动脉内膜损伤及三种反义c-myc RNA的作用

了解反义ｃ－ｍｙｃ基因导入对血管壁的影响。方法将分别载有ｃ－ｍｙｃ第１、２和３外显子反义片段的三种重组逆转录病毒表达载体ａＭ１、ａＭ２和ａＭ３导入球囊损伤的兔股动脉壁,并于术后２１天表达检测。     

应用荧光原位杂交技术在人肺癌中发现c－myc基因易位

基因易位是癌基因激活的一种机制，但是以往检测基因改变的方法较难检测基因易位。我们建立了荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）技术，井应用这项技术在人肺癌细胞系ＧＬＣ－８２和１例经ＳＶ４０Ｔ转化了的人支气管上皮细胞中发现了癌基因ｃ－ｍｙｃ易位。在ＧＬＣ－８２细胞系中ｃ－ｍｙｃ基因易位到一条Ｃ组大小标记染色体的短臂。在ＳＶ４０Ｔ转化支气管上皮细胞中ｃ－ｍｙｃ易位到１４ｑ３２，提示ｃ－ｍｙｃ基因易位可能在肺癌起因中起重要作用。     

小儿恶性淋巴瘤C-myc基因的表达及其临床意义

为了探明小儿恶性淋巴瘤与Ｃ－ｍｙｃ基因的关系,本文采用免疫组化法检测３３例该瘤石蜡切片中Ｃ－ｍｙｃ基因的表达水平。结果显示：肿瘤组的Ｃ－ｍｙｃ染色阳性率为３９．４％,其中,Ｔ细胞型淋巴瘤为１１．１％,Ｂ细胞型淋巴瘤和何杰金病均为５０．０％,反应性增生组的阳性率仅为８．９％,表达Ｃ－ｍｙｃ基因的表达与小儿恶性淋巴瘤,特别是与Ｂ细胞型淋巴瘤及何杰金病的发生有一定关系。     

三种反义c—myc RNA的瞬时表达对血管平滑肌细胞的体外生？…

目的 了解癌基因ｃ－ｍｙｃ分子中各个区域的作用，找出最佳的反义封闭靶区，为ｃ－ｍｙｃ表达增高相关疾病的基因治疗提供依据。方法 系统地构建了人类３种反义ｃ－ｍｙｃ重组逆转录病毒表达载体（ａＭ１、ａＭ２和ａＭ３），分别载有ｃ－ｍｙｃ和第１、２和３外显子的反义片段，经脂质体转染大鼠主动脉平滑肌细胞，并于转染后４８ｈ采用流式细胞仪对细胞进行瞬时表达检测。结果 与对照组相比，ａＭ２使ｃ－ｍｙｃ表达量减少了３     

喉癌组织中C－myc癌基因扩增的研究

本文应用核酸分子杂交技术对喉癌组织中Ｃ－ｍｙｃ癌基因扩增进行了研究，结果发现：①喉癌组织中具有Ｃ－ｍｙｃ癌基因扩增，其平均扩增倍数为正常喉组织的２．３倍。②Ｃ－ｍｙｃ癌基因扩增水平与喉癌临床分期有关。表现为Ｎ期肿瘤Ｃ－ｍｙｃ基因扩增明显高于Ｉ期和Ⅱ期，Ⅲ期又明显高于１期。本研究结果表明：在喉癌组织中Ｃ－ｍｙｃ基因以扩增形式被激活，激活后的癌基因对喉癌的发生、发展可能起着重要的作用；Ｃ－ｍｙｃ基因扩增与喉癌发展阶段相关，其扩增程度随着肿瘤的病期增高而增高，揭示Ｃ－ｍｙｃ癌基因扩增水平有可能作为肿瘤病情进展和恶性度的指标。本实验从基因水平上探讨了喉癌组织中Ｃ－ｍｙｃ癌基因的激活方式，为今后进一步研究喉癌发生发展机理以及对肿瘤进行基因诊断、治疗提供了实验依据．     

乳腺癌

目的探讨肿瘤多药抗性（ｍｄｒ１）的基因调控及其特异的凋亡机制。方法在建立的ｍｄｒ１肿瘤裸鼠的瘤组织中,采用ＡＢＣ免疫组化法,检测Ｐ－１７０、ｃ－ｍｙｃ、野生型ｐ５３、ｐ１６、Ｆａｓ和Ｂｃ１－２等蛋白的表达。结果发现ｍｄｒ１肿瘤细胞的ｃ－ｍｙｃ表达增强;经抗ｍｄｒ１－ｒｉｂｏｚｙｍｅ部分逆转ＭＤＲ表型后,ｍｄｒ１肿瘤细胞的ｐ５３表达有所升高。结论ｃ－ｍｙｃ、ｐ５３可能参与了对ｍｄｒ１基因表达的调控,其中ｃ－ｍｙｃ可能起着激活ｍｄｒ１基因转录的作用。实验还发现ｍｄｒ１肿瘤细胞的Ｆａｓ蛋白缺失、Ｂｃ１－２表达升高,提示ｍｄｒ１肿瘤可能拥有自己特异的凋亡调节机制。     

Ribozyme基因对人肿瘤细胞株MCF—7／Adr多药抗药性的靶向逆转

设计合成能切割人ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因并构建成真核细胞表达克隆（ｐＨβＡｐｒ－１ｎｅｗ／５ｍＲ３），以靶向切割耐药癌细胞株（ＭＣＦ－７／Ａｄｒ）的ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ，抑制Ｐ－糖蛋白的表达，逆转多药抗药性。方法将含Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因的真核细胞表达克隆转染ＭＣＦ－７／Ａｄｒ细胞，采用斑点杂交和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术测得Ｒｉｂｏｚｙｍｅ能在细胞中稳定表达，并使细胞中ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ降解８３．５％，Ｐ－糖蛋白表达明显下降（ＡＢＣ法）。结果Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因转染的ＭＣＦ－７／Ａｄｒ细胞耐药性下降至敏感细胞的６倍，而无Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因转染的ＭＣＦ－７／Ａｄｒ耐药性是敏感细胞的１０００倍。结论这种基因调控技术介入可能将为肿瘤耐药的治疗开辟一个新领域。     

三种反义c—mycRNA稳定表达对血管平没肌细胞生长,增殖的影响

目的 研究反义基因在细胞中持续、稳定表达对平滑肌细胞生长增殖的影响。方法 将分别载有ｃ－ｍｙｃ第１、２和３外显子反义片段的三种重组逆转录病毒表达载体ａＭ１、ａＭ２和ａＭ３导入大鼠主动脉平滑肌细胞（ＳＭＣ）,并于持续筛选后１个月进行稳定表达检测。结果 ａＭ１和ａＭ２能持续抑制靶细胞Ｍｙｃ蛋白表达（分别为对照表达量的５９．７％和８１．３％）、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达９分别为对照表达量的５２．４％和５１．９％）,抑制靶细胞的生长增殖活性并以ａＭ２作用最强（抑制率达到３０％）,同时,ａＭ２还有一定的延长细胞周期和减少ＤＮＡ合成的作用,而ａＭ３作用相反。另外,与瞬时表达相比,外源基因在靶细胞中的作用并非一成不变,而基因转染操作对细胞的影响会随着细胞的代偿逐渐减少并在短期内消失。结论 对ｃ－ｍｙｃ中不同区域进行反义封     

喉鳞癌中C—myc基因表达与预后

研究喉鳞癌中Ｃ－ｍｙｃ基因表达与预后的关系。方法应用免疫组织化学ＡＢＣ法检测６４例喉鳞癌、１０例喉乳头状瘤、６例喉正常粘膜组织中Ｃ－ｍｙｃ基因的表达。结果１．Ｃ－ｍｙｃ在上述３种组织中表达率分别为７０％、３０％、０％,差别有显著性（Ｐ＜０．０１）;２．Ｃ－ｍｙｃ表达与喉鳞癌ＴＮＭ分期、颈淋巴转移及５年生存期相关（Ｐ＜０．０５）。结论Ｃ－ｍｙｃ在喉上皮中的分布与其恶性程度相关,Ｃ－ｍｙｃ表达可作为喉鳞癌病情进展和预后不良的客观指标。     

人宫颈癌组织中c—myc基因的表达

目的 研究人宫颈癌组织中ｃ－ｍｙｃ基因的表达。方法 应用Ｄｉｇ标记ｃＤＮＡ探讨，ＤＮＡ－ｍＲＮＡ原位杂交技术检测３７例人宫颈鳞状细胞癌内癌基因ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ。结果 ３７例中１６例有ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ表达，检出率为４３．２４％，ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ主要分布在癌细胞胞浆内。结论 ｃ－ｍｙｃ癌基因表达在宫颈癌发生中可能起作用，宫颈癌的发生可能还有更多的癌基因参与。     

绿色荧光蛋白基因在小鼠胚胎干细胞中表达效率的影响因素分析

目的：研究绿色荧光蛋白（GFP）基因在小鼠胚胎干细胞系R1中表达的影响因素。方法：构建3个不同的GFP真核表达载体。并从转录,蛋白表达水平比较了它们整合于宿主细胞染色体中的表达效率。结果：在GFP蛋白表达水平上,含肽链延长因子（EF）启动子的表达载体和所转染的克隆明显高于含CMV启动子及含双拷贝CMV-GFP表达单元的表达载体;而录水平与蛋白质水平的测定结果相一致。结论：（1）在NIH3T3和R1胚胎干细胞系中,EF启动子引导下的GFP基因表达效率明显高于CMV启动子;（2）外源基因表达单元的拷贝数在染色体中的少量增加,不能明显提高表达效率;（3）获得了在R1胚胎干细胞系中稳定、高效表达GFP的载体,为后续工作奠定了基础。     

外源性FHIT基因对人胃癌细胞株MGC-803增殖与凋亡的影响

目的：研究三联脆性组氨酸基因（fragile histidine triad,FHIT）对胃癌细胞株MGC 803增殖与凋亡作用的影响,并探讨FHIT基因的抑癌机制。方法：通过脂质体介导把质粒pRC/CMV-FHIT及pRC/CMV转染到有FHIT基因表达缺失的胃癌细胞株MGC-803,用G418对转染后细胞进行筛选,用Western blot对获得G418抗性的细胞进行FHIT基因表达的鉴定。用MTT法、克隆形成试验及流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。 结果：转染FHIT基因的MGC-803细胞有外源性FHIT基因的表达,其增殖活性减弱、克隆形成能力降低、凋亡率增加、生长周期出现明显的G₀/G₁期阻滞,且与对照组差异均有统计学意义。结论：向胃癌细胞中导入外源性FHIT基因可以抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡并引起细胞生长周期阻滞。     

RNA干扰抑制c-myc基因表达对D341细胞增殖的影响

目的探讨应用小干扰RNA（siRNA）技术抑制髓母细胞瘤D341细胞株的c-myc基因对D341细胞的生长、细胞周期及凋亡的变化。方法制备特异性针对c-myc基因的siRNA,转染D341细胞,实时定量RT-PCR、Western blot检测c-myc基因表达情况,流式细胞仪进行细胞周期及凋亡检测。结果siRNA转染D341细胞后,c-myc基因表达在转染后24h抑制效率最高,c-myc蛋白在48h抑制效率最高,并随siRNA浓度的增大,沉默c-myc基因效率增高。RNA干扰抑制D341细胞c-myc基因后,细胞生长停滞于G1期。结论针对c-myc基因的siRNA对D341细胞c-mycmRNA及蛋白有明显抑制作用,细胞生长受到抑制,有望成为髓母细胞瘤的新的治疗途径。     

NP9蛋白的原核表达及纯化

目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）得到NP9基因的编码区序列，克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-Np9，SDS-PAGE电泳和Western blotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达，层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体，该栽体能在细菌内表达出GST—NP9融合蛋白．有效分离得到NP9蛋白．     

nm23H1正反义表达载体的构建

目的;构建ｎｍ２３Ｈ１正反义表达载体ｐｃ３ＡＮ和ｐｃ３ＡＭ。方法：将ｎｍ２３Ｈ１基因正,反向插入质粒ｐｃＤＮＡ３和ｐＲＣ／ＣＭＶ,并转染肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１。结果：转染正义表达载体后ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平增加,转染反义表达载体后ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平降低。结论：构建的载体能在肝癌细胞内有效表达。     

MOLECULAR ANALYSIS OF RADIATION-INDUCED MUTATION IN EXON 7/8 OF RAT HPRT GENE

Objective To investigate the relationship between the radiation dose and the HPRT gene lo-cus mutation in rat smooth muscle cells, and provide the molecular basis for prevention of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTC4). Methods The smooth muscle cells cultured in vitro were irradiated by radionuclide 188Re in different doses. HPRT gene mutation colonies were selected and isolatedby 6-thioguanine. Analysis of mutation in exon 7/8 of HPRT gene were accomplished by polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism. Results The HPRT gene mutation frequency of rat smooth muscle cells that were irradiated by radionuclide 188Re ranged from 5.5× 10-6 to 13 ×10-6. Of 91 HPRT gene mutation colonies, 13 (14.3%) contained exon 7/8 deletion and 15(16.5%) had point mutation.The exon 7/8 mutation frequency was 30.8% . There were significant relationships between radiation dose and mutation frequency of HPRT gene and exon 7/8 . Conclusion The DNA damage and gene mu     

特异点突变型p53 minigene对人肺癌PG细胞的转染效应

目的 观察一种编码密码子１７２＾Ａｒｇ→Ｌｅｕ的特异点突变型小鼠ｐ５３ ｍｉｎｉｇｅｎｅ对恶性肿瘤细胞的转染效应,并探讨该基因恶性肿瘤基因治疗中的潜在价值。     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅰ．重组质粒pN2－LacZ在体外的表达

构建了带有标记基因ＬａｃＺ的逆转录病毒质粒ｐＮ２－ＬａｃＺ。用磷酸钙共沉淀的方法，将ｐＮ２－ＬａｃＺ转染培养的大鼠血管平滑肌细胞，Ｇ４１８筛选得到抗性集落。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，ＬａｃＺ基因已整合到细胞染色体上并转录出相应的ｍＲＮＡ。组化染色和酶活力测定结果表明，外源基因ＬａｃＺ可在血管平滑肌细胞中表达出有活性的蛋白质产物。提示，血管平滑肌细胞可作为心血管疾病基因治疗的靶细胞。     

副神经节瘤c-myc基因及其蛋白表达的初步研究

本文运用免疫组化和原位分子杂交技术对50例副神经节瘤c-myc癌基因及其蛋白的表达进行了检测.免疫染色显示:c-myc蛋白阳性产物位于瘤细胞核内,总阳性率为28%(14/50),包括腹膜后、颈动脉体各6例,纵隔和肾上腺内各1例.8例原位杂交的病例中,5例可见瘤细胞浆内c-myc之mRNA的阳性杂交信号.本研究表明:c—myc的表达,可能与副节瘤的发生或生长状态有关.