缺氧和血清剥夺诱导的PC12细胞DNA损伤与修复

探讨 PC12细胞在缺氧 ( 3 7℃ ,5 % O2 ,95 % N2 )、血清剥夺条件下 DNA损伤与修复、凋亡、坏死或生存的变化规律。应用单细胞凝胶电泳技术、流式细胞学技术检测在不同时间点 ,缺氧、无血清培养等诱导下对 PC12细胞单链 DNA损伤与修复、凋亡的影响。结果发现在 PC12细胞 DNA损伤值均在 0 .5 h时达第一个峰值 ,随后下降。 3 h后DNA损伤数值再次逐渐增加并达到最高值。细胞凋亡峰值略滞后于 DNA损伤峰值 ,并于 DNA损伤程度基本相平行。提示 PC12细胞在缺氧和血清剥夺条件下存在 DNA损伤与修复的动态变化过程 ,DNA损伤后可能直接诱导细胞凋亡 ,DNA损伤程度在早期与细胞凋亡程度相一致     

缺氧的血清剥夺诱导的PC12细胞DNA损伤与修复

探讨PC12细胞在缺氧(37℃,5%O2,95%N2)、血清剥夺条件下DNA损伤与修复、凋亡、坏死或生存的变化规律.应用单细胞凝胶电泳技术、流式细胞学技术检测在不同时间点,缺氧、无血清培养等诱导下对PC12细胞单链DNA损伤与修复、凋亡的影响.结果发现在PC12细胞DNA损伤值均在0.5h时达第一个峰值,随后下降.3h后DNA损伤数值再次逐渐增加并达到最高值.细胞凋亡峰值略滞后于DNA损伤峰值,并于DNA损伤程度基本相平行.提示PC12细胞在缺氧和血清剥夺条件下存在DNA损伤与修复的动态变化过程,DNA损伤后可能直接诱导细胞凋亡,DNA损伤程度在早期与细胞凋亡程度相一致.     

缺氧和血清剥夺诱导的PC12细胞NDA损伤与修复

探讨PC12细胞在缺氧（37℃,5％,O2,95％,N2）,血清剥夺条件下NDA损伤与修复,凋亡,坏死或生存的变化规律,应用单细胞凝胶电泳技术,流式细胞学技术检测在不同时间点,缺氧,无血清培养等诱导下对PC12细胞单链DNA损伤与修复,凋亡的影响,结果发现在PC12细胞DNA同伤值均在0.5h时达第一个峰值,随后下降,3h后DNA损伤数值再次逐渐增加并达到最高值,细胞凋亡峰值略滞后于DNA损伤峰值,并于DNA损伤程度基本相平行。提示PC12细胞在缺缺氧和血清剥夺条件下存在NDA务与修复的动态变化过程,DNA损伤可能直接诱导细胞凋亡,DNA缶伤程度在早期与细胞凋亡程度相一致。     

缺氧诱导胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成体外初步研究

目的 通过体外研究初步探讨缺氧可以诱导胶质瘤细胞逆分化形成肿瘤干样细胞.方法 ①采用CD133+细胞免疫磁珠分选法分离胶质瘤细胞得到CD133-细胞群.②缺氧处理CD133-细胞48 h后行免疫荧光染色鉴定肿瘤干细胞样标记蛋白(SOX2,OCT-4,KLF-4,Nanog,CD133)表达情况,并分别缺氧处理0、3、6、9、12、24 h及0、12、24、48、72 h行qRT-PCR及Western blot检测.流式细胞术检测胶质瘤细胞缺氧培养后CD133+细胞比例变化,检测时间为缺氧培养1、3、5、7d.③缺氧处理胶质瘤细胞1、3、5、7d后流式分析细胞周期及凋亡改变.结果 ①荧光检测结果表明,肿瘤干细胞样标记蛋白在CD133-胶质瘤细胞缺氧处理48 h后高表达;qRT-PCR及Western blot检测结果表明,缺氧处理胶质瘤细胞可以明显上调肿瘤干细胞样蛋白表达(P＜0.05),其中qRT-PCR显示SOX-2,OCT-4及Nanog最高表达在缺氧后9h,KLF-4及CD133在缺氧后12h表达最高.Westem blot蛋白检测显示OCT-4最高表达在缺氧后12 h,CD133表达最高在缺氧24h后,KLF-4及Nanog最高表达则在缺氧48 h后,SOX-2在缺氧72 h后表达量最高.另外随着缺氧时间的延长,CD133+细胞数比例逐渐升高(P＜0.05).②细胞周期结果提示缺氧处理肿瘤细胞后,Go/G1期延长,G2/M+S缩短(P＜0.05);凋亡结果提示常氧培养组更易凋亡(P＜0.05).结论 缺氧可以诱导CD133-胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成.     

TDAG51基因在PC12细胞中的过表达及其致凋亡作用

目的　探讨TDAG5 1基因在PC12细胞中的表达及其作用机制。方法　实验分为3组,实验组用绿色荧光蛋白质粒(p EGFP - C1 )载体把外源性TDAG5 1基因转染的PC12细胞;空载体对照组用p EGFP- C1 转染的PC12细胞;对照组未转染任何试剂的PC12细胞。在转染后2 4 h、4 8h、72 h收集细胞,用Western blotting检测过表达的TDAG5 1蛋白;转染后84 h用相差显微镜观察PC12细胞形态的变化;Hoechst332 5 8染色观察细胞核形态变化;检测凋亡执行蛋白Caspase- 3的变化。结果　TDAG5 1基因在PC12细胞中高表达;TDAG5 1基因过表达的细胞与两对照组细胞相比较,胞体变圆,轴突缺失;荧光显微镜下观察PC12细胞可见胞核固缩、染色质凝集,并可见核碎片;前Caspase- 3蛋白活化被切割;活化的17k Da Caspase- 3随TDAG5 1蛋白的作用时间延长而增多。结论　过表达TDAG5 1基因可诱导PC12细胞凋亡。     

β-淀粉样蛋白25-35片段诱导PC12细胞凋亡

目的　探讨 β -淀粉样蛋白 2 5 - 35片段 (Aβ2 5-3 5)对体外培养的PC12细胞的毒性作用机制。方法　用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)代谢率检测 ,光镜吖啶橙荧光染色术 ,透射电镜以及流式细胞仪技术研究Aβ2 5-3 5损伤PC12细胞的途径。结果　用Aβ2 5-3 5处理PC12细胞 2 4h ,Aβ2 5-3 5剂量依赖性地引起PC12细胞的MTT代谢率减少 ,荧光染色及电镜观察发现经Aβ2 5-3 5处理的PC12细胞表现出凋亡细胞的特征 ,流式细胞仪检测发现 ,对照组 2 0 μmol/L及 5 0 μmol/L的Aβ2 5-3 5组PC12细胞的凋亡率分别为 0 .0 8%± 0 .0 1% ,14 .8%± 1.13% ,2 5 .9%± 2 .34%。结论　Aβ对PC12细胞的损伤主要通过细胞凋亡的途径     

基于凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤的模型研究

目的：探索凝血酶合并缺氧对PC12细胞损伤的最佳反应时间点,为进一步研究凝血酶在缺血性脑损伤中的意义提供实验方法。方法建立体外缺氧合并凝血酶诱导的PC12细胞损伤模型。按照常规细胞培养方法,采用三气培养箱（1％ O2,5％ CO2,94％ N2）和无糖DM EM培养液造成细胞缺氧模拟缺血,并同时加入不同浓度的凝血酶（0、50、100、150和200 U／mL ）,再将每组都作用于1、6、12、24 h后,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）分析细胞的存活率、TUNEL法检测细胞的凋亡程度。结果随着缺氧时间的延长和凝血酶浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,TUNEL细胞阳性率和凋亡率逐渐升高。低浓度凝血酶（50 U／mL）在缺氧1 h后,与对照组（0 U／mL）相比细胞存活率有所升高,提示低凝血酶可能有保护作用。尤以缺氧12 h后开始细胞损伤更为明显,150 U／m L凝血酶组作用12 h后与对照组相比细胞存活率显著下降（ P＜0．01）,凋亡率显著增加（ P＜0．05）;且200 U／mL凝血酶作用12 h和150、200 U／mL 凝血酶组作用24 h后细胞存活率与对照组比较差异均有统计学意义（ P＜0．05）。结论150 U／mL凝血酶在缺氧作用12 h后为研究凝血酶合并缺氧对PC12细胞损伤的最佳模型条件。     

米诺环素对PC12细胞缺氧缺糖损伤后神经突生长的影响

目的：探讨米诺环素对大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12）缺氧缺糖（OGD）损伤后细胞存活率及神经突生长的影响。方法分别缺氧缺糖2、4、6h及8h建立PC12细胞OGD损伤模型,将细胞分为正常对照组,OGD组和不同浓度的（0．1、1．0μM和10．0μM）米诺环素治疗组,在缺氧缺糖／复氧24h后,用CCK‐8法检测细胞存活率,免疫荧光法标记MAP‐2并在荧光显微镜下观察神经突的生长,Westernblot法检测各组GAP‐43蛋白的表达水平。结果与OGD组比较,米诺环素能显著提OGD后PC12细胞的存活率［（46．1±2．9）％vs．（77．0±2．5）％,P＜0．01］,促进PC12细胞OGD损伤后神经突的生长,同时上调轴突再生蛋白GAP‐43的表达［（0．34±0．04）vs．（2．11±0．10）,P＜0．01］。结论米诺环素能减轻OGD损伤所致PC12细胞的死亡,并促进细胞神经突的生长。     

华蟾酥毒基抑制人前列腺癌PC3细胞体外增殖研究

目的探讨华蟾酥毒基对人前列腺癌PC3细胞体外增殖和凋亡的影响及其可能存在的作用机制。方法细胞分为不加药对照组,5、50、100、500 nmol/L华蟾酥毒基组,共5组。各组作用于PC3细胞24、48 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测华蟾酥毒基对人前列腺癌PC3细胞增殖的影响。不同浓度华蟾酥毒基作用于PC3细胞48 h后,光学显微镜观察PC3细胞形态变化;克隆形成实验检测华蟾酥毒基对前列腺癌PC3细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术检测华蟾酥毒基作用48 h后各组PC3细胞凋亡情况;蛋白质印迹法检测华蟾酥毒基对髓样细胞白血病-1(MCL-1)蛋白表达的影响。结果 24 h后华蟾酥毒基可在体外抑制PC3细胞增殖(P 0. 01),48 h后华蟾酥毒基对PC3细胞增殖抑制作用更为明显(P 0. 05),华蟾酥毒基对PC3细胞增殖能力有较好的抑制作用,且呈剂量和时间依赖性。细胞克隆形成实验发现,0. 5 nmol/L华蟾酥毒基即可抑制细胞克隆形成(P 0. 05),并且此种抑制作用与药物浓度呈正相关(P 0. 05)。流式细胞术结果显示,0. 5nmol/L以上华蟾酥毒基均可诱导PC3细胞凋亡,随浓度增加凋亡率显著增加(P 0. 01),50 nmol/L华蟾酥毒基干预48 h后,PC3细胞凋亡率为39. 667%;同时光学显微镜下细胞增殖抑制明显,并呈凋亡形态改变。蛋白质印迹法结果显示,不同浓度华蟾酥毒基均可下调抗凋亡蛋白MCL-1蛋白表达(P 0. 01),以50 nmol/L华蟾酥毒基作用于PC3细胞48 h下调MCL-1蛋白表达更为显著(P0. 01)。结论华蟾酥毒基可抑制前列腺癌PC3细胞的体外增殖,并可诱导肿瘤细胞凋亡,其机制可能与抗凋亡蛋白MCL-1表达下调有关。     

DJ-1对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护机制研究

目的 探讨DJ-1基因对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤模型的保护机制.方法 用神经生长因子(NGF)将PC12诱导成神经元样分化的细胞株(多巴胺能神经元).用1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP+)诱导帕金森病PC12细胞损伤模型,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性,DHE染色法检测ROS水平变化.Western blot检测DJ-1和TH蛋白表达变化,RT-qPCR检测α-synuclein和凋亡相关基因的RNA水平.用pCDH1-cmv载体过表达DJ-1后检测DJ-1对MPP+环境中细胞的保护作用.用RT-qPCR检测α-synuclein、p53和Bax的表达变化.结果 160μmol/L的MPP+处理18 h后,PC12细胞活性降低,细胞内ROS水平升高,处理48 h后细胞凋亡增加.DJ-1和TH蛋白表达均明显下调,RNA水平上α-synuclein、p53和Bax表达增加.过表达DJ-1能够保护MPP+中的细胞活性,抑制ROS水平升高.α-synuclein以及凋亡基因p53和Bax的表达升高受到抑制,细胞凋亡减少.结论 MPP+作用于多巴胺神经元,可以下调DJ-1和TH蛋白,促进α-synuclein积累ROS水平升高,并使p53和Bax表达增加,导致细胞凋亡增加.DJ-1基因能够能够在MPP+处理时抑制p53和Bax的表达,减少α-synuclein积累,降低细胞内ROS水平,保护细胞免受MPP+引起的损伤.     

胰岛素样生长因子Ⅰ在低压性缺氧成年大鼠视网膜的表达

目的:探讨成年大鼠在低压性缺氧后,胰岛素样生长因子I在其视网膜的表达情况。方法:成年Wistar大鼠暴露于低氧环境(9%～7%O2)2h后,分别在3h、24h、3d、7d和14d,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应,蛋白免疫印迹法检测胰岛素样生长因子I(IGF-I)在视网膜的表达情况。结果:在暴露于低氧性环境后的3h,24h和3d,成年大鼠视网膜IGF-ImRNA和蛋白质水平均较正常对照组增加(P<0.05),在7d和14d其表达较正常对照组差异无显著性。结论:缺氧可以使成年大鼠视网膜IGF-I的表达上调。     

新生大鼠缺氧／缺血性脑损伤时皮层神经元HIF-1仪的表达与凋亡相关基因P53、Bcl-2的关系

目的：探讨新生大鼠缺氧／缺血性脑损伤时皮层神经元缺氧诱导因子-lot（HIF-1d）的表达及其与凋亡相关基因P53、Bcl-2的关系。方法：新生7日龄SD大鼠随机分为假手术组、单纯缺氧组和缺氧／缺血组,在缺氧或缺氧／缺血后3、6、12、24、72h断头取脑,HE染色观察脑组织病理学改变,免疫组织化学方法检测皮层神经元HIF-10t、P53及Bcl-2表达情况。结果：单纯缺氧组和缺氧／缺血组大鼠脑组织HE染色显示：脑皮层神经元均有不同程度的损伤,于24h时损伤最重,细胞溶解缺失明显;皮层HIF-lot于缺氧／缺血后3h表达升高,12h达高峰,之后呈下降趋势;皮层P53表达高峰较HIF-lot推后,24h达高峰,之后呈下降趋势;Bcl-2表达规律与HIF-la一致。假手术组P53／Bcl-2值约等于1;单纯缺氧组和缺氧／缺血组3、6、12h3个时间点上P53／Bcl-2值小于1,24、72h2个时间点上P53／Bcl-2值大于1。结论：在新生大鼠缺氧／缺血性脑损伤时,HIF-lOL参与了对P53及Bcl-2的调控,在缺氧损伤早期可能具有抗凋亡作用。     

紫外线致Hep—G2细胞凋亡的分子机制初探

紫外线(UV)是人类最常接触的具基因毒作用的因子。为探索紫外线辐射致细胞凋亡和组织损伤的分子机制，本研究采用免疫细胞化学技术与特异性抗体初步探索了经紫外线辐射处理的Hep-G2细胞P53、Caspase3、bcl—2和P21等与细胞凋亡和生长抑制基因的表达情况。结果表明经紫外线辐射处理的Hep-G2细胞的P53、Caspase3和bcl—2基因表达增加，而P21未见明显改变，提示P53、Caspase基因在紫外线辐射诱导的细胞凋亡中起重要作用，bcl—2增高可能有抑制细胞的过度凋亡。保持内在平衡的作用。P21保持不变或下降可能反映了细胞对DNA损伤应答的新途径。     

紫外线致HeP-G2细胞调亡的分子机制初探

紫外线 (UV)是人类最常接触的具基因毒作用的因子。为探索紫外线辐射致细胞凋亡和组织损伤的分子机制 ,本研究采用免疫细胞化学技术与特异性抗体初步探索了经紫外线辐射处理的Hep G2细胞P5 3、Caspase3、bcl 2和P2 1等与细胞凋亡和生长抑制基因的表达情况。结果表明经紫外线辐射处理的Hep G2细胞的P5 3、Caspase3和bcl 2基因表达增加 ,而P2 1未见明显改变 ,提示P5 3、Caspase基因在紫外线辐射诱导的细胞凋亡中起重要作用 ,bcl 2增高可能有抑制细胞的过度凋亡 ,保持内在平衡的作用。P2 1保持不变或下降可能反映了细胞对DNA损伤应答的新途径。     

胰岛素样生长因子Ⅰ在低压性缺氧成年大鼠视网膜的表达

目的：探讨成年大鼠在低压性缺氧后,胰岛素样生长因子Ⅰ在其视网膜的表达情况。方法：成年Wistar大鼠暴露于低氧环境（9％～7％O2）2h后,分别在3h、24h、3d、7d和14d,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应,蛋白免疫印迹法检测胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）在视网膜的表达情况。结果：在暴露于低氧性环境后的3h,24h和3d,成年大鼠视网膜IGF-ⅠmRNA和蛋白质水平均较正常对照组增加（P〈0．05）,在7d和14d其表达较正常对照组差异无显著性。结论：缺氧可以使成年大鼠视网膜IGF-Ⅰ的表达上调。     

常压低氧性肺动脉高压p53基因表达及意义的试验研究

目的研究常压低氧性肺动脉高压大鼠肺内p53基因的表达及探讨肺血管重建（PVR）的分子机制。方法20只雄性SD大鼠随机分为对照组、低氧组,每组10只。采用常压间断低氧8h/d,连续21d的方法来建立常压低氧性肺动脉高压（HPH）模型。用右心导管法检测肺动脉平均压（mPAP）。测量右心室肥厚指数[R.（L＋S）-1]。测量肺血管管壁面积占血管总面积的百分比（MA%）、管壁厚度占血管外径的百分比（MT%）及管腔面积占血管总面积的百分比（VA%）等肺血管形态学指标。用免疫组化方法来检测p53基因在HPH大鼠肺组织表达。结果21d后,低氧组mPAP、R.（L＋S）-1、MT%、MA%及p53基因表达较对照组明显升高（P〈0.01或P〈0.05）,而VA%较对照组明显降低（P〈0.01）。结论HPH大鼠肺内突变型p53基因的表达明显增强,而可能相对抑制野生型p53基因蛋白的表达,导致细胞增殖被促进、细胞凋亡被抑制,从而导致PVR进展,引起肺动脉压力升高,以致发生HPH。     

不同浓度的氯化钴对 PC12分化细胞增殖与凋亡的影响

目的：观察不同浓度的氯化钴（CoCl2）对肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）分化细胞增殖与凋亡的影响,探讨合理的体外化学模拟缺氧模式。方法应用不同浓度CoCl2作用于PC12分化细胞不同时间,建立化学性缺氧诱导细胞凋亡的实验模型;将PC12细胞分为空白对照组、不同浓度不同时间的CoCl2处理组;应用细胞计数、MTT、Hoechst33342/PI双染色法检测不同浓度CoCl2对PC12分化细胞的增殖与凋亡的影响。结果①CoCl2（≤200μmol/L）在6h内使PC12细胞存活率轻度增加,12h后开始出现细胞存活率降低,并呈现比较明显的剂量和时间依赖关系;CoCl2（≥300μmol/L）诱导PC12分化细胞6h即开始出现存活率降低（P＜0．01）;②150μmol/L CoCl2诱导PC12分化细胞24h后细胞数量明显减少（P＜0．01）;③通过荧光显微镜可见150μmol/L CoCl2诱导PC12分化细胞24h内受损细胞多为早期凋亡,48h后开始出现晚期凋亡和坏死细胞增多。结论 CoCl2对PC12分化细胞增殖与凋亡的影响呈时间和浓度依赖性,进行化学模拟缺氧要考虑CoCl2的作用浓度和作用时间。