不同增殖能力结肠癌细胞株iNOSmRNA表达的比较研究

目的:探讨iNOSmRNA在结肠癌不同增殖能力细胞株中的表达和作用,研究ATRA对于结肠癌不同增殖能力细胞株iNOSmRNA表达的影响。方法:采用MTT方法确定结肠癌细胞株CW-2和LS174T的生长增殖状况,用RT-PCR和Northernblot方法检测结肠癌中iNOSmRNA的表达量。结果:MTT生长曲线显示结肠癌细胞株LS174T的生长增殖比CW-2快;RT-PCR显示CW-2细胞株有较强的iNOSmRNA表达,而LS174T细胞株iNOSmRNA的表达较弱;Northernblot检测在CW-2中有明显的iNOSmRNA表达,但在细胞株LS174T中表达相对较弱;ATRA对结肠癌CW-2和LS174T细胞株iNOSmRNA的表达量无明显影响。结论:iNOSmRNA对结肠癌细胞株生长有双重作用,即在低增殖结肠癌CW-2呈高表达,可以通过细胞毒或诱导细胞凋亡等作用发挥抗肿瘤效应;在高增殖结肠癌LS174T呈低表达,产生NO作为信号转导的重要分子,增加血供和血管生成,促进肿瘤生长、侵袭和转移。ATRA可以抑制结肠癌细胞株的生长。     

全反式维甲酸对不同增殖潜能的结肠癌细胞株HIF-1α表达的影响

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对不同增殖结肠癌细胞系的生长抑制作用,以及对低氧诱导因子(HIF-1α)表达的抑制作用。方法:采用体外培养属于结肠癌DukesC期的HCT-8细胞和LOVO细胞,不同浓度的全反式维甲酸(ATRA)干预。利用MTT观察ATRA对结肠癌细胞系的生长,采用半定量RT-PCR和Western印迹检测ATRA干预后在低氧状态下结肠癌细胞中HIF-1α的表达。结果:全反式维甲酸(ATRA)对结肠癌细胞的增殖有抑制作用,对不同增殖能力的结肠癌细胞HIF-1α的表达量有抑制作用。结论:全反式维甲酸可以抑制结肠癌细胞的增殖,对结肠癌细胞HIF-1α的表达有明显的抑制作用。     

非甾体类抗炎药对结肠癌细胞NAG-1 基因表达的诱导

研究非甾体类抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drug,NSAID)对结肠癌细胞生长的影响及NSAID活化基因-1(NAG-1)的诱导作用。体外培养HT-29、SW480及LS174-T三种结肠癌细胞,分别加入不同浓度的aspirin、celecoxib及meloxicam作用于HT-29及SW480细胞,采用MTT法检测结肠癌细胞增殖;蛋白质印迹技术检测三种结肠癌细胞COX-2的表达;采用半定量RT-PCR技术分析NSAID对三种结肠癌细胞NAG-1基因表达的影响。aspirin、celecoxib及meloxicam均能有效抑制体外培养的HT-29、SW480结肠癌细胞生长,并具有良好的量-效关系。Western blot表明,HT-29细胞表达COX-2,而SW480细胞不表达COX-2。三种结肠癌细胞均表达NAG-1基因mRNA,其中LS174-T细胞NAG-1基础水平较低;NSAID能不同程度上调结肠癌细胞NAG-1基因表达。NSAID能有效抑制结肠癌细胞生长,这种作用可能部分通过诱导结肠癌细胞NAG-1基因表达实现,NAG-1基因表达不受肿瘤细胞是否表达COX-2的影响。     

蟾蜍灵对结肠癌SW-480细胞polo-like kinase-1表达及细胞凋亡的影响

目的：观察蟾蜍灵对人结肠癌细胞系增殖的抑制作用，并探讨其作用机理。 方法： 采用不同浓度的蟾蜍灵作用结肠癌SW-480细胞后，采用MTT法检测细胞的恶性增殖，分别采用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡情况，分别采用Western blotting、Northern blotting分别检测polo-like kinase-1 (PLK1)蛋白、mRNA水平。 结果： 蟾蜍灵能抑制结肠癌细胞的恶性增殖，且与浓度相关。蟾蜍灵能诱导结肠癌细胞凋亡，且呈浓度依赖性。流式细胞仪检测发现，蟾蜍灵将细胞阻滞在G2/M期。蟾蜍灵能下调结肠癌PLK1蛋白、mRNA水平，且呈药物浓度和作用时间依赖性。 结论： 蟾蜍灵有效地抑制结肠癌SW-480细胞增殖，其机制可能与其下调PLK1表达，从而诱导凋亡有关。     

阿司匹林与氟尿嘧啶协同抑制结肠癌细胞生长增殖的机制研究*

 目的：检测阿司匹林与氟尿嘧啶协同抑制结肠癌细胞生长增殖的能力及相关作用机制。方法：将体外培养的结肠癌细胞分为4组：空白对照组、阿司匹林组、氟尿嘧啶组和阿司匹林+氟尿嘧啶组,采用MTT法检测阿司匹林和氟尿嘧啶抑制结肠癌细胞增殖的效果,采用Hoechst 33258染色、caspase活性检测和流式细胞术检测研究药物诱发凋亡的作用及机制,采用real-time PCR和Western blotting方法检测药物对凋亡相关蛋白表达的调控作用。结果：氟尿嘧啶有效抑制HCT116和SW620结肠癌细胞增殖,且低浓度阿司匹林具有协同抑制的效果。氟尿嘧啶诱发HCT116细胞核出现明显的凋亡形态,caspase酶活性增高及sub-G1期比例增加。阿司匹林协同作用明显提高HCT116细胞凋亡的比例和caspase酶活性。此外,低浓度阿司匹林可以显著增强氟尿嘧啶抑制Bcl-2 mRNA及蛋白表达的效果。结论：阿司匹林和氟尿嘧啶具有协同抑制结肠癌细胞生长增殖的效果,且主要通过诱发细胞凋亡发挥作用。     

EGCG抑制肝癌细胞株HepG2增殖及HIF-1α/VEGF的表达

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抑制肝癌生长的分子机制。方法:采用MTT方法观察EGCG对HepG2细胞株增殖的影响;利用体外厌氧培养技术,通过不同剂量的EGCG进行干预,检测肝癌细胞HIF-1α/VEGF的基因转录和蛋白表达;将肝癌细胞种植于裸鼠体内,观察EGCG对肿瘤生长的抑制作用,并且测定HIF-1α/VEGF的表达。结果:体外试验显示EGCG对肝癌细胞株HepG2的增殖有明显抑制作用;明显下调HIF-1α/VEGF蛋白的表达,而对HIF-1α基因转录影响不大;裸鼠体内试验中观察到EGCG对肿瘤生长有明显抑制作用,抑制率达39.8%±5.1%。结论:EGCG可明显抑制肝癌细胞的增殖,干预HIF-1α/VEGF信号转导通路可能是其抑制肿瘤生长的主要机制之一。     

CD40配体对结肠癌细胞株的体外抑制作用

研究免疫共刺激分子CD40在结肠癌细胞株的表达及重组可溶性人CD40配体(rshCD40L)对结肠癌细胞株的体外抑制作用。采用流式细胞仪分别检测4株结肠癌细胞(HCT116、Caco-2、SW48和COLO-320)CD40分子的表达,同时利用流式细胞仪检测γ干扰素(IFN-γ)对结肠癌细胞株CD40表达的影响。MTT法检测rshCD40L对结肠癌细胞的抑制作用,TUNEL法检测rshCD40L对结肠细胞的促凋亡作用,同时检测联合rshCD40L和IFN-γ抗结肠癌作用。结果流式细胞仪检测有3株结肠癌细胞(HCT116、Caco-2和SW48)表达CD40分子,IFN-γ能增强CD40+结肠癌细胞CD40分子的表达。rshCD40L能明显抑制CD40+结肠癌细胞的增殖作用(抑制率分别为HCT116:33.5%±5.5%;Caco-2:21.5%±3.6%;SW48:30.1%±4.2%),而对CD40-结肠癌细胞株(COLO-320)无明显抑制作用(P<0.05)。rshCD40L能诱导CD40+结肠癌细胞的凋亡作用(凋亡细胞百分比为HCT116:25.6%±4.52%;Caco-2:15.71%±2.27%;SW48:18.0%±3.7%),而对CD40-结肠癌细胞株(COLO-320)无诱导凋亡作用(P<0.05)。另外,IFN-γ能明显增强rshCD40L对结肠癌细胞的抑制增殖和促凋亡作用。重组人CD40配体与IFN-γ联合可显著诱导CD40阳性的结肠癌细胞凋亡,抑制其增殖,具有潜在的抗肿瘤作用。     

RNAi沉默Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的抑制

目的：研究Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的影响。方法:设计合成针对Cripto基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，转染结肠癌LS-174T细胞。细胞分4组：空载对照组（对照组）和不同浓度（3.125、6.25和12.5 nmol/L）的siRNA组。分别于转染24、48、72 h后收集细胞，以实时定量PCR检测结肠癌细胞Cripto mRNA，分别采用Northern blotting和免疫荧光标记法检测癌细胞VEGF mRNA和蛋白表达。分别收集转染72 h的12.5 nmol/L组和对照组细胞，接种于裸鼠背部。30 d后处死裸鼠，收集裸鼠肿瘤组织，对组织VEGF进行免疫组化染色，计算染色平均强度。结果:实时定量PCR检测显示，转染组Cripto mRNA被有效地抑制，且呈浓度和时间依赖性。转染组细胞VEGF 蛋白和mRNA明显低于对照组。裸鼠肿瘤免疫组化分析显示，转染组VEGF平均染色强度明显低于对照组。结论:Cripto基因参与了结肠癌组织血管生成的调控。采用siRNA下调Cripto基因表达，可抑制结肠癌组织血管生成。     

反义VEGF165基因转染对人神经母细胞瘤生物学行为的影响

目的探讨反义VEGF165基因转染在抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长中的作用。方法构建正义和反义VEGF165真核表达载体,用脂质体转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,G418筛选稳定表达细胞克隆。应用RT-PCR证实外源性反义VEGF mRNA的表达,免疫细胞化学和EUSA检测VEGF蛋白的表达水平,MTT法检测肿瘤细胞体外生长情况,并接种于裸鼠皮下,观察体内肿瘤增殖能力。结果RT-PCR证实转染反义VEGF的细胞中有外源性反义VEGF mRNA的表达,免疫细胞化学和EUSA显示VEGF蛋白表达明显降低,MTT实验显示转染前后细胞体外生长速度基本一致。而转染反义VEGF的肿瘤细胞裸鼠体内生长速度明显减慢。结论反义VEGF基因转染能够有效抑制SH-SY5Y细胞内源性VEGF蛋白的表达,抑制裸鼠体内肿瘤的生长。     

基因Hath1表达对结肠癌细胞的抑制作用

目的研究Hath1基因对结肠癌细胞体外增殖的抑制作用。方法用trizol试剂提取肿瘤细胞总RNA,定量逆转录PCR法检测Hath1在结肠癌细胞和正常组织细胞中的表达;MTS和流式细胞仪法分别检测Hath1在结肠癌细胞中的增殖率和凋亡百分率;构建IEC-6稳定表达Hath1siRNA细胞系,检测Hath1siRNA对IEC-6细胞生长的影响。结果在正常人的小肠与结肠组织及大鼠小肠上皮细胞IEC-6中有着比较高水平的Hath1的表达,而在4株结肠癌细胞中Hath1的表达都很低。在表达Hath1的4株结肠癌细胞SW480、HT29、LS174T、SW620中,其细胞增殖率分别被抑制了38.5%、23.4%、55%、35.6%。在LS174T细胞中Hath1不能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。siRNA干扰试验进一步证明了Hath1起到肿瘤抑制基因的作用。结论 Hath1不能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

外源性骨桥蛋白对人大肠癌LS-174T细胞增殖和侵袭能力的影响

目的观察人重组骨桥蛋白(recombinated human osteopontin,rhOPN)对大肠癌LS-174T细胞增殖、侵袭及其相关基因表达的影响,探讨骨桥蛋白在大肠癌演进中的作用。方法添加不同浓度rhOPN于人大肠癌LS-174T细胞培养液中,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)试验检测细胞的增殖能力,重组人工基底膜实验评价细胞侵袭能力,并运用实时荧光定量RT-PCR检测大肠癌细胞中尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)等mRNA表达水平。结果LS-174T细胞经不同浓度rhOPN作用24h后,实验组的MTT值显著高于对照组(P<0.01),并呈剂量依赖关系。Transwell上室加入5nmol/L、30nmol/L的rhOPN后,实验组LS-174T细胞穿膜数量明显多于对照组(P<0.05)。经5nmol/L、30nmol/L的rhOPN处理24h后,实验组LS-174T细胞的uPA mRNA及VEGF mRNA的表达水平明显高于对照组(P<0.05),而MMP-2 mRNA表达水平与对照组无显著性差别(P>0.05)。结论rhOPN促进人大肠癌LS-174T细胞的增殖,并提高其侵袭能力,可能与uPA和VEGF基因表达上调有关。     

小白菊内酯对胰腺癌细胞BxPC-3增殖和凋亡的影响及机制

目的： 探讨小白菊内酯对人胰腺癌BxPC-3细胞增殖和凋亡的影响及其可能的分子机制。方法: 应用MTT法观察不同浓度小白菊内酯对BxPC-3细胞增殖的影响；流式细胞术及DNA梯状电泳（DNA ladder）检测BxPC-3细胞凋亡的改变；Western blotting法检测不同浓度小白菊内酯作用下BxPC-3细胞COX-2蛋白水平的改变，RT-PCR法检测COX-2 mRNA水平的变化。 结果: MTT、流式细胞术及DNA ladder显示小白菊内酯呈剂量依赖性地抑制BxPC-3细胞的增殖，并诱导其凋亡； Western blotting和RT-PCR法显示随着药物浓度的增加，COX-2蛋白及mRNA表达降低。结论: 小白菊内酯对人胰腺癌BxPC-3细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用，这种效应可能与COX-2表达有关。     

不同人结直肠肿瘤细胞系对常用抗肿瘤药物体外化疗敏感性的比较

 目的：观察5种常用抗肿瘤药物对这些人结直肠肿瘤细胞系的生长抑制作用,探讨5种常用抗肿瘤药物对11株人结直肠肿瘤细胞系的作用强度以及比较其体外敏感性,研究不同抗肿瘤药物对人结直肠癌细胞系HCT116和SW480热休克蛋白27（HSP27）和HSP70表达水平的影响。方法：采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法检测5种常用抗肿瘤药物分别对11株人结直肠肿瘤细胞系的生长抑制效应,计算50%抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC50）及敏感指数,并比较不同人结直肠肿瘤细胞系对5种抗肿瘤药物的敏感性,Western blotting检测HSP27和HSP70蛋白表达水平。结果：11株人结直肠肿瘤细胞系对5-氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂(OHP)均比较敏感,没有明显耐药性;5株人结直肠肿瘤细胞系对丝裂霉素(MMC)敏感,6株中度敏感;除SW1116 外的10株人结直肠肿瘤细胞系都对多西紫杉醇(DXL)敏感,而SW1116细胞对DXL表现出明显耐药性;除LS174T和SW1116外的9株人结直肠肿瘤细胞系都对伊立替康(IFL)表现出中度敏感,LS174T细胞对IFL表现敏感,而SW1116细胞对IFL表现出明显耐药性。抗肿瘤药物作用于人结直肠癌细胞系HCT116和SW480使HSP27的表达上调,但HSP70的表达水平变化不明显。结论：LS174T是多药敏感细胞株,SW1116是多药耐药细胞株,5-FU和OHP为广谱抗结直肠肿瘤药物;化疗药物的敏感性及HSP27表达量检测对临床选择化疗药物具有一定的提示意义。     

HL-60细胞ATRA诱导后MMP-9/TIMP-1表达的变化

为了检测HL-60细胞经过全反式维甲酸(ATRA)诱导后基质金属蛋白酶(MMP-9、MMP-2)及金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)表达变化,并探讨其变化的意义。采用瑞氏染色观察细胞形态,WST1实验测定细胞增殖变化,NBT还原实验测定细胞分化状态,RT-PCR方法检测MMP-9、MMP-2、TIMP-1、VEGF的mRNA的表达。结果显示,HL-60细胞经ATRA作用24h后,随着细胞增殖降低与分化的发生,MMP-9mRNA表达增加,TIMP-1mRNA和VEGF表达降低,MMP-2mRNA未见明显表达。ATRA诱导HL-60细胞分化后MMP-9表达增加,而TIMP-1表达降低,MMP-9不促进HL-60细胞表达VEGF。     

Effect of host microenvironment on the microcirculation of human colon adenocarcinoma.

It is generally accepted that the host microenvironment influences tumor biology. There are discrepancies in growth rate, metastatic potential, and efficacy of systemic treatment between ectopic and orthotopic tumors. Liver is the most common and critical site of distant metastasis of colorectal carcinoma. Tumorigenicity and efficacy of chemotherapeutic agents in colorectal tumors are different in liver and subcutaneous sites. Thus, we hypothesize that the liver (orthotopic) versus subcutaneous (ectopic) microenvironment would have different effects on the angiogenesis and maintenance of the microcirculation of colorectal tumor. To this end, we developed a new method to monitor and to quantify microcirculatory parameters in the tumor grown in the liver. Using this approach, we compared the microcirculation of LS174T, a human colon adenocarcinoma, metastasized to the liver with that of the host liver vessels and that of the same tumor grown in the subcutaneous space. In the liver metastasis model, 5 x 10(6) LS174T cells were injected into the spleen of nude mice. Four to eight weeks later, the liver with metastatic tumors was exteriorized and placed on a special stage and observed under an intravital fluorescence microscope. The dorsal skinfold chamber model was used to study the subcutaneous tumors. Red blood cell velocity, vessel diameter, density, permeability, and leukocyte-endothelial interactions were measured using fluorescence microscopy and image analysis. Vascular endothelial growth factor/ vascular permeability factor (VEGF/VPF) mRNA expression was determined by the Northern blot analysis. LS174T tumor foci in the liver had tortuous vascular architecture, heterogeneous blood flow, significantly lower vascular density, and significantly higher vascular permeability than normal liver tissue. Tumors grown in the liver had significantly lower vessel density, especially in the center coincident with central necrosis, than the subcutaneous tumors. The frequency distribution of vessel diameters of liver tumor was slightly shifted to smaller size compared with that of subcutaneous tumor. Leukocyte rolling in liver tumor was twofold lower than that in subcutaneous tumor. These physiological findings were consistent with the measurement of VEGF/VPF in that the VEGF/VPF mRNA level was lower in the liver tumor than that in the subcutaneous tumor. However, macromolecular vascular permeability in the liver tumor was significantly higher than in the subcutaneous tumor. Liver sinusoidal endothelial cells, the origin of liver tumor vessel endothelium, are known to be fenestrated and not to have a basement membrane, suggesting that the difference in endothelial cell origin may explain the difference in tumor vascular permeability in two sites. These findings demonstrate that liver microenvironment has different effects on some aspects of the tumor angiogenesis and microcirculation compared with the subcutaneous tissues. The new model/method described in this paper has significant implications in two research areas: 1) the liver microenvironment and its effect on tumor pathophysiology in conjunction with cytokine/ growth factor regulation and 2) the delivery of drugs, cells, and genes to liver tumors.     

Paracrine signalling in colorectal liver metastases involving tumor cell-derived PDGF-C and hepatic stellate cell-derived PAK-2

In a nude mouse model of colorectal liver metastases, we have identified a paracrine tumor cell/host cell signalling pathway that is apparently required for successful tumor growth. Whereas recombinant platelet derived growth factor-C (PDGF-C) and supernatants from PDGF-C secreting wild type LS174T colon carcinoma cells could rescue tumor promoting hepatic stellate cells (HSC) from growth inhibition by serum starvation, supernatants from LS174T colon carcinoma cells with reduced secretion of PDGF-C had much less effect on serum starved HSC. Autocrine growth inhibition of LS174T cells by PDGF-C knock-down was only marginal. In vivo, a prominent inhibition of liver metastasis was observed if PDGF-C was knocked-down in LS174T cells. By whole genome array analysis of host cells of the invasion front and subsequent immunohistochemical staining we identified p21 activated kinase-2 (PAK-2) as being strongly and specifically expressed by HSC. The above described effect of PDGF-C on HSC was found to be dependent on PAK-2 because in contrast to wild type HSC, silencing of PAK-2 in HSC only allowed for a partial PDGF-C-mediated rescue from serum starvation leading to only a slight increase of proliferation. These data indicate that PDGF-C promotes tumor growth via a growth promoting effect on HSC that is at least in part dependent on the presence of functional PAK-2.