蛋白激酶Cα在小鼠胚胎干细胞定向分化中对发育基因表达的调控作用

目的探讨蛋白激酶Cα(PKCα)对小鼠胚胎干细胞(ESCs)定向诱导分化中发育基因(pax-6、slit-2、netrin-1)表达的影响.方法 ES-BALB/c细胞株用无白血病抑制因子(mLIF)的ESCs培养液培养4 d,形成胚胎体(EBs),再分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100 mm的培养皿,经5×10-7 mol/L视黄酸 (RA)诱导后,用神经细胞特异性抗原NSE和NF-200来鉴定分化细胞的类型,在诱导后1、3、5、7及14 d用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定细胞的PKCα和发育基因的mRNA表达情况 ,并观察了PKC激活剂佛波酯(PMA)和PKC抑制剂D-鞘氨醇对它们表达的影响.结果免疫组化发现在诱导后第3 d大多数细胞NSE和NF-200染色阳性,RT-PCR 证实诱导后1 d PKCα、pax-6和netrin-1的mRNA表达急剧下降,3～7 d逐渐升高,至14 d恢复至正常水平,而slit-2在诱导前后均无明显表达.PMA可使PKCα、 pax-6、netrin-1 的mRNA水平在诱导后细胞中的表达明显增强,而D-鞘氨醇的作用相反, 使它们的表达显著降低,而对slit-2无明显影响.结论发育基因pax-6和netrin-1在ESCs定向分化为神经样细胞中有重要的调控作用,可能是通过PKCα信号通路起作用.(中华眼科杂志,2005,41123-127)     

胚胎干细胞定向诱导为结膜上皮样细胞的实验研究

目的：研究体外诱导小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)分化为结膜上皮细胞的可能性及条件，为构建组织工程化结膜提供新型的种子细胞奠定基础。方法：以人结膜上皮细胞作为诱导条件，采用分层共培养的方法诱导小鼠ESC，倒置相差显微镜观察共培养后形态的改变；免疫组织化学法检测诱导后的细胞角蛋白3／12(CK3/K12)、角蛋白13(CKl3)、MUC4和MUC5AC的表达。结果：采用人结膜上皮细胞作为诱导条件，ESC在诱导72h后可见部分细胞显示典型上皮祥细胞形态，免疫组化检测CKl3、MUC4表达阳性，CK3/K12，MUC5AC表达阴性。结论：采用分层共培养的方法，用人结膜上皮细胞作诱导剂可以诱导小鼠ESC向结膜上皮样细胞分化。眼科学报2003；19：117-121     

视网膜色素上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

目的:检测视网膜色素上皮细胞对骨髓间充质干细胞分化的调节作用。方法:体外培养人骨髓间充质干细胞(BMSC)和视网膜色素上皮(RPE)细胞。RPE细胞采用紫外线照射处理,而后与CFSE标记的BMSC共培养14d。并在共培养体系中加入牛眼视网膜提取物(BRE)以研究视网膜成分对此分化过程的影响。采用NSE,Nestin和GFAP抗体标记检测BMSC分化前后的表达特征。结果:BMSC在与RPE细胞共培养后,能够分化成为神经样细胞,并表达神经性细胞的特异性标记NSE,Nestin和GFAP。BRE能够显著促进共培养体系中BMSC向神经样细胞的分化。结论:RPE和BRE能够诱导BMSC分化为神经样细胞。     

视网膜色素上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

目的：检测视网膜色素上皮细胞对骨髓间充质干细胞分化的调节作用。方法：体外培养人骨髓间充质干细胞（BMSC）和视网膜色素上皮（RPE）细胞。RPE细胞采用紫外线照射处理,而后与CFSE标记的BMSC共培养14d。并在共培养体系中加入牛眼视网膜提取物（BRE）以研究视网膜成分对此分化过程的影响。采用NSE,Nestin和GFAP抗体标记检测BMSC分化前后的表达特征。结果：BMSC在与RPE细胞共培养后,能够分化成为神经样细胞,并表达神经性细胞的特异性标记NSE．Nestin和GFAP。BRE能够显著促进共培养体系中BMSC向神经样细胞的分化。结论：RPE和BRE能够诱导BMSC分化为神经样细胞。     

骨髓间充质干细胞向光感受器样细胞和视网膜神经样细胞的分化

目的 探讨与新生鼠视网膜神经细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)的分化情况.方法 体外贴壁培养法分离培养Lewis大鼠BMSC,记录BMSC的增殖情况并进行鉴定;制备细胞爬片并在双层培养板内与新生鼠视网膜神经细胞共培养,观察BMSC的神经存活和分化情况,并行免疫荧光染色鉴定.结果 早期的BMSC分裂较缓慢,第2天进入快速增殖期,细胞生长活跃,大约持续至第5天,细胞分裂进入平台期,增殖缓慢或轻微下降.流式细胞仪显示,90.27％的3代BMSC处于G0-G1期,其余9.73％的细胞处于G2期、S期和M期;93.28％的4代BMSC处于G0-G1期,其余6.72％的细胞处于G2期、S期和M期.流式细胞仪检测示3代和4代BMSC抗原CD90 +/CD45-分别为92％、90％,体外获得了较高纯度的BMSC.MTT法检测共培养后3d、5d、7d的细胞存活率分别为(65.48±9.95)％、(73.56±8.68)％、(76.84±8.65)％,与对照组[(66.14±10.45)％、(70.11±9.60)％、(73.21±6.98)％]比较,差异均无统计学意义(均为P＞0.05).免疫荧光染色显示,共培养组诱导后部分BMSC视蛋白、巢蛋白于3d后、微管蛋白于5d后出现阳性反应,对照组均为阴性.结论 BMSC具有向光感受器样细胞和视网膜神经样细胞分化的潜能.     

胚胎干细胞诱导分化视网膜细胞的方法新进展

视网膜变性疾病是引起视力丧失的重要原因,由于这类眼病的病因不明确、发病机制复杂,目前尚无有效的治疗方法.近年来,干细胞研究领域取得了突破性进展,干细胞具有分化为机体所有细胞的潜能,可以利用胚胎干细胞(ESCs)分化出各种视网膜细胞,这为视网膜变性疾病的治疗带来了新的曙光.ESCs治疗视网膜变性疾病至关重要的一步是将ESCs分化为视网膜光感受器细胞和视网膜色素上皮(RPE)样细胞.本文对自发诱导培养法、共培养法、细胞因子诱导法、单层贴壁诱导培养法和3D诱导培养法等ESCs分化为视网膜光感受器细胞和RPE细胞方法的最新进展进行综述.     

体外诱导室管膜下区神经干细胞分化为视网膜神经细胞样细胞的研究

目的 研究室管膜下区细胞的体外培养及其诱导分化情况。方法 取新生0—3d的SD乳鼠室管膜下区细胞进行体外培养,同时培养视网膜神经细胞。收集视网膜细胞培养上清液,配制成条件分化液,将培养的室管膜下区细胞接种于视网膜细胞条件分化液中,并对诱导的细胞进行免疫荧光鉴定。结果体外培养的室管膜下区细胞在无血清的培养基中生长良好,接种于SD乳鼠视网膜细胞条件分化液中的室管膜下区细胞可分化为视网膜神经样细胞。应用,Thyl.1单克隆抗体行免疫荧光检查,细胞呈阳性反应。结论 在一定条件下室管膜下区细胞能够于体外培养存活,视网膜细胞条件分化液可定向诱导室管膜下区细胞分化为视网膜神经节细胞样细胞,体外模拟眼内环境行室管膜下区细胞诱导,将为进一步的眼内移植提供理论依据。     

视黄酸联合视网膜细胞共培养对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的 探讨胚胎干细胞(ESC)在视黄酸联合视网膜细胞共培养诱导条件下的分化特征。方法 将ESC自液氮中复苏、培养，传1代后进行拟胚体培养。将部分3．5d拟胚体离心重悬后加入含有视黄酸的24孔板中进行诱导，另一部分加入已经培养有视网膜混合细胞的培养瓶中，培养液中同时也加入视黄酸。视网膜混合细胞中仅加入视黄酸未加拟胚体作为对照。倒置相差显微镜下观察细胞在整个诱导过程中形态学的改变并使用免疫细胞化学检测诱导细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、广谱细胞角蛋白、微管相关蛋白-2、视紫质蛋白表达情况。结果 (1)形态学改变仅由视黄酸诱导，诱导细胞呈多种形态；在共培养条件下，绝大多数拟胚体分化出来的细胞形态非常单一，呈透明圆形。部分原贴壁的视网膜细胞出现了明显的网状结构。(2)免疫细胞化学显示两种诱导条件均可见大部分诱导细胞MAP-2阳性，并可见Nestin阳性细胞。共培养诱导尚可见GFAP阳性、Cytokeratin阳性和Rhodopsin阳性的细胞。结论 视黄酸可以诱导大部分细胞成为神经细胞，在视黄酸和与视网膜细胞共培养诱导条件下，可以获得更为纯化的形态一致的神经样细胞，部分诱导细胞表达视网膜细胞的特性。     

视网膜细胞联合bFGF体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）在体外分化为神经样细胞的有效途径,从而解决体外诱导分化效率低及存活状况不佳等问题.方法 采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离BMSC,免疫组化检测CD31、CD44、CD45、CD105表达并对细胞进行鉴定.按照诱导方式的不同分为3组：视网膜细胞＋碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）组、bFGF组、不加诱导液组,分别诱导大鼠BMSC向神经样细胞分化.于诱导后第3、第7、第14天分别进行细胞形态学观察;并采用免疫细胞化学法检测神经微管蛋白-βⅢ（Tui1）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,分析阳性细胞率：采用MTT法检测诱导后BMSC增殖状况,比较细胞存活率.相同时间组间比较用两独立样本t检验,组内不同时间比较用单因素方差分析.结果 形态学观察：视网膜细胞＋hFGF组诱导BMSC 12 h后出现形态变化,逐步形成典型的神经样细胞：bFGF阳性对照组也可见形成突起结构,但无典型的神经样细胞形态.免疫组化检测：处理组诱导3 d后即可检测到阳性细胞,随着诱导时间的延长.Tui1、NSE和GFAP阳性细胞率增加,与阳性对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;阴性对照组未发现阳性细胞.存活率：各组BMSC存活率随着时间延长逐渐下降,但不同诱导方法对BMSC存活无显著影响.结论 模拟视网膜微环境配合bFCF能够诱导大鼠BMSC分化为神经样细胞并继续存活.     

诱导多能干细胞向神经视网膜细胞定向分化的研究进展

视网膜退行性病变是造成视觉损害乃至失明的重要原因,由于成年视网膜组织无法自我更新病变中丢失的细胞,导致视网膜退行性病变具有不可逆性。诱导多能干细胞具有自我更新和多向分化的巨大潜力,是建立疾病模型、研究细胞替代疗法的理想供体。本文重点论述诱导多能干细胞的获取及其向神经视网膜细胞定向分化方面的研究进展,为视网膜退行性病变的实验室研究和临床诊治提供一定参考。     

乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为视网膜神经节样细胞

目的 探讨乳鼠视网膜细胞对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化作用.方法 从出生8 d的大鼠骨髓中分离培养BMSCs,同时培养乳鼠视网膜神经细胞.在Transwell双层培养体系下,利用乳鼠视网膜细胞诱导BMSCs,诱导后细胞经RT-PCR及免疫荧光鉴定.结果 加入乳鼠视网膜细胞共培养第7 d有神经元样细胞形成,经nestin、NF、β-III Tubulin、Thy1.1行免疫组织化学、RT-PCR、免疫荧光鉴定,细胞呈阳性反应.结论 BMSCs在体外培养条件下,经过新生乳鼠视网膜细胞诱导,可以分化为视网膜神经节样细胞.     

人骨髓间充质干细胞分化为上皮样细胞的初步研究

目的 应用猪板层角膜做载体将人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSC)跨胚层诱导为上皮样细胞,甚至角膜上皮样细胞,初步探讨hMSC作为构建组织工程角膜种子细胞的可行性.方法 实验研究.用密度梯度离心培养技术结合贴壁培养法分离纯化hMSC并传代,对体外培养的hMSC进行免疫表型鉴定.将传代后的hMSC接种于去上皮的猪角膜基质片前弹力层表面培养诱导分化,免疫荧光检测角膜上皮细胞标志物角蛋白12(CK12)以及角膜缘干细胞标记物ABCG2和CK19的表达.运用体外培养的方法使种植在前弹力层表面的细胞复层化.待细胞融合形成单层后,置入插入式培养皿中进行气液界面培养.培养4周后进行HE染色及免疫组织化学检测,光镜下观察其复层情况.结果 获得的hMSC可以在体外培养扩增,表现出很强的增殖潜能.流式细胞仪示:培养的hMSC CD45阳性率为0.06%,CD34为0.41%,CD44为86.43%,CD29为85.72%,CD105为90.72%.诱导4周后部分细胞表达CK12和CK19,不表达ABCG2.运用气液界面培养法进行体外复层的结果显示可以形成1～2层的上皮样细胞,并很可能为角膜上皮样细胞.结论 在本实验的诱导条件下,hMSC可以分化为上皮样细胞,并很可能为角膜上皮样细胞,hMSC有可能作为组织工程技术角膜上皮重建的种子细胞的选择.     

蛋白激酶Cα亚型在视网膜视杆-双极细胞发育过程中表达规律的体外实验研究

目的明确新生小牛视网膜视杆-双极细胞体外发育过程中蛋白激酶Cα亚型(PKCα)的表达规律。方法分离培养新生小牛视网膜神经细胞,培养10、20、30和40 d的神经元用于免疫细胞化学染色,采用PKCα抗体标记视网膜视杆-双极细胞,用图像分析系统定量测量阳性细胞的免疫反应强度。结果培养10 d时,PKCα阳性神经元只有1~2个较短的神经突起;到培养20 d时,阳性细胞的一端为1个细长的神经突起,相对的另一端为丛状的短的树状突起,培养30 d及40 d的神经元保持培养20 d时神经元的形态特征。不同培养阶段的阳性细胞中PKCα免疫反应物质均位于细胞体和神经突起,定量分析显示培养20 d的阳性细胞免疫反应强度最高,培养30 d和40 d时阳性细胞PKCα免疫反应强度下降。结论培养20 d的视杆-双极细胞具备细胞形态和免疫反应特性上的成熟特征,PKCα的表达水平最高,为发育成熟的神经元。培养30 d以后,视杆-双极细胞逐渐衰老。实验结果为选择合适的供体材料进行视网膜移植提供了理论依据。     

骨髓间充质干细胞分化为光感受器样细胞的体外诱导和微环境研究

背景 近年来间充质干细胞(MSCs)在眼科方面已成功诱导分化为角膜细胞、视网膜神经节细胞(RGCs)、视网膜神经样细胞等,但诱导成为光感受器细胞及其微环境的研究尚少. 目的 研究骨髓MSCs(BMSCs)在体外定向分化为光感受器样细胞的可能性及其所需的微环境. 方法 分别将第2代BMSCs细胞株和视网膜色素上皮(RPE)细胞株进行常规培养和传代,取第4代人BMSCs细胞株及第3代RPE细胞株用于实验.将BMSCs分为诱导组和对照组,诱导组的BMSCs与含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20 μg/L表皮生长因子(EGF)及20 μg/L脑源性神经营养因子(BDNF)的骨髓干细胞培养基(MSCM)及RPE细胞的条件培养液共培养进行BMSCs的诱导分化,而对照组的BMSCs仅用MSCM培养基进行培养,倒置显微镜下观察分化细胞的形态学变化.采用免疫细胞化学法检测RPE细胞诱导BMSCs3、5、7d时细胞中视紫红质蛋白的阳性表达率,以鉴定分化细胞的表型.采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测RPE细胞诱导BMSCs 5 d、7d时细胞中视紫红质和恢复蛋白mRNA的表达情况. 结果 培养的BMSCs形态均一,呈纺锤形或梭形,RPE细胞形态均一,呈多边形或六边形,细胞内充满色素颗粒,生长良好.诱导后的部分BMSCs呈神经样细胞形态,细胞变圆,突起增长,突起末端可见一级、二级分支,相互间连接呈网状.免疫细胞化学法检测表明,诱导组细胞诱导后第3、5、7天细胞中可见视紫红质的表达,表达率分别为(5.83±0.29)％、(20.36±0.32)％和(29.80±2.30)％,明显高于对照组的(0.71±0.35)％、(2.56±0.24)％和(2.32±0.42)％,差异均有统计学意义(t3 d =41.510,ts d=107.290,t7 d=30.036,P＜0.01).RT-PCR法检测显示,诱导后5d、7d诱导组细胞中视紫红质和恢复蛋白mRNA表达的灰度值均明显高于对照组,差异均有统计学意义(视紫红质mRNA:ts d=103.506,t7 d=122.584,P＜0.01;恢复蛋白mRNA:t5 d=106.674,t7 d=189.992,P＜0.01). 结论 采用含bFGF、EGF及BDNF的条件培养基与RPE细胞培养液体外共培养后BMSCs能够诱导分化成光感受器样细胞.     

蛋白激酶Cα在人角膜基质细胞中的表达

目的 观察蛋白激酶Ca（PKCα）在原位及体外培养的人角膜基质细胞中的表达。方法标本来源于北京大学第一医院眼库。人角膜基质细胞体外原代及传代培养，应用免疫组织化学法检测PKCα在培养的人角膜基质细胞中的表达；制作人正常角膜组织冰冻切片，观察PKCα在角膜基质细胞中的表达。结果免疫组织化学法检测显示：正常人原位角膜基质细胞对PKCα无明显表达，而体外培养的人角膜基质细胞有明显阳性表达。结论特殊的角膜创伤模型——体外培养人角膜基质细胞中PKCα有明显阳性表达，提示PKC在角膜基质细胞增生过程中扮演了重要角色，抑制PKC的活性有可能成为治疗角膜瘢痕愈合的一个新途径。     

胚胎干细胞诱导分化及眼内移植的研究进展

视网膜色素变性及老年性黄斑变性是严重威胁视力的疾病,目前临床上缺乏有效的治疗方法.胚胎干细胞具有无限增生、多向分化的潜力,能定向分化为视网膜前体细胞以及各种神经细胞.胚胎干细胞源性神经细胞的眼内移植为此类痰病的治疗带来了希望,成为近年来该领域的研究热点.本文对近年来不同培养条件对胚胎干细胞定向诱导分化的影响、供体视网膜前体细胞与受体视网膜组织作用的可能机制以及视网膜前体细胞眼内移植的进展进行综述.     

人脂肪组织来源的干细胞体外诱导为角膜上皮样细胞的分化潜能

目的 初步探讨人脂肪组织来源的干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSC)体外诱导为角膜上皮样细胞的分化潜能.方法 分离、纯化、体外扩增hADSC,流式细胞术鉴定所获得细胞的CD29+、CD34-、CD49d+、CD105+、CD106-的表达情况.成脂、成骨诱导鉴定其多向分化潜能.在DMEM/F12体系、KM体系及上述二者等体积混合的KM/DMEM/F12体系内添加不同梯度浓度的生长因子对hADSC进行体外诱导:0μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1、30μg·L-1、40μg·L-1、50μg·L-1的表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF),及50μg·L-1 EGF+10μg·L-1 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和50μg·L-1 EGF+20 μg·L-1 bFGF.连续诱导21 d,观察hADSC形态学的改变及第21天时角膜特异性蛋白AE5(CK3/CK12)的免疫化学表达情况,比较不同培养体系及不同浓度生长因子对hADSC诱导作用的差异.结果 流式细胞仪测定传3-5代的细胞CD34-、CD106-、CD29+、CD49d+、CD105+.成脂、成骨体外诱导14 d后.油红O、碱性磷酸酶染色阳性率分别为74.6%和29.3%.KM体系中加入终浓度为0～50μg·L-1 EGF诱导21d后,hADSC AE5阳性细胞率均占90%以上.其中,40μg·L-1EGF诱导下的AE5阳性细胞率为98.7%,50μg·L-1 EGF可达到100%.而加入bFGF的hADSC 则为AE5弱阳性.而另2个体系对各浓度ECF、bFGF诱导的hADSC的作用均为阴性.结论 人吸脂术废弃液中可获得大量高纯度脂肪组织来源的干细胞,经体外条件诱导具备向角膜上皮样细胞分化潜能.添加EGF的角质细胞培养液有利于其分化,并具有浓度依赖性,bFGF则对分化有抑制性作用.     

蛋白激酶C在缺氧人RPE细胞表达血管内皮生长因子中的作用

目的探讨蛋白激酶C(PKC)信号转导通路在缺氧诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达中的作用。方法在细胞培养液内加入CoCl2溶液以模拟缺氧环境,培养RPE细胞0·5、48h后,用免疫荧光法检测人RPE细胞内PKC的表达。将PKC激动剂佛波醇-12-豆蔻酰-13乙酸(PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液,在缺氧状态下分别培养6、12、24h后,用ELISA检测各组RPE细胞中VEGF的表达。对照组为常氧状态下培养的RPE细胞。结果免疫荧光染色显示缺氧及常氧状态下,RPE细胞浆及胞核内均有PKC的表达。PKC激动剂PMA可增强缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达,而PKC抑制剂Chelerythrine可减弱缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达。结论缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的。     

全反式视黄酸对诱导为神经元样细胞的脐带间充质干细胞分化和凋亡的影响

目的 观察不同浓度全反式视黄酸(ATRA)在诱导脐带间充质干细胞(MSC)向神经元样细胞分化中对细胞形态、增殖、凋亡的作用并筛选其最适诱导浓度.方法 实验研究.取生长良好的第3代脐带MSC接种于24孔培养板,细胞贴壁后培养基更换为含ATRA的DMEM/F-12培养液.ATHA终浓度分别为0 μmol/L(对照组,A组)、0.25 μmol/L(B组)、0.5 μmol/L(C组)、1.0 μmol/L(D组)、2.0 μmol/L(E组)、4.0 μmoL/L(F组),诱导后1 h、24 h观察细胞形态,并应用MTT法监测ATBA的细胞毒性.另取对照组和经各浓度ATRA诱导24 h后的细胞应用Annexin-V/PI联合流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞百分率和双标染色后的细胞着色情况,综合上述指标确定ATRA诱导脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的最适浓度.根据资料性质,对不同浓度ATRA作用24 h后各组间A值、细胞凋亡率进行比较,采用单因素方差分析,并应用t检验进一步进行两两比较;对照组和ATRA诱导组之间神经元样细胞阳性表达率的比较采用配对资料的t检验.结果 与对照组相比,ATRA(0.25 μmol/L、0.5 μmol/L)对MSC形态、细胞增殖、细胞凋亡均无明显影响(t=0.72,1.32;P>0.05);高浓度(4.0 μmoL/L)加入后即刻可见部分细胞浮起,24 h后无贴壁细胞;≥1.0 μmol/LATRA诱导24 h后能极显著抑制细胞增殖(t=8.8,18.9,22.1;P<0.01),且随ATRA浓度增加,抑制作用越明显.诱导24 h后,2.0 μmol/L组细胞回缩较1 h更明显,大部分细胞由长梭形回缩至类圆形,细胞质内出现粗大颗粒,部分细胞漂浮;1.0 μmoL/L组中仅有少数细胞有形态改变;Annexin-V/PI联合FCM检测显示≥1.0 μmol/L组细胞凋亡率与对照组间差异有统计学意义(t=9.88,19.95,31.6l;P<0.01).结论 0.5 μmol/L ATRA是诱导脐带MSC向神经元样细胞转化的最佳剂量,≥1.0 μmol/L能明显抑制MSC的增殖,增加细胞凋亡率并诱导细胞发生明显损伤.     

全反式视黄酸对诱导为神经元样细胞的脐带间充质干细胞分化和凋亡的影响

Objective To evaluate the role of different concentration of all-trans retinoic acid (ATRA)on the morphology,proliferation and apoptosis in inducing umbilical cord mesenchymal stem cells (MSC) into neuron-like cells in vitro,and screen the optimal concentration of ATRA.Methods It was an experimental study.The third passage of MSC was placed in 24-well cell culture plates at a density of 1×104/well.After the adherent of cells,the medium was changed to DMEM/F-12 containing different concentration of ATRA(0.25 μmol/L,0.5 μmol/L,1.0 μmol/L,2.0 μmol/L,4.0 μmol/L)for 24 h respectively.The cells cultured without ATRA were taken as the coutrol group.After another 24 h,the morphologic changes of induced cells were observed by inverted microscope and cell proliferation,apoptosis of ATRA was analyzed using the MTT colorimetric assay.We take another control group and ATRA groups to detect the apoptotic and positive stained percentage of induced cells by Annexin V-FITC/PI combining flow cytometry.The optimal concentration of ATRA was determined by all the above-mentioned index.According to the nature of the material,analysis of variance (ANOVA) was employed for absorption value and apoptosis rate in different concentration of ATRA for 24 h,t test for further comparision between two groups.T-test were also used between the positive expression of induced neuron-like cells and the control group.Results Compared to the control group,ATRA at the concentration of 0.25 μmoL/L did not inhibit the proliferation of umbilical cord MSC obviously(t=0.72.1.32,P>0.05).Part of MSC wele floating instantly at the moment of adding ATRA of 4.0 μmoL/L and no adherent cells were observed after 24 h'culture.Exposed to ATRA at the concentration of≥1.0 μmol/L for 24 h,the proliferation of MSC were significantly inhibited,showing a dose-dependent manner(t=8.8,18.9,22.1;P<0.01).0.5 μmol/L of ATRA did not affect the proliferation of cells and its moephology remained normal;1.0 μmol/L of ATRA affected very few cells;but 2.0 μmoL/L of ATRA cultured for 24 h inhibited the proliferation of cells obviously than 1 h.and the cells increased in size and became flattened.Flow cytometry showed that the rate of apoptosis between the control group and≥1.0 μmol/L groups were significantly different(t=9.88,19.95,31.61;P<0.01).Conclusion In the process of inducing umbilical cord MSC into neuron-like cells,0.5 μmol/L ATRA was the optical concentration.≥1.0 μmol/L ATRA can inhibit the cell proliferation,increase the apoptosis of cells significantly and caused obvious damages.