聚乙烯亚胺包裹的磁性纳米颗粒用于基因载体的实验研究

目的：探讨聚乙烯亚胺(PEI)包裹的氧化铁磁性纳米颗粒中polyMAG-1000用于体外基因转导的可行性。方法：用扫描电镜观测polyMAG-1000的粒径；观察在不同的酸碱度下，将polyMAG-1000与pEGFP-N1质粒DNA按不同的比例(v：w)混合后，观察．polyMAG-1000结合和保护DNA的能力，并进行体外转染实验。结果：polyMAG-1000的直径约100nm，颗粒均匀，无论在酸性、中性和碱性条件下均能与质粒DNA稳定地结合；polyMAG-1000能把pEGFP质粒DNA导入肿瘤细胞中，进而表达绿色荧光蛋白。当polyMAG-1000与DNA比例为1：1时转染效率最高；加与不加磁场转染效率比较，差异具有显著性意义。结论：PEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒可用于体外基因转导，把PEI等基因导入载体与磁性纳米颗粒结合而形成的新型基因导入载体具有良好的应用前景。     

纳米颗粒能提高基因治疗效果

新的研究表明微小的硅石颗粒能充当DNA载体,提供一种非病毒方法的基因治疗.     

纳米基因载体的研究进展

近年来，基因治疗迅速发展。基因治疗的主要过程是目的基因的获取和高效的基因转染。基因治疗成败的关键是基因治疗的载体系统。高效、安全是载体应具备的最基本条件。目前基因转染常用的载体有病毒型载体和非病毒型载体。病毒型载体在当前批准进入临床试验的基因治疗中占75％，转染效率通常在90％以上，但病毒蛋白有诱发机体产生免疫反应、体内潜在的病毒复制、生产成本高、不能反复应用、无靶向性等缺点。特别是在1999年的基因治疗临床试验中出现腺病毒载体致人死亡事件后，人们把注意力与希望逐步转向非病毒载体。非病毒型载体虽然制备简单、无免疫原性和比较安全，但是转染效率低是其致命缺点，尤其是在血清蛋白存在的情况下。所以寻找一种既高效又安全的基因载体是基因治疗领域面临的最紧要课题。     

阳离子聚合物纳米基因载体的研究进展

由于阳离子聚合物等非病毒纳米基因导入载体安全、低毒、装载容量大、制备容易等优点已引起越来越多的关注，对提高其转导效率的研究也较多。该文作者对PLL和PEI等阳离子聚合物纳米基因载体的研究进展进行了综述。     

壳聚糖纳米颗粒作为基因载体的初步研究

目的:采用适当粒径大小的壳聚糖纳米颗粒(CS-NP)连接质粒DNA,观察CS-NP结合DNA的能力及介导基因转染的效率.方法:利用静电吸附作用连接CS-NP与报告基因pEGFP-N1,形成pEGFP-N1-CS-NP复合物.用透射电镜及激光粒度分析仪观察pEGFP-N1-CS-NP的形态、粒径大小、分布及Zeta电位.用琼脂糖凝胶电泳分析CS-NP与DNA结合能力,以比色法检测其包封率;用DNase I消化实验观察pEGFP-N1-CS-NP抗核酸酶降解的能力.体外转染A549细胞观察pEGFP-N1-CS-NP的转染活性.结果:激光粒度分析仪及透射电镜观察到pEGFP-N1-CS-NP呈较均匀的不规则球形,平均粒径约为100～200nm,Ztea电位为16～22.8mV.WCS-NP/WDNA≥4时,能有效地结合DNA,包封率＞90%.CS-NP能有效介导pEGFP-N1转染A549细胞,并在A549细胞中表达绿色荧光蛋白.结论:CS-NP能有效地与质粒连接,并有很高的包封率,能保护DNA免受核酸酶的降解.CS-NP在体外能将报告基因转染入细胞内,并在细胞内表达.这些研究结果为采用CS-NP作为基因载体应用于活细胞及活体成像的研究奠定了基础.     

自杀基因与肿瘤的基因治疗

随着人类基因组工程的实施进展，处在现代医学科技前沿的基因治疗(Gene therapy)将为解决一系列重要疾病，提供有效途径，自杀基因治疗(suicide gene therapy)即其中的重要方法之一。     

用于肿瘤基因治疗的慢病毒载体研究进展

基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其他难治性疾病的有效手段,但目前基因转移方法的局限性成为实现这一愿望的最大障碍.慢病毒(LV)属于逆转录病毒属的一个亚科,其中包括灵长类LV如人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-Ⅰ)、HIV-Ⅱ、猴免疫缺陷病毒(SIV)和非灵长类LV如Visna病毒、马传染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)等7个亚属.     

非病毒载体用于基因治疗技术的研究进展

基因治疗是一种用正常基因取代缺陷基因的治疗,自从20世纪90年代初首次成功进行了基因治疗的临床试验以来,迄今已完成了数千例基因治疗临床试验,目前大部分的试验仍采用转染率较高的病毒载体,其缺点在于潜在的致癌性、自身免疫原性和（或）造成细胞病理改变等。近年来非病毒基因治疗载体倍受关注,和病毒载体相比,非病毒载体具有低毒、低免疫反应、外源基因整合机率低、无基因插入片段大小限制,以及使用简单、制备方便、便于保存和检验等优势。     

基因治疗病毒载体的研究及应用

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用,因此它可用来治疗一些后天性和遗传性疾病,其成功与否的关键是载体。目前应用的载体主要有包括病毒和非病毒载体,但在基因治疗中应用最为广泛的载体是病毒载体。本文就近年来病毒载体系统在基因治疗中的应用及其改进等方面的研究进行综述。     

基因治疗用于乳腺癌的研究现状

乳腺癌（breast cancer,BC）是女性最为常见的恶性肿瘤,也是全球女性癌症死亡的主要原因。手术、放疗和化疗等常规治疗的效果往往不如预期。基因治疗通过纠正缺陷基因和调节基因的表达来达到预期的治疗效果,目前已成为一种有前景的乳腺癌治疗策略。在乳腺癌的基因治疗中通常使用病毒载体和非病毒载体作为递送载体。病毒载体具有较高的转基因效率,但病毒载体存在免疫原性较高、具有插入突变的风险和生物安全性等问题。非病毒载体与病毒载体相比,细胞毒性、免疫原性和诱变性均较低。但它还需要解决基因转移效率较低、特异性不足、基因表达持续时间短等问题。本文综述了目前利用病毒载体和非病毒载体治疗乳腺癌的研究现状,这些基因治疗载体各有优缺点,因此本文对目前使用的基因治疗载体进行相关概述。     

癌胚抗原启动子调控融合自杀基因yCDglyTK载体的构建及其应用研究

目的构建靶向性基因治疗载体pcDNA3．1（-）CryCDglyTK，研究癌胚抗原（CEA）启动子是否能控制新型融合自杀基因yCDglyTK在CEA阳性结肠癌细胞中专一性表达和杀伤作用。方法采用PCR、RT—PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3．1（-）cvvCDglyTK表达载体和分别由CEA启动子和巨细胞病毒（CMV）增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3．1（-）CEAyCDglyTK、pcDNA3．1（-）CMVyCDglyTK表达载体，以磷酸钙纳米为载体分别转染CEA阳性的人结肠癌细胞株LOVO细胞和CEA阴性的Hela细胞，采用RT—PCR、免疫荧光法检测感染细胞中yCDglyTK基因的表达，并用MIT法检测感染后细胞对5-氟胞嘧啶（5-FC）的敏感性。结果LOVO细胞在感染以上三种质粒表达载体后均有yCDglyTKmRNA表达，且对5-FC的敏感性明显增强，Hela细胞在纳米-pcDNA3．1（-）CMVyCDglyTK复合物感染后有yCDglyTKmRNA表达，对5-FC的敏感性增强，而在纳米-pcDNA3．1（-）CEAyCDglyTK及纳米-pcDNA3．1（-）CVyCDglyTK复合物感染后则没有yCDglyTKmRNA表达，5-FC对其亦无杀伤作用。结论该实验构建的由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因yCDglyTK靶向性基因治疗载体。能使融合自杀基因在CEA阳性细胞中专一性表达，从而达到靶向治疗肿瘤的目的。     

阳离子氧化铁纳米粒作为基因载体的体外实验研究

目的 探讨阳离子氧化铁纳米粒(Cationic IONPs)的制备及其作为体外基因裁体的可行性.方法 改进的共沉淀法制备Fe3O4纳米粒,利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)进行表面修饰.利用原子力显微镜,激光粒度分析仪,琼脂糖凝胶电泳等手段对Cationic IONPs的形貌、粒径、Zeta电位、DNA结合能力等进行表征.以增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)作为靶基因,荧光显微镜和流式细胞仪分别观察和测定Cationic IONPs和脂质体体外转染效率. 结果 Cationic IONPs粒径为(32.1±1.8)nm,在pH=7条件下,Zeta电位为(13.5±1.6)mV,与质粒质量比为1:1时结合效率最高,可以携带pEGFP-C1进入细胞并获得表达,转染效率为(32.8±5.2)%,高于阳性对照组LipofectamineTM 2000转染效率(28.8±5.6)%.结论 氨基硅烷偶联剂修饰的氧化铁纳米粒是一种可用于体外转染的新型非病毒载体.     

自杀基因联合细胞因子的癌症治疗

INTRODUCTION The transfer of suicide genes into tumor cells is currently being used in a variety of clinical gene therapy trials for the treatment of cancer, and suicide gene therapy is the transduction of a gene that transforms a non-toxic into a toxic substance[1].     

癌胚抗原相关细胞黏附分子6-shRNA及双自杀基因yCDglyTK的联合基因载体构建

目的 构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK-CEACAM6-shRNA.方法 根据已知的癌胚抗原相关细胞黏附分子6(Carcinoembryonic antigen associated cell adhesion molecule 6,CEA CAM6)序列构建含有hU6启动子和CEACAM6-shRNA表达框的重组质粒,并将CEACAM6-shRNA表达框(含hU6启动子)通过双酶切方式亚克隆至双自杀基因栽体pCDNA3.1-yCDglyTK,构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK-CEACAM6-shRNA.通过酶切、测序等鉴定重组质粒.结果 实验所构建的最终裁体酶切产物所得的片段大小为7.5 kb,与预期片段一致.测序证实最终载体与pCDNA3.1-ycDglyTK-CEACAM6-shRNA序列一致.结论 成功构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK-CEACAM6-shRNA.     

RV-HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的实验研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内的杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.体外实验中,Hela/TK细胞对丙氧鸟苷(GCV)的敏感性和旁观者效应采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定.动物试验中分别在BALB/C小鼠的右腋窝皮下按不同比例注射Hela/TK细胞和Hela细胞,然后给予GCV治疗.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中HSV-TK基因的表达情况.结果转染HSV-TK基因的Hela/TK细胞表现出比亲本Hela细胞更强的杀伤肿瘤效应.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg·ml-1)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示,GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,Hela/TK组和混合细胞组肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小52.8%和69.4%(均P＜0.001).小鼠的平均生存期也显著延长(P＜0.001).结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

壳聚糖纳米粒基因载体的制备和体外转染实验研究

目的制备基因载体壳聚糖纳米粒,研究其结构特征及其体外对细胞的转染活性。方法以复凝聚法制备壳聚糖-pDNA纳米粒;电镜测定其形态、粒径;凝胶电泳阻滞实验观察壳聚糖和pDNA的结合力;紫外可见分光光度计测定其负载力、负载率;体外转染人人胚肾细胞293T,荧光显微镜观察转染效率,CCK8法评价细胞毒性。结果壳聚糖-pGFP纳米粒多呈球形,直径为（132±48）nm;凝胶电泳阻滞实验示pGFP被完全包裹在纳米粒内;其负载力（LC）为（48．2±2．0）％,负载率（LE）为100％;体外转染实验证明壳聚糖-pGFP纳米粒能介导pGFP转染293T细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白;壳聚糖-pDNA抑制率（26．08±4．28）％。结论采用复凝聚法制备的壳聚糖-pDNA纳米粒可有效转染至细胞内,但有一定的细胞毒性。     

增强型自杀基因载体治疗宫颈癌的体外实验研究

目的探讨运用增强子增强hTERT启动子转录活性后，调控双自杀融合基因CDTK载体对人宫颈癌HeLa细胞的体外杀伤作用。方法将SV40增强子、CMV增强子、CMV增强子／启动子及SV40-CMV双增强子分别与hTERT启动子组合构建成报告基因载体。转染HeLa细胞后用双荧光素酶系统分析其活性差异；然后构建pHr—SCT／CDTKG治疗载体转染HeLa细胞，用流式细胞仅检测转染效率，RT-PCR检测融合自杀基因mRNA表达，HPLC检测5-Fu浓度，MTT分析载体杀瘤的效果。结果HeLa细胞中增强子能使hTERT启动子活性提高6-13倍，其中SV40-CMV双增强子／hTERT启动子的活性最高，达到CMV增强子／启动子的近3倍；体外转染pHr—SCT／CDTKG后可检测到cDTK的mRNA的表达；细胞上清中5-Fu最高浓度为50．83ug／mL；当5-FC浓度为200ug／mL、GCV浓度为10ug／mL时，HeLa细胞的相对细胞存活率为48．7％。结论SV40-CMV双增强子联合hTERT启动子能高效靶向的调控CDTK融合自杀基因杀伤宫颈癌细胞，因而是一种很有前景的基因治疗宫颈癌的策略。     

"两步转化法"高效制备携带自杀基因的重组腺病毒载体

目的采用“两步转化法”高效制备含胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的腺病毒重组载体。方法将质粒pAdEasy-1线性化后转化于BJ5183菌,制备AdEasy-1细菌;自载体pBS-CD中切出CD基因,亚克隆至穿梭质粒pAdtrackCMV上,构建的pAdtrackCMV-CD线性化后转化AdEasy-1细菌,抽提同源重组腺病毒质粒,PacⅠ酶切后转染293细胞,在293细胞中包装与扩增,利用GFP报告基因进行滴度测定。同时按“一步转化法”进行同样的重组腺病毒制备,比较二者的优劣性。结果“两步转化法”终产物17个克隆中13个正确,正确率为76.5%(13/17);“一步转化法”重组产物17个克隆中有2个正确,正确率为11.8%(2/17),两者具有显著性差异(P=0.000 17)。结论“两步转化法”细菌内同源重组是一种更高效、更方便的重组腺病毒制备方法。     

纳米粒子作为基因载体在不同动物模型上的基因转染效果

目的验证包载反义单核细胞趋化蛋白-1(A-MCP-1)质粒的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒子在不同动物模型上的基因转染效果。方法采用乳化溶剂挥发法制备A-MCP-1纳米粒子并进行体外物化表征。用血管平滑肌细胞进行体外基因转染,PCR法检测其转染效果。兔移植静脉内膜增生模型和大鼠腹主动脉瘤模型体内局部给予A-MCP-1纳米粒子,应用病理形态学分析、斑点杂交、原位杂交、Western blot等方法观察其在体内的基因转染效果和对内源性MCP-1基因表达的抑制作用。结果基因纳米粒子平均粒径为201·4nm,基因含量为4·14%,基因的包封效率为86%,体外可维持稳定释放两周以上。兔移植静脉内膜增生基因纳米粒子组的动脉组织中检测到明显的A-MCP-1表达,并抑制了正义MCP-1表达,内膜/中膜比为0·56±0·06,与对照组比较差异具有显著性(P<0·05),与阳离子脂质体1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)诱导的A-MCP-1质粒组比较,差异无显著性。大鼠腹主动脉瘤模型体内转染2周后,基因纳米粒子组腹主动脉直径为(1·79±0·12)mm,明显小于空白纳米粒子悬浮液组(2·58±0·21)mm和生理盐水组(2·63±0·29)mm(P<0·01)。MCP-1基因的mRNA和蛋白表达水平分别为12·5±1·5,17·6±2·1,明显低于空白纳米粒子悬浮液组35·7±4·5,42·3±5·7(P<0·01),生理盐水组32·4±3·9,39·8±4·8(P<0·01)。结论A-MCP-1基因纳米粒子用于兔移植静脉内膜增生模型以及大鼠腹主动脉瘤模型成功实现基因转染的研究结果,显示了其应用于临床的巨大潜力。