诱导方法,构建U937/ADR细胞系。以低浓度HNK（IC₂₀）与不同化疗药物联合作用于U937/ADR细胞系,检测其对不同化疗药物耐药逆转倍数。罗丹明123检测药物外排功能;荧光定量PCR（FQ-PCR）和Western blotting检测不同浓度HNK对U937/ADR细胞系核转录因子-κB(NF-κB)和耐药相关基因MDR1及其蛋白P-糖蛋白（P-gp）表达的影响;ELISA法检测NF-κB亚单位p65（NF-κB p65）的DNA结合活性。结果 成功构建了白血病多药耐药细胞系U937/ADR,对ADR耐药指数为亲代U937细胞的11倍。6.5 μg/mL HNK可以逆转U937/ADR对ADR的耐药,逆转倍数为2.20倍。HNK能够浓度依赖性地下调U937/ADR细胞NF-κB、MDR1 mRNA和P-gp表达,抑制NF-κB p65的活性。结论 HNK能有效逆转U937/ADR多药耐药,其机制可能与抑制NF-κB p65活性、下调MDR1和P-gp表达有关。     

SZ-121单抗在人胰腺癌病理学诊断中的初步研究

目的　探讨一株新的高特异性抗人胰腺癌单克隆抗体SZ 12 1(McAbSZ 12 1)在人胰腺癌组织中的特异结合程度。方法　以人胰腺癌细胞株Patu8988为抗原 ,免疫Balb/C小鼠 ,利用杂交瘤技术 ,研制出一株McAbSZ 12 1。通过免疫组织化学方法检测了SZ 12 1在 4 7例不同分化胰腺癌及 10例良性胰腺组织上的结合反应。结果　SZ 12 1在良性胰腺组织上的结合率仅为 10 % ;而在 12例低分化胰腺癌上的结合率为 10 0 % ,14例中分化胰腺癌上的结合率为 85 .7% ,2 1例高分化胰腺癌上的结合率为 76 %。SZ 12 1在胰腺癌组织上的结合反应显著高于正常胰腺组织 (P <0 .0 0 1)。结论　SZ 12 1在人胰腺癌中的特异性高结合 ,可以为胰腺癌的诊断提供新的手段。     

抗血小板膜糖蛋白Ⅰba／Ⅲa双特异单链抗体的构建及其功能研究

目的：构建、表达抗血小板膜糖蛋白（GP）Ibα/GPⅢa双特异单链抗体,为其进一步研究、应用奠定基础。方法：应用PCR技术,扩增出接头片段和SZ-21单链抗体基因,克隆入pUm-T载体,测序分析。应用基因重组技术将接头片段、SZ-21单链抗体基因和SZ-2单链抗体基因重组拼接,构建SZ-2/SZ-21双特异单链抗体表达载体pET22-21-L-2scFv,并测序验证。导入大肠杆菌BL21(DE3)Plys,诱导表达。流式细胞术、ELISA、Western印迹检测SZ-2/SZ-21双特异单链抗体与血小板结合能力,瑞斯托霉素、凝血酶和ASP诱导血小板聚集试验对表达产物功能进行研究。结果：表达载体pET22-21-L-2scFv构建拼接正确;表达产物以包涵体形式为主,表达量占菌体总蛋白的14％;表达产物具有与血小板以及血小板GP Ibα和Ⅲa结合的活性,可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集,此作用呈剂量依赖性。结论：成功表达了SZ-2/SZ-21双特异单链抗体,该抗体具有与相应2相靶抗原结合的活性,并可抑制瑞斯托霉素、凝血酶和ADP诱导的血小板聚集。     

用抗血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa单克隆抗体检测ITP自身抗体的临床应用

本文利用抗血小板膜糖蛋白Ⅱ、b、Ⅲa(GPⅡb、GPⅢa)单克隆抗体,采取酶联免疫双抗体夹心法分别检测了26例特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者血浆抗GPⅡb、GPⅢa自身抗体.结果显示3例抗GPⅡb阳性(约占11.5%),1例抗GPⅢa(约占3.8%),7例同时抗GPⅡb.GPⅢa(约占26.9%),阳性总数为11例(约占42.3%);且抗GPⅡb. GPⅢa阳性结果与血小板数无关.