一种高效转染西藏小型猪胚胎成纤维细胞的方法

目的应用Nucleofector II核转染仪将外源基因EGFP导入西藏小型猪胚胎成纤维细胞(PEFs),并与脂质体转染的方法进行比较,寻求一种高效转染猪胚胎成纤维细胞的方法。方法使用Lonza公司的Nucleofector II核转染仪,参考已报道的转染程序与相应的转染试剂,将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入西藏小型猪PEFs,并与脂质体转染的方法进行对比研究,比较两种方法的转染效率。结果转染5 h后,核转染仪组镜下即可见绿色荧光,转染效率高达80%,远远高于脂质体转染的方法。结论用Nucleofector II核转染仪能实现西藏小型猪PEFs的高效转染,为高效制备转基因克隆西藏小型猪提供了可靠的方法。     

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的生物学特性

目的建立表达骨形成蛋白2(BMPS)的人牙周膜成纤维细胞(HPDLFS)并观察其生物学特性。方法利用脂质体将BMP2噬菌粒表达载体pBK-B2转染至HPDLFs,免疫组化ABC法检测BMP2基因的表达,并检测转染细胞的碱性磷酸酶(ALP)活力、骨钙素(OC)含量和矿化能力。结果转染BMP2基因后,HPDLFs内有BMP2蛋白的表达,ALP活力、OC含量和矿化结节数量均显著增加。结论BMP2基因在HPDLFs中得到表达并促进其向成骨样细胞分化。     

慢病毒-绿色荧光蛋白载体转染人眼睑成纤维细胞的研究

目的 将慢病毒-绿色荧光蛋白载体感染人眼睑成纤维细胞,为诱导性多潜能干细胞研究奠定基础.方法 采用0.25% dispeasⅡ酶冷消化联合组织块贴壁法培养人眼睑成纤维细胞,免疫组化SP法鉴定细胞种类,将慢病毒-绿色荧光蛋白载体以不同的感染复数(MOI值)感染细胞,并于感染48 h后流式细胞仪检测感染效率.结果 该实验方法 能获得大量的成纤维细胞,并且纯度高,当MOI值为40时,其感染效率为95.37%.结论 慢病毒-绿色荧光蛋白载体能够高效稳定感染人眼睑成纤维细胞表达绿色荧光蛋白,是诱导性多潜能干细胞技术研究的理想种子细胞.     

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的生物学特性

目的 建立表达骨形成蛋白2（BMP2）的人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）并观察其生物学特性。方法 利用脂质体将BMP2噬菌粒表达载体pBK－B2转染至HPDLFs,免疫组化ABC法检测BMP2基因的表达,并检测转染细胞的碱性磷酸酶（ALP）活力、骨钙素（OC）含量和矿化能力。结果 转染BMP2基因后,HPDLFs内有BMP2蛋白的表达,ALP活力、OC含量和矿化结节数量均显著增加。结论 BMP2基因在HPDLFs中得到表达并促进其向成骨样细胞分化。     

电穿孔法转染人原代成纤维细胞条件的优化

目的 通过优化电穿孔转染条件,探讨影响人原代成纤维细胞电转染效率和转染后细胞存活率的因素,筛选出人原代成纤维细胞的最佳电转染条件.方法 通过改变脉冲电压、脉冲次数和质粒浓度等条件,将含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGFP-N1电穿孔转染入人原代成纤维细胞.利用锥虫蓝染色检测细胞存活情况,采用流式细胞术检测转染24 h后的转染效率.结果 在低电压模式下,脉冲电压320 V、质粒浓度为20 μg/mL、脉冲1次时,人原代成纤维细胞的电转染效果最理想,转染效率达到(42.53±0.63)％,细胞存活率为(74.30±3.01)％.结论 优化了人原代成纤维细胞的电转染条件,在保证细胞较高存活率的前提下提高了人原代成纤维细胞的电转染效率,为后续基因功能的研究打下基础.     

高效转染体外转录合成的CTGF-siRNA至硬皮病皮肤成纤维细胞

目的研究CTGF—SiRNA的体外转录合成及使用专门转染试剂盒将其转染至硬皮病皮肤成纤维细胞的转染效率，为将RNA干扰技术深入应用到硬皮病治疗做铺垫。方法体外培养硬皮病皮肤成纤雏细胞；设计CTGF的siRNA；通过体外转录获得siRNA；将siRNA以SilencerTTM siRNA Labeling Kit标记；用siPORT^TM Amine转染至成纤维细胞；荧光显微镜观察转染情况。结果转染率可高达85．32％。结论该方法操作简便．且可达到理想的转染率。     

Lipofectamine^TM 2000介导pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠耳蜗成纤维细胞的实验研究

目的检测真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3在阳离子脂质体介导下对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况。方法培养新生小鼠耳蜗成纤维细胞，用阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000介导的方法，将含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP．NT3对其进行转染，转染后24h，通过Confocal显微镜观察新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况。结果通过阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000介导，真核表达质粒载体plRES2-EGFP-NT3能有效转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞。结论含有目的基因NT3的真核表达质粒载体plRES2-EGFP-NT3在阳离子脂质体介导下对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的有效转染为研究NT3基因转染对正常及致聋小鼠耳蜗效应的实验奠定了基础。     

hTERT基因转染对人胚胎成纤维细胞表型的影响

目的 探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因转染人胚胎成纤维细胞(hEFs)后细胞是否存在恶性表型。方法 应用脂质体法将pIRES2-EGFP-hTERT正义重组质粒及pIRES2-EGFP空载质粒分别导入原代培养hEFs，Western blot分别检测hTERT mRNA和蛋白质的表达。采用染色体核型分析、裸鼠皮下致瘤性实验、DNA倍体实验分析转染细胞是否存在恶性表型。结果 原代培养hEFs中存在较弱水平的hTERT基因mRNA及蛋白质表达，但外源性hTERT基因转染的胚胎成纤维细胞hTERT mRNA及蛋白表达显著增加。hTERT转染后细胞染色体仍为23对，且均为正常二倍体细胞；裸鼠皮下不具有成瘤的能力。结论 外源性hTERT基因转染的胎儿成纤维细胞不具有恶性表型。     

E1A对转染了Ras的原代人皮肤成纤维细胞生长调控的研究

目的 癌基因ras的单独激活可导致细胞早期衰老,这被认为是一种抑制肿瘤形成的细胞防御机制,我们在人类成纤维细胞研究了病毒癌基因E1A对Ras激活的调控作用.方法 在人成纤维细胞转染E1A、E1A1-143、或空载体(BP)和Ha-RasV12或其空载体(WH),确定其转染细胞的生长曲线和细胞凋亡比例.结果 单独表达E1A或Ha-RasV12可显著抑制人成纤维细胞的生长,当E1A或E1A 1-143与Ha-RasV12联合转染人成纤维细胞后,细胞增殖活跃.结论 E1A可保护人类成纤维细胞免于Ras诱导的细胞早期衰老,其生物学活性位于E1A的氨基端.     

小鼠胚胎成纤维细胞的转染与阳性细胞的初步筛选

目的：建立表达白血病抑制因子（LIF）的胚胎成纤维细胞的方法体系,为建立转基因动物模型提供理论依据。方法：以13.5 d ICR小鼠胚胎为材料,采用胰酶消化方法,培养小鼠原代胚胎成纤维细胞。利用脂质体介导方法,将线性化的pcDNA3.1-LIF真核表达载体转染至小鼠胚胎成纤维细胞中。经G418筛选阳性细胞,提取阳性细胞的基因组DNA并测序。结果：通过对小鼠原代胚胎成纤维细胞的分离、培养,获得原代胚胎成纤维细胞。经过转染,建立了表达LIF的胚胎成纤维细胞,并在倒置显微镜下观察到筛选得到的阳性细胞。对阳性细胞克隆质粒测序表明同源性达99%。结论：pcDNA3.1-LIF真核表达载体成功转染到小鼠胚胎成纤维细胞中。     

原代人牙周膜成纤维细胞的培养及培养方法的改进

目的：探讨如何提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率。方法：组织来源于11～15岁青少年因正畸而拔除的前磨牙，刮取牙根中1／3的牙周膜组织，组织贴壁培养法进行培养采用冠根分离控制取材中的污染，首次传代前进行细胞分散的方法来提高传代的成功率，并对培养细胞的形态及超微结构进行了观察。结果：经免疫组化染色证实所培养的细胞为牙周膜成纤维细胞，通过冠根分离法可有效的控制组织污染，首次传代前进行细胞分散可提高细胞传代成功率，从而使细胞培养成功率提高。结论：获得人牙周膜成纤维细胞，培养成功率在15％～20％。     

hPDGF-B基因转染对Beagle犬牙龈成纤维细胞生物学活性的影响

目的：检测hPDGF-B基因转染对Beagle犬牙龈成纤维细胞生物学活性的影响。方法使用脂质体LipofectamineTM2000将携带hPDGF-B基因的质粒EX-A0380-M03转染至Beagle犬牙龈成纤维细胞,观察转染后细胞的形态以及增殖的变化;流式细胞仪检测转染细胞的周期以及凋亡情况;Real-timePCR法检测转染后细胞表达CollagenI、CollagenXII、α-SMA的变化。结果转染后的牙龈成纤维细胞形态多样,但增殖显著;转染组S期细胞比率增高,转染细胞未出现凋亡;转染后细胞上调CollagenI基因的表达,下调CollagenXII和α-SMA的表达。结论hPDGF-B基因转染牙龈成纤维细胞后,产生PDGF-BB-eGFP融合蛋白,融合蛋白可能通过自分泌和旁分泌的方式作用于牙龈成纤维细胞,从而促进细胞增殖。hPDGF-B基因转染牙龈成纤维细胞后,细胞并不能出现逆向分化,细胞对外周基质的改建能力下降,但细胞合成胶原的能力显著增强。     

绿色荧光蛋白标记人脂肪基质细胞成骨分化能力体外实验研究

目的研究绿色荧光蛋白(GFP)基因体外转染人脂肪基质细胞的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法体外分离培养人脂肪基质细胞,用重组腺病毒载体Ad-GFP及脂质体介导质粒pEGFP-C1两种方法转染GFP基因,通过流式细胞术观察比较GFP转染和表达的结果;倒置显微镜下观察细胞生长情况;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果重组GFP基因的腺病毒Ad-GFP转染的脂肪基质细胞的感染率达(42.5±1.5)%,16h即有GFP表达,7d时表达趋于稳定,感染6周时仍可见有GFP表达,明显优于脂质体转染组(转染效率最高为11.4%)。感染Ad-GFP后的脂肪基质细胞与未感染的对照组脂肪基质细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶(ALP)表达均逐渐增高,两组间差异无统计学意义(P>0.05);诱导21d后两组均见到茜素红钙盐染色阳性。结论重组GFP基因的腺病毒载体Ad-GFP可高效率感染脂肪基质细胞,基因转染后细胞的增殖分化能力未受到影响,可以作为一种高效可靠的人脂肪基质细胞标记方法。     

阳离子脂质体介导的Ａ20基因转染人外周血单核细胞的可行性

目的探讨阳离子脂质体介导的A20基因转染人外周血单核细胞的可行性及最佳转染条件。方法采用脂质体LipofectamineTM2000包裹pCAGGS-GFP／A20质粒转染人外周血单核细胞,通过荧光显微镜检测GFP报告基因,RT-PCR检测A20基因表达。结果应用LipofectamineTM2000介导的A20基因转染人外周血单核细胞,在2×10 6／L细胞接种浓度,脂质体与质粒的量之比为4μl：3μg时,转染效果最佳,RT-PCR证实成功获得A20目的基因的表达。结论脂质体转染法可介导A20基因在人外周血单核细胞获得表达,该研究为A20基因转染的相关实验研究提供参考依据。     

基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较

将外源基因导入真核细胞的方法很多。我们通过对绿色荧光蛋白(GFP)报告基因在真核细胞中表达的研究,比较了较常用的两种方法一脂质体转染法和磷酸钙转染法。研究结果表明：脂质体转染法的转染效率较磷酸钙转染法高,且简单易行,是外源基因导人体外培养细胞内较理想的方法。     

Lipofectamine 2000和jetPRIME~（TM）对A549细胞转染效率及毒性的比较研究

目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4.5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）为1∶2.5时转染率最高,达（50.6±4.9）%,细胞存活率为（89.2±9.1）%;质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）为1∶2时转染率最高,为（30.6±2.8）%,细胞存活率为（100.6±4.8）%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异（P〈0.01,P〈0.05）。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。     

我国男性HPV流行病学特征的描述性评价

目的 分析评价我国男性普通人群人乳头瘤病毒（HPV）感染的流行学特征。方法 检索中国期刊全文数据库（CNKI）、重庆维普（VIP）、万方科技期刊全文数据库、Pubmed、Embase、OVID中关于我国男性普通人群HPV感染流行病学研究文献。采用Excel软件对提取的数据进行列表和综合分析。结果 共纳入相关研究文献5篇。综合分析显示,我国男性总的HPV感染率为8.00%~16.90%,其中高危HPV（HR-HPV）的感染率为5.50%~9.40%。与同一地区的女性人群相比,新疆墨玉县和广西林州的男性HPV感染率低于女性,而河南安阳男性的HPV感染率则高于女性。新疆和河南最常见的HR-HPV亚型均为HPV16亚型,而广西男性最常见的前3种HPV亚型依次为HPV58、52、39。新疆和河南男性的HPV多重感染率分别为1.00%和1.43%,均为当地女性HPV多重感染率的1倍以上。结论 国人男性HPV感染率低于西方国家,并存在较大的地区性差异,同一地区男性和女性常见的HR-HPV亚型分布基本一致。但是纳入的研究有限,且多为农村居民,缺乏纵向研究和对相关影响因素的研究数据,需要后续进行更全面、系统的研究。     

黄芪对体外人胚肺二倍体成纤维细胞抗衰老作用的研究Ⅰ.细胞寿命、增殖能力和超氧化物歧化酶含量的研究

以体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞为材料,当细胞培养至27代时,将细胞分为加黄芪提取液的给药组和不加黄芪的对照组,相同条件下传代培养,直至细胞停止增殖。同时,每隔一定代龄用流式细胞计测定两组细胞的增殖能力,以化学发光法测定其 SOD 含量,并进行常规染色体检查和细胞一代存活时间的实验。结果表明:给药组生长77代,而对照组细胞仅存活至52代。至传代终止两组细胞都始终保持其二倍体性质,随着代龄的增加,两组细胞的增殖能力、SOD 含量和一代存活时间均明显下降。同一代龄,给药组细胞的增殖能力、SOD 含量和一代存活时间高于对照组,随代龄的增加,这种差距更加明显。     

黄芪对体外人胚肺二倍体成纤维细胞抗衰老作用的研究Ⅰ.细胞寿命、增殖能力和超氧化物歧化酶含量的研究

以体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞为材料,当细胞培养至27代时,将细胞分为加黄芪提取液的给药组和不加黄芪的对照组,相同条件下传代培养,直至细胞停止增殖。同时,每隔一定代龄用流式细胞计测定两组细胞的增殖能力,以化学发光法测定其 SOD 含量,并进行常规染色体检查和细胞一代存活时间的实验。结果表明:给药组生长77代,而对照组细胞仅存活至52代。至传代终止两组细胞都始终保持其二倍体性质,随着代龄的增加,两组细胞的增殖能力、SOD 含量和一代存活时间均明显下降。同一代龄,给药组细胞的增殖能力、SOD 含量和一代存活时间高于对照组,随代龄的增加,这种差距更加明显。