黄曲霉毒素B_1胶体金免疫层析法检测试纸条的制备

目的制备黄曲霉毒素B_1胶体金免疫层析试纸条。方法用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶胶,用目测法、紫外可见分光光度法及精密p H试纸对其进行鉴定表征;并采用碳二亚氨法(EDC)将黄曲霉毒素B_1(AFB_1)偶联于载体蛋白卵血清蛋白(OVA)上,合成包被抗原AFB_1-OVA。通过目测法及紫外-可见分光光度法优化标记胶体金的最佳黄曲霉毒素B_1单克隆抗体浓度和pH,最后将包被有抗原AFB_1-OVA和羊抗鼠Ig G的硝酸纤维素膜和干燥的吸附有金标抗体的玻璃纤维膜组装成试纸条,初步利用竞争性免疫层析原理检测标准品黄曲霉毒素B_1。结果制备的胶体金澄清透亮,呈酒红色,无聚集现象,最大吸收波长为518 nm,呈酸性(p H=5.8)。OVA与AFB_1偶联后,偶联物紫外扫描吸收光谱与OVA及AFB_1吸收光谱有明显区别,说明有新物质生成。进一步用新合成的AFB_1-OVA组装试纸条,检测阴性样品,两线均显深红色,为阴性结果,表明合成的人工抗原成功;胶体金标记黄曲霉毒素B_1单克隆抗体最适标记p H为1 ml胶体金溶液中添加0.1 mol/L K_2CO_3量为20μl,最适蛋白浓度为13μg/ml;初步组装试纸条并检测一定浓度的AFB_1标准品,结果表明,试纸条的检测限为200 ng/ml。结论制备的胶体金符合试纸条所用胶体金的要求;并成功制备AFB_1胶体金免疫层析法测定试纸条,但尚须进一步优化条件以提高试纸条的检测性能。     

犬恶丝虫感染胶体金试纸条检测方法的建立及应用

目的建立犬恶丝虫血清抗体检测胶体金试纸条方法。方法利用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为金标抗体,犬恶丝虫MTFP重组蛋白作为诊断抗原标记检测线(T线),兔抗SPA抗体标记质检线(C线),对建立的各项条件进行优化,制备胶体金试纸条;对建立的方法进行特异性、敏感性、稳定性验证试验。用建立的胶体金试纸条检测方法对62份犬血清样本进行检测。结果所制备的胶体金试纸条敏感性为1∶8,重复性良好,检测犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清结果均为阴性。应用制备的胶体金试纸条检测62份犬血清,阳性样本4份,阴性样本58份,阳性检出率6.45%。结论建立的犬恶丝虫感染胶体金试纸条检测方法具有特异性、稳定性等特点,为犬恶丝虫病的诊断提供了一种新的检测方法。     

胶体金标记抗甲基苯丙胺复合物的合成

目的:合成高质量的胶体金标记抗甲基苯丙胺复合物,以应用于能检测吸毒人员尿液中是否含有甲基苯丙胺的胶体金试纸条。方法:用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,用抗甲基苯丙胺单克隆抗体标记胶体金。结果:成功制备了直径约20 nm颗粒均一的胶体金,进一步制备了高质量的胶体金标记抗甲基苯丙胺复合物。结论:制备的胶体金标记抗甲基苯丙胺复合物活性较好,能用于检测甲基苯丙胺的胶体金试纸条。     

胶体金标记单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备

目的制备胶体金标记单核细胞增生李斯特菌的单克隆抗体（McAb）,用于检测食品中的致病性单核细胞增生李斯特菌。方法以纯化的单核细胞增生李斯特菌（标准菌株号54001、54002）为抗原,免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体,建立胶体金标记的单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备方法。结果筛选出2株单抗杂交瘤细胞株F5、F9,并获得免疫球蛋白,测定免疫球蛋白亚类为IgM。通过选用柠檬酸钠法制备胶体金标记单核细胞增生李斯特菌抗体,测定其最适蛋白结合浓度为12 g/ml。结论成功制备了胶体金标记的单核细胞增生李斯特菌的单克隆抗体,为建立食品中病原性单核细胞增生李斯特菌检测技术奠定基础。     

快速检测日本脑炎病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立

[目的]建立一种能快速区分、简便诊断日本脑炎病毒的胶体金标记免疫层析试纸条方法,并对其进行评价。[方法]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并标记日本脑炎病毒的NS1的抗体,制成免疫层析检测试纸条。对试纸条进行特异性和敏感性评价,并对三带喙库蚊进行模拟添加日本脑炎病毒检测。[结果]用三带喙库蚊研磨悬液上清、正常的昆虫细胞液进行测试,呈阴性反应;检测日本脑炎病毒的灵敏度均为1×10^5pfu／ml,对三带喙库蚊添加日本脑炎病毒进行检测也取得同样结果,并在10～15min即可得到结果。[结论]初步建立了一种可以用于现场快速检测日本脑炎病毒的胶体金免疫层析方法,为进一步大规模应用奠定了基础。     

胶体金免疫层析法检测葡萄球菌B型肠毒素

目的通过优化制备中各关键步骤的实验条件,建立快速检测葡萄球菌B型肠毒素的胶体金免疫层析法。方法采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备直径16nm的胶体金溶液,葡萄球菌B型肠毒素多克隆抗体制备免疫胶体金复合物,组装胶体金免疫层析快速检测试纸条。结果用柠檬酸三钠还原法制备的16nm胶体金溶液呈亮红色,其颗粒大小比较均一。胶体金标记抗体蛋白的最低稳定量为15μg／mL,最适稳定量为18μg／mL,标记的最适pH为7．8。此方法检测限为0．2μg/mL,准确度为94．9％。结论制备了葡萄球菌B型肠毒素胶体金免疫试纸条,该方法简便、快速,而且灵敏度高、稳定性强,适用于食品中葡萄球菌B型肠毒素的快速检测。     

抗人胱蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人Cys-C单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法用基因工程表达的Cys-C抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗人Cys-C单克隆抗体,间接ELISA法检测单克隆抗体的效价、亲和力,鉴定单克隆抗体的亚类并检测抗原位点互补关系,SDS-PAGE鉴定抗体纯度,秋水仙素阻抑法鉴定染色体数目。结果筛选出2株能稳定分泌抗人Cys-C单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2H2、3C4,抗体Ig亚类均为IgG1,亲和常数分别为7.429×10-8、1.95×10-7,2株单克隆抗体抗原位点不重叠,染色体鉴定符合杂交瘤细胞的特性。结论成功制备了特异性的抗人Cys-C单克隆抗体,为Cys-C检测试剂盒的研究开发奠定了基础。     

壬基酚免疫层析快速检测试纸条的研制

目的制备壬基酚的免疫层析快速检测试纸条,为检测和治理环境污染物提供一种快速检测方法。方法用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金;确定胶体金标记壬基酚多克隆抗体的最适条件并制备胶体金-抗体结合物;在玻璃纤维膜上灌注结合物溶液并干燥,在硝酸纤维素膜上喷涂包被原(NP-OVA)和羊抗兔抗体作为检测线和控制线,搭建试纸条并检测标准样品。结果制出的胶体金经电镜检测,金粒子平均直径为(19.0±2.5)nm;制备的壬基酚检测试纸条检测限为(4.4±2.5)μg.mL-1;检测样品所需时间约为10 min。结论研制出的壬基酚检测试纸条,检测样品所需时间约为ELISA检测法的1/20,可用于特殊环境,尤其是突发事件中壬基酚的快速检测。     

西方马脑炎病毒抗体快速检测试纸条的研制

目的研制一种快速检测西方马脑炎病毒（WEEV）抗体的试纸条。方法利用胶体金标记和免疫层析技术,用25 nm胶体金标记葡萄球菌A蛋白,并用硝酸纤维膜包被WEEV抗原及羊抗兔IgG作为检测带和质控带,研制出WEEV抗体快速检测试纸条。对该试纸条的敏感性、特异性和稳定性做出评价,并拟合检测曲线进行半定量检测。在健康人血清、兔血清和鼠血清中添加WEEV抗体模拟污染样品,评价该方法的检测能力。结果该试纸条可在20 min内完成定性和半定量检测,灵敏度为120 ng/ml,模拟样品的检测灵敏度也相同。线性范围120～1200 ng/ml。对发病症状相似以及近缘的其他病毒进行检测,均无非特异反应。试纸条在37℃下保存1个月,检测结果不变。结论该试纸条具有快速、简便、灵敏、特异、稳定的特点,适用于现场检测。     

基于近红外免疫层析技术的A群轮状病毒定性检测方法研究

目的建立基于近红外免疫层析技术的简单快速、适用于现场的轮状病毒检测方法。方法利用双抗体夹心法原理,用近红外荧光染料Dylight 800标记轮状病毒单克隆抗体5B1和鸡IgY抗体,将轮状病毒单克隆抗体3E3和羊抗鸡Ig Y多克隆抗体喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线,制备检测轮状病毒的近红外免疫层析试纸条。依据便携式荧光扫描仪读取的检测线和质控线荧光值比值(T/C值)判断检测结果。结果阴性样品的cut-off值为0.069。建立的近红外荧光免疫层析试纸条特异性良好,与腺病毒、诺如病毒、肠道病毒EV71无交叉反应。结论近红外荧光免疫试纸条操作简单且易于携带,现场快速检测应用前景广阔。     

抗微囊藻毒素单克隆抗体胶体金标记物的制备及鉴定

目的制备抗微囊藻毒素(MC-LR)单克隆抗体胶体金标记物,并利用光谱分析来探讨结合物的合成机理。方法用杂交瘤技术生产并纯化的抗MC-LR的单克隆抗体,利用胶体金标记技术合成20nm粒径的胶体金与抗MC-LR单克隆抗体的结合物,通过光谱分析对偶联物中单克隆抗体的构象进行分析,ELISA法检测偶联物中抗体的免疫性。结果抗MC-LR单克隆抗体的效价达108,IC50抑制浓度为3ng/ml,为IgG2a亚型,分子量为1·5×105,与MC-LW、MC-LF无明显交叉反应。胶体金与抗体偶联物的颗粒圆整,光谱分析结果显示抗体蛋白的特征官能团没有发生明显变化,与胶体金粒子作用后结构略加紧密。ELISA结果显示偶联物仍然保持免疫原性。结论抗MC-LR单克隆抗体胶体金标记偶联物中抗体蛋白结构和抗原决定簇的位点没有改变,仍具有免疫原性,偶联物的稳定性良好。     

胶体金免疫层析法检测弓形虫循环抗原的研究

目的：建立一种简易快速、自测式胶体金免疫层析法（GICA）用于检测血清中弓形虫循环抗原（CAg）。方法：用胶体金颗粒标记弓形虫单克隆抗体，制成免疫层析测试条。血清中的弓形虫循环抗原与测试条上的金标记单克隆抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动，与膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色线条。结果：用GICA与ELISA比较检测105份小鼠血清中循环抗原，两法符合率为95％（P〉0．05）。结论：GICA检测血清中的弓形虫循环抗原特异性强、灵敏度高、简便快速，无需特殊仪器设备，有广泛应用价值。     

毒死蜱单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究

[目的]制备毒死蜱单克隆抗体,为建立毒死蜱残留检测方法奠定基础。[方法]以毒死蜱原药与3-巯基丙酸为起始原料,合成半抗原并对其进行结构鉴定。利用该半抗原与牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联制备毒死蜱人工免疫抗原和包被抗原,再取已免疫的经过筛选的Balb／c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合,用间接ELISA和间接竞争ELISA方法对2株细胞进行鉴定,并测定与其他农药的交叉反应率。[结果]获得两株稳定分泌毒死蜱单克隆抗体的细胞株,其检测范围为0．04～0．42mg／L,半数抑制浓度为0．135mg／L,最低检测限为0．03mg／L,与杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷几乎没有交叉反应。[结论]成功制备两株分泌毒死蜱抗体的单克隆细胞株,初步建立了毒死蜱间接ELISA检测方法。     

一种快速检测甲型流感病毒方法的建立

目的 建立一种用于甲型流感病毒抗原检测的基于胶体金免疫层析法的快速、简便试剂盒。方法 以柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记一种抗甲型流感病毒单克隆抗体。硝酸纤维素膜上包被另一种抗甲型流感病毒单克隆抗体,制成免疫层析试纸。待测样品中的甲型流感病毒首先与胶体金标记抗体结合,然后移动至硝酸纤维素膜上与固定的单克隆抗体发生反应,形成肉眼可见的红色带。结果 本试纸与不同浓度甲型流感病毒培养液均能发生特异性反应,与乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等16种病原体无交叉反应。用甲型流感病毒培养液不同浓度标本与美国同类产品比较,灵敏度相同。稳定性检测显示42 ℃和37 ℃热破坏放置结果均优于美国同类产品。临床比对结果评价kappa值为0.976,一致性非常高。结论 试纸条灵敏度和特异性能够达到临床使用的要求,并具有简便快速、无需特殊仪器设备等优点,对甲型流感的诊断和流行病学调查具有十分重要的应用价值。     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定抗T-2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株,以期为T-2毒素的快速检测提供有力的抗体工具。方法:采用琥珀酸酐法将T-2毒素活化为T-2HS,T-2HS在DCC与NHS作用下与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联合成完全抗原。以T-2HS-BSA为抗原,免疫BALB/c小鼠,用ELISA筛选、建立分泌抗T-2毒素抗体的杂交瘤细胞株。测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价,用间接竞争法检测单克隆抗体细胞株的特异性。结果:建立了1株稳定分泌抗T-2毒素抗体的杂交瘤细胞株T-1B3,该细胞株所分泌的单隆抗体Ig亚类为IgG1,ELISA检测结果表明抗T-2毒素抗体可以与T-2毒素发生特异性反应,工作浓度为1:6.5×104,IC50为3.6 ng/ml。该抗体与HT-2毒素的交叉反应为65.9%,与黄曲霉毒素无交叉。结论:制备出能分泌具有较高特异性和亲和力的抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。     

具备中和中东呼吸综合征冠状病毒活性的单克隆抗体的制备

目的制备并鉴定对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)具有中和活性的单克隆抗体,为进一步开展MERS-CoV感染与免疫保护机制研究,以及发展诊断与治疗手段奠定基础。方法 MERS-CoV S蛋白受体结合区与人IgG Fc片段融合表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选出阳性克隆,随后通过多次亚克隆筛选出稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定;通过MERS-CoV假病毒及活病毒中和试验筛选出中和单抗。结果获得了10株能够稳定分泌抗原特异性单抗的杂交瘤细胞株。制备的腹水单抗亚类均为IgG1;其中7株单抗抗体ELISA效价达到10 000以上,并有1株单抗对MERS-CoV具有良好的中和活性。结论本研究获得了1株对MERSCoV具有良好中和活性的单克隆抗体。     

抗软海绵酸单克隆抗体的制备

目的利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗软海绵酸(OA)的单克隆抗体(McAb).方法用碳化二亚胺法将半抗原OA与牛血清白蛋白(BSA)制备成完全抗原OA～BSA,用OA-BSA免疫BALB/c小鼠,使小鼠脾细胞产生抗OA的抗体.在聚乙二醇的作用下,使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合在一起,融合后的细胞用HAT选择培养,最后用ELISA法筛选出分泌抗OA McAb的杂交瘤细胞株.结果用碳化二亚胺法成功地将微量半抗原OA与BSA和卵清白蛋白(OVA)制成了完全抗原OA-BSA和OA-OVA.免疫小鼠血清中抗OA的抗体呈现阳性反应,表明小鼠脾细胞产生了抗OA的抗体.经3次抗体检测筛选出3株分泌抗OA MCAb的杂交瘤细胞株.结论抗OA McAb的成功制备为建立快速、经济的软海绵酸ELISA检测方法打下了坚实的物质基础,也为其它贝毒素检测方法的研究提供了可借鉴的经验.     

鼠疫菌免疫胶体金快速检测方法的建立

目的利用免疫胶体金技术建立一种简便、快速并适用于基层人员使用的鼠疫菌抗原检测方法。方法将抗鼠疫菌F1抗原的抗体致敏硝酸纤维素膜,用于捕获鼠疫抗原,然后用免疫胶体金颗粒进行标记。结果应用鼠疫菌免疫胶体金快速检测法最低可检出不同鼠疫菌(EV和Evp株)1.56×105CFU/ml,检测鼠疫菌F1抗原最低可检出1ng/ml,与鼠疫反向间接血凝法的检测结果一致;并且不与假结核小肠结肠炎等耶尔森菌以及其他相关细菌发生交叉反应。结论鼠疫菌免疫胶体金快速检测法具有较好的特异性、敏感性和简便快速的特点。     

对氧磷单克隆抗体的研制及鉴定

重氮化法使对氧磷（Ｅ６００）与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、血蓝蛋白偶合合成人工抗原。用人工抗原Ｅ６００－ ＢＳＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,然后将ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞和Ｅ６００－ ＢＳＡ免疫的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠脾脏细胞融合,成功的建立了能分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株。并分析了该细胞株的染色体及对其产生的单克隆抗体的类型、特异性、亲和力进行了鉴定和检测。上述杂交瘤细胞连续传代或冻存１０周,其分泌抗体水平稳定