肠道病毒71型病毒样颗粒在汉逊酵母中的表达

目的应用汉逊酵母表达系统进行肠道病毒71型（EV71）病毒样颗粒（VLP）的表达。方法将经过汉逊酵母密码子优化的人EV71的 P1和3CD基因片段克隆到汉逊酵母表达载体PMV上,获得重组表达质粒PMV-P1-3CD,转化汉逊酵母宿主菌AU0501,PCR方法及稳定传代培养筛选整合P1和3 CD基因的重组菌株。重组菌种接种在含有1％甲醇的培养基中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot检测。挑选优胜表达菌株进行30 L发酵罐发酵培养,发酵产物经过粗略纯化后进行电镜分析。结果筛选获得EV71重组表达菌株;SDS-PAGE检测结果显示在相对分子质量（Mr）为26×103、33×103、35×103处有明显的VP3、VP1、VP0蛋白条带,Mr 大小与预期的目的蛋白大小一致;Western blot检测结果显示表达产物与EV71-VP1单克隆抗体在M r 为33×103处有较为明显的VP1反应条带,表达产物具有良好的免疫反应性;表达菌株发酵表达量可达200 mg/L,电镜分析可见24～30 nm的VLP,且颗粒结构完好。结论应用汉逊酵母表达系统成功表达了EV71 VLP,为今后研制EV71 VLP疫苗奠定基础。     

乙型肝炎表面抗原颗粒在毕赤酵母中的表达

毕赤酵母表达系统是一个高效异源蛋白表达工具，表达载体直接整合到酵母基因组上，可以产生遗传稳定的重组子，有类似于哺乳动物翻译后加工修饰的功能，可在成本低廉的无机盐培养基中进行高密度培养生产重组蛋白。为提高重组菌株表达的稳定性，本研究选用毕赤酵母表达系统，成功地表达了22nm HBsAg颗粒，为在毕赤酵母中开发生产乙肝疫苗提供了资料。     

离子交换膜层析纯化重组HBsAg的研究

 目的 评价离子交换膜层析方法纯化 CHO 细胞表达的重组 HBsAg 的效果以及该方法替代传统超速离心方法和离子交换柱层析方法的潜力。 方法 取 3 种不同纯化阶段的 CHO 细胞 C28 株表达的重组 HBsAg 样品进行试验，样品 1 为重组 HBsAg 经疏水层析柱纯化而成，样品 2 为样品 1 再经超速离心而成，样品 3 为样品 2 再经凝胶过滤层析而成。分别采用小试级别离子交换膜层析系统 SartobindQ MA75 down scale units和中试级别离子交换膜层析系统 Sartobind MultiSep ion exchange modules 对 HBsAg 样品 1 进行纯化，以 HBsAg、总蛋白回收率及 CHO 细胞残留蛋白含量评价纯化效果，并观察不同膜层析洗脱流速（60、120、180、240 cm/h）对离子交换膜层析系统 HBsAg 载量和纯化效果的影响。采用离子交换膜层析系统 SartobindQ MA75 down scale units 对 3 种不同纯化阶段的 HBsAg 样品进行层析并比较纯化效果。每个批次样品的试验均重复 3 次。 结果 HBsAg 样品 1 经两种 SartobindQ 离子交换膜层析系统进行纯化的效果无明显区别，均可有效去除杂蛋白，CHO 细胞残留蛋白含量均低于 0.05%，且 HBsAg 的回收率均大于 80%。在洗脱流速 60 ~ 240 cm/h 范围内离子交换膜 HBsAg 载量保持恒定，未见流速对纯化结果产生明显影响。3 种不同纯化阶段的 HBsAg 样品经离子交换膜层析系统 SartobindQ MA75 down scale units 纯化后均能达到满意的纯化效果，HBsAg 回收率分别为 89.7%、92.3% 和 94.1%，CHO 细胞残留蛋白含量分别为 0.03%、0.02% 和 0.01%。 结论 离子交换膜层析方法对 CHO 细胞表达的重组HBsAg 纯化效果良好，有望替代传统的超速离心方法和离子交换柱层析方法。     

重组人源抗HBsAg Fab的糖基化分析

目的：分析重组人源抗HBsAg Fab的糖基化。方法：应用PAS糖染色法和经酶切糖苷酶H去糖基后，用MALDI-TOF-MS质谱仪对重组人源抗HBsAg Fab的糖基化进行分析。结果：PAS染色法的结果显示，毕赤酵母（Pichia pastoris）表达的重组人源抗HBsAg Fab呈淡红色。用质谱仪测定P．pastoris表达的经内切糖苷酶H去糖基后的重组人源抗HBsAg Fab的相对分子质量（Mr），从50678．49降低到49245，相差1433．49（约相当于少了8个甘露糖基）。结论：P．pastoris表达的重组人源抗HBsAg Fab，为一种具有生物活性的低糖基化的蛋白，为深入研究其性质及功能奠定了基础。     

人源性抗HBsAg单链Fab基因在Pichia pastoris中的表达

目的：研究重组Fab的结构与亲和活性的关系：方法：通过重叠PCR，将人源性抗HBsAg Fab的H和L链基因融合构建单链Fab基因，并将其转入毕赤酵母表达载体pPICZαA中。以单链Fab基因表达载体通过氯化锂转化法转化毕赤酵母GS115。将获得的重组酵母在摇瓶中培养进行重组单链Fab的可溶性表达。表达上清经硫酸铵沉淀及亲和层析纯化后，用直接ELISA检测表达产物和纯化Fab的活性：结果：SDS—PAGE和Western blot分析显示，单链Fab在毕赤酵母中获得分泌型表达。薄层扫描显示，在摇瓶中培养毕赤酵母表达的单链Fab约为5～10mg／L。经亲和层析纯化获得纯度达97．8％的重组单链Fab。经直接ELISA测定的结果显示，重组单链Fab具有较好的结合HBsAg的活性。结论：通过重叠PCR构建的融合单链Fab基因，可成功地在毕赤酵母中获得分泌型表达，表达产物具有较好的结合HBsAg的活性。     

肝病毒表面抗原“a”决定簇病毒样颗粒的构建和鉴定

目的 构建一个以乙肝核心抗原为骨架的病毒样颗粒,乙肝表面抗原＂a＂决定簇呈现在该病毒样颗粒的表面.方法 乙肝adr血清型的HBsAg蛋白＂a＂抗原决定簇（aa139～148,CSKPTDGNCT）插入到HBcAg的第78位天冬氨酸和第79位脯氨酸之间,密码子优化之后基因合成,酶切后连接到表达载体上,在大肠埃希菌中进行表达,纯化后对蛋白进行电镜观察、ELISA检测抗原性、免疫兔后检测免疫原性.结果 构建得到预期的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达,纯化后电镜观察为病毒样颗粒,ELISA检测证实具有良好的抗原性和免疫原性.结论 成功获得预期的带乙肝表面抗原＂a＂决定簇的病毒样颗粒,为其应用奠定基础.     

EBV-LMP2蛋白的表达和初步纯化

目的 应用杆状病毒表达载体表达并纯化EB病毒LMP2蛋白.方法 利用杆状病毒Bac-to-Bae杆状病毒表达系统,将EBV-LMP2基因插入到质粒pFastBacTMHT B中,获得携带EBV-LMP2基因的重组杆状病毒Bac-LMP2.重组病毒感染Sf-9细胞,表达N端携带6个组氨酸（6 X His）的LMP2融合蛋白His-LMP2.经镍离子亲和层析纯化,获得纯化蛋白.结果 SDS-PAGE及Western-Blot检测表达的蛋白相对分子质量大小与预计结果一致.HPLC分析纯化后蛋白的纯度可达86%.结论 利用杆状病毒表达系统表达EB病毒LMP2基因并经过初步纯化后,可以获得较好纯度的LMP2蛋白.     

圣路易斯脑炎病毒样颗粒的真核表达、纯化与鉴定

目的 利用293T细胞表达、纯化圣路易斯脑炎病毒样颗粒（Virus like particles,VLPs）,为研制圣路易斯脑炎病毒免疫诊断试剂奠定基础.方法 构建含圣路易斯脑炎病毒PrM和E基因的重组质粒pcDNA5/FRT-SJME,瞬时转染293T细胞,表达并纯化重组蛋白,通过透射电镜、间接免疫荧光试验、Western-Blot和ELISA对其进行鉴定.结果 表达的重组蛋白形成50 nm的球型颗粒,能与抗圣路易斯脑炎病毒抗体产生特异性反应,与部分黄病毒属阳性血清发生交叉反应.结论 已成功在哺乳动物细胞中表达并纯化了圣路易斯脑炎病毒样颗粒,其具有良好的抗原性和完整的颗粒形态,为进一步研制圣路易斯脑炎病毒感染的免疫诊断试剂奠定了基础.     

登革病毒3型病毒样颗粒在酵母体内的表达与鉴定

目的探讨登革病毒3型病毒样颗粒（DENV3-VLPs）的免疫原性。方法用PCR法扩增登革病毒3型prME基因,插入载体pGAPZaA构建重组质粒pGAPZaA-prME-D3,将其转化毕赤酵母X33构建转化子pGAPZaA-prME-D3/X33。对转化子表达上清和细胞裂解液进行SDS-PAGE和Western blotting分析。用蔗糖密度梯度离心纯化表达的DENV3-VLPs并进行鉴定和电镜观察。结果成功构建重组载体pGAPZaA-prME-D3,获得酵母转化子pGAPZaA-prME-D3/X33,并应用毕赤酵母表达了DENV3-VLPs,表达蛋白约50000Mr,电镜观察VLPs直径为20～50nm。结论应用酵母表达系统成功表达了DENV-3VLPs,经鉴定表明其具有免疫反应性,为后续免疫原性研究及四价登革VLPs疫苗的构建奠定了基础。     

Ezrin的原核表达及与其相互作用蛋白的研究

目的体外筛选人胰腺癌细胞中与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。方法提取人胰腺癌Panc-1细胞总RNA,RT-PCR法扩增Ezrin基因。将扩增得到的Ezrin基因片段和pET15b质粒转化E．coli DH5α,获得pET15b-Ezrin重组质粒,双酶切后测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E．coliB L21-CodonPlus（DE3）-RIL,以异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,对表达产物进行Ni^2＋-NTA亲和层析和分子筛纯化后,行SDS-PAGE、MALDI—TOF—MS／MS质谱分析和蛋白质印迹鉴定。裂解Panc-1细胞,获得总蛋白提取液,采用Pull—down方法体外筛选与Ezrin重组蛋白相互作用的蛋白,并对筛选出的目的蛋白进行双向凝胶电泳和MALDI—TOF—MS／MS质谱鉴定。结果RT-PCR扩增出的Ezrin基因片段（1761bp）与理论DNA表达片段大小一致,测序鉴定显示克隆的Ezrin基因序列与GenBank报道序列相符。SDS—PAGE、质谱分析和蛋白质印迹分析显示纯化后Ezrin重组蛋白相对分子质量为69400,与质谱分析的相对分子质量结果相符,为带有His-6标签的特异蛋白。双向凝胶电泳和质谱鉴定结果共筛选出可与Ezrin重组蛋白相互作用的7种蛋白,其分别为RNA—binding motif protein39（RBM39）、Transgelin（TAGLN）、Albumin（ALBU）、Formin—1（FMN1）、Rho GTPases（RHGBA）、Tetratricopeptide repeat protein 16（TTC16）、Syntaxin—binding protein 1（STXBPI）。结论在大肠杆菌中成功表达、纯化了Ezrin蛋白,并在体外成功筛选出可信的与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。     

Bioconversion of methanol to formaldehyde: 1 by free whole cell and immobilized whole cell of yeast Hansenula polymorpha

Modified methylotrophic yeast Hansenula polymorpha (HP A16) was used in this study, which was obtained with recrossing a leucine oxotrophic yeast and a wild type Hansenula polymorpha CB4732 and was discovered by Ogata et al. The yeast is grown with methanol as a sole carbon source in which methanol oxidase (MOX) is a key enzyme of methanol metabolism. Because of its stability and low substrate specificity, alcohol oxidase is of considerable interest for a range of biotechnological processes. Various methanol feeding regimes were evaluated in an effort to increase the biomass concentration and productivity that could be achieved from fermentations using the other Hansenula polymorpha species. This yeast was grown by batch fermentation. The effects of conditions of inoculation media for increasing amount of MOX enzyme in peroksizomes of yeast with MOX activity were observed. The highest MOX activity of yeast was found within optic density of grown media of OD600 1.5, at 0.35 microM of methanol as used an oxotrophic substrate, at 35 degrees C temperature, at pH 7.0 of 0.1 M potassium phosphate buffer (KPB), at 40 microL of buffered yeast cell volume and at the incubation time of 50 minutes. Whole yeast cells were cultivated at above optimized incubation conditions. The cells were immobilized within the polyacyrlamide gels by entrapment method. Free whole cells and immobilized whole cells were compared using bioconversion percentages of methanol to formaldehyde.     

Transformation of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: cloning and expression of genes

We developed a host-vector system for transformation and gene cloning experiments using the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Regeneration of protoplasts in a medium containing polyethylene glycol before plating made transformation more efficient and reproducible (2 to 3 x 10(4) micrograms DNA). The frequency of transformation was significantly lower when dominant resistance marker Cup1r was used for transformant selection. The transformation system developed was used to clone the DNA fragment which complements functionally the defect in the dihydroxyacetone kinase (DHAK*) activity of a H. polymorpha mutant strain. The DNA insert isolated was shown to increase by up to ten times the activity of DHAK in transformants carrying recombinant plasmids. When recombinant plasmids were introduced into S. cerevisiae, the transformants obtained acquired the ability to grow on the medium with dihydroxyacetone as a sole carbon source and the activity of DHAK was observed.     

不同种类乙型肝炎表面抗原诱导小鼠早期细胞免疫应答的比较

目的 比较不同表达系统来源的乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)免疫小鼠诱导早期脾淋巴细胞抗原特异性细胞免疫应答的特点,探讨影响乙肝疫苗保护效果的因素.方法 3种HBsAg(汉逊酵母、CHO细胞和血源)分别皮下接种不同组小鼠(BALB/c,H-2d),每只3μg,于免疫后4d分离脾单个核细胞(MNC),经细胞分选仪(MACs)分选后,获得纯度高于90％的CD4+和CD8+T细胞,应用ELISPOT测定MNC、CD4+和CD8+T细胞体外刺激后所产生的细胞因子IFN-γ、IL-2斑点数( SFC).结果 细胞分选后,汉逊抗原诱导CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平和CD4+T细胞分泌IL-2水平均显著高于CHO抗原组(8/10、2/10,P=0.035;6/10、0/10,P=0.005).汉逊抗原组与血源抗原组CD8+T细胞经体外刺激诱导IFN-y全部阳转(10/10),但分泌水平上汉逊抗原组显著高于血源抗原组(t=2.479,P=0.035);汉逊抗原组诱导CD4+T细胞IFN-γ阳转率及分泌水平均显著高于血源抗原组(10/10、4/10,P=0.005;t=3.967,P=0.003).结论 乙肝抗原免疫小鼠4d即可诱导细胞免疫应答,且汉逊酵母抗原早期诱导抗原特异性IFN-γ、IL-2的能力显著高于CHO和血源抗原,与其临床考核母婴传播阻断HBV保护率显著优于CHO和血源乙肝疫苗相一致,为及时接种乙肝疫苗的必要性和高危新生儿选择接种乙肝疫苗的类型提供依据.     

乙肝表面抗原诱生γ-干扰素的研究

对 8名抗 HBs阳性健康成人 ,12名慢性乙肝患者外周血单个核细胞 (PBMC )分别用酵母菌表达的重组HBsAg ,s抗原第 12 0～ 147位氨基酸合成肽及重组HBsAg HBIG复合物刺激 ,测定特异性诱生γ 干扰素水平。结果 2 0名中有 14名产生了比对照更高的γ 干扰素。用重组HBsAg与合成肽为抗原诱生的γ 干扰素阳性数基本相符 ,但用HBsAg HBIG复合物诱生 ,仅有 7名产生升高的γ 干扰素。结果提示今后可用酵母菌表达的重组HBsAg特异诱生PBMC产生γ 干扰素 ,作为一种筛选病人与预测治疗性疫苗疗效的指标     

乙肝疫苗无（低）应答加大剂量再免疫效果分析

目的探讨乙肝疫苗接种后无（低）应答者加大剂量再免疫的效果,以提高乙肝疫苗预防接种的保护率。方法对近3年已完成标准乙肝疫苗免疫接种程序至少一年、复查乙肝病毒标志物均为阴性的健康人群,随机地接受3种再免疫方案,按常规程序（0、1、6个月）予肌肉注射。A组40例：进口重组乙肝疫苗（安在时）,每次剂量40μg;B组40例：安在时,每次剂量20μg;C组40例：国产重组乙肝疫苗,每次剂量20μg。在首针乙肝疫苗接种前及接种后第1、2、7个月（T1、T2、T7）采血检测抗-HBs。结果T1时,进口40μg组、进口20μg组和国产20μg组复种后应答率分别为45．0％（18／40）、37．5％（15／40）和30．0％（12／40）,3组应答率差异无统计学意义（χ^2=1．920,P=0．383）;T2和T7时,3组复种后应答率分别为67．5％（27／40）、47．5％（19／40）、40．0％（16／40）和77．5％（31／40）、55．0％（22／40）、50．0％（20／40）,进口40μg组应答率高于其余两组（χ^2为4．014～6．545之间,P均〈0．05）。T2和T7时,进口40μg组应答率差异无统计学意义（χ^2=1．003,P=0.317）。各组患者复种后均未出现严重副反应。结论对乙肝疫苗无（低）应答者增加疫苗剂量加强免疫是有效的措施,抗-HBs应答率随疫苗剂量增加而提高。进口40μg组加强2针即可,加强3针未能较加强2针明显提高抗-HBs应答率。     

不同剂量乙肝疫苗与HBIG联合免疫阻断HBV母婴传播的效果对比

目的 探讨10 μg和20 μg乙肝疫苗与HBIG联合免疫阻断HBV母婴传播的效果.方法 124例HBsAg阳性孕妇所生的婴儿随机分为两组,即10 μg乙肝疫苗组和20 μg乙肝疫苗组.婴儿于出生6h内及30 d分别注射200 IU HBIG,同时分别于出生24 h内、1个月及6个月注射3次10 μg或20 μg重组酵母乙肝疫苗.检测婴儿出生时以及1岁时血清HBV标志物.结果 两组新生儿血清HBsAg、HBeAg及抗-HBe阳性率与滴度之间差别均无统计学意义（P＞0.05）.所有新生儿血清HBV DNA水平均小于检测下限（500 U/ml）.出生12个月时,所有124例婴儿血清HBsAg和HBeAg检测结果均为阴性;血清HBV DNA水平均在检测下限以下;10 μg和20 μg乙肝疫苗组血清抗-HBs阳性率分别为90.3％和96.8％,差异无统计学意义（P＞0.05）;抗-HBs水平分别为325.5±342.2 mIU/ml和463.7±353.3 mIU/ml,后者显著高于前者（P=0.01）.而且,20 μg乙肝疫苗组产生高应答抗-HBs（＞ 100 mIU/ml）的比例显著高于10μg乙肝疫苗组（P =0.035）.结论 20 μg乙肝疫苗联合HBIG方案阻断HBV母婴传播的效果优于10 μg乙肝疫苗联合HBIG方案.     

Production and characterization of yeast killer toxin monoclonal antibodies.

Monoclonal antibodies were obtained after fusion of mouse myeloma cells with spleen cells isolated from mice primed with a crude extract of yeast killer toxin produced by a strain of Hansenula anomala. Hybridomas were selected by specific immunoassay reaction of their fluid with crude yeast killer toxin extract. Among the monoclonal antibodies, which were characterized by the Western blot technique, one (designated KT4) proved to have precipitating properties, thus permitting the neutralization of the killer activity of the toxin. Experiments in double immunodiffusion showed that monoclonal antibody KT4 produced homologous precipitin bands by reacting with either the crude toxin used as immunogen or a toxic extract of Hansenula mrakii. It is suggested that these monoclonal antibodies will be useful for the purification, characterization, and understanding of the bioactions of yeast killer toxins.     

国内外九种乙型肝炎基因工程疫苗的免疫效果研究

目的 比较各种乙型肝炎（以下简称乙肝）基因工程疫苗的人体免疫学特点及效果。方法 应用美国ＭＳＤ、Ａｍｇｅｎ公司、日本熊本、法国巴斯德、阿根廷莱茵美州公司五个国外厂家及北京、长春、深圳康泰三个国内厂家的酿酒酵母、哺乳动物细胞、牛痘毒重组、甲基营养型酵母４个表达系列、１２个批次的乙肝基因工程疫苗免疫７１５名６～１０岁小学生,使用放射免疫法（ＲＩＡ）、美国Ｂｂｂｏｔｔ试剂检测免后不同时间的抗－ＨＢｓ。结果 四个系列的乙肝基因工程疫苗免疫人体后安全有效;国产疫苗免后抗体高峰期出现在首针免后７个月;哺乳动物细胞疫苗的批间稳定性较好;酿酒酵母疫苗在峰值后的抗体水平下降幅度较小;含量１０μｇ／支的疫苗较５μｇ／支者显示出有持久的优势。甲基营养型酵母疫苗是国内首次观察;含量１０μｇ／支的疫苗较５μｇ／支者显示出有持久的优势。甲     

1．3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bew0细胞中的表达

目的构建1．3倍乙型肝炎病毒（HBV）全基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）一HBV1．3。并观察其在Bewo细胞中的表达。方法以质粒pMD18T—HBV上的HBVDNA序列为模板,构建1-3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBVDNA水平。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1．3倍HBV全基因表达载体．该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg。并可检测到高水平的HBVDNA。结论成功构建了1．3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）一HBV1．3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础。     

Occurrence of the general control of amino acid biosynthesis in yeasts

The response of three amino acid biosynthetic enzymes, threonine dehydratase, tyrosine aminotransferase and saccharopine dehydrogenase, to conditions of histidine, tryptophan or lysine limitation was investigated in 15 yeast species. The activities of all these enzymes increased about two- to fourfold as a result of action of the general control of amino acid biosynthesis in Brettanomyces anomalus, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Rhodosporidium toruloides, Saccharomyces cerevisiae and Yarrowia lipolytica. No evidence for the existence of the general control was found in Candida brumptii, Candida utilis, Hansenula anomala, Hansenula henricii, Kluyveromyces marxianus, Pichia guilliermondii, Saccharomycopsis capsularis, Trichosporon adeninovorans and Trigonopsis variabilis.