神经膜细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体的实验研究

目的探索神经膜（旧称许旺细胞）与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体。方法用10μmol／ml BrdU标记体外培养纯化的许旺细胞与ECM凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人T神经桥接体，移植入SD大鼠坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中。S-100蛋门免疫组化染色鉴定许旺细胞，倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白的共培养．石蜡切片抗BrdU免疫组化染色观察体外培养纯化的许旺细胞在体内的生长情况。结果体外培养的许旺细胞能黏附于人发角蛋白上进行良好的生长，移植入神经缺损处4周后，坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中的桥接体内的人发角蛋白开始降解．黏附于该人发角蛋白上的许旺细胞均见成活并分裂增殖。结论许旺细胞可与人发角蛋白进行三维培养．构建成人工神经桥接体．填补神经缺损。     

神经膜细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体的实验研究

目的 探索神经膜(旧称许旺细胞)与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体。方法 用10μmol/mlBrdU标记体外培养纯化的许旺细胞与ECM凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人工神经桥接体,移植入SD大鼠坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中。S-100蛋白免疫组化染色鉴定许旺细胞,倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白的共培养,石蜡切片抗BrdU免疫组化染色观察体外培养纯化的许旺细胞在体内的生长情况。结果 体外培养的许旺细胞能黏附于人发角蛋白上进行良好的生长,移植入神经缺损处4周后,坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中的桥接体内的人发角蛋白开始降解,黏附于该人发角蛋白上的许旺细胞均见成活并分裂增殖。结论 许旺细胞可与人发角蛋白进行三维培养,构建成人工神经桥接体,填补神经缺损。     

IL-1β激活后的许旺细胞与人发角蛋白三维培养构建人工神经桥接体

目的 探索白细胞介素-1β（IL-1β）激活后的许旺细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体,修复神经缺损.方法 体外培养纯化的许旺细胞经IL-1β激活前、后与细胞外基质凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人工神经桥接体,移植入SD大鼠坐骨神经缺损处.S-100蛋白免疫组化染色鉴定许旺细胞,倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白共培养情况,原位杂交法观察人发角蛋白降解及神经生长因子（NGF）在坐骨神经内的表达,移植术4周后检测坐骨神经功能指数.结果 经IL-1β激活后的许旺细胞能更好地黏附于人发角蛋白表面,进行分裂、增殖.3～4周,桥接体内的人发角蛋白开始降解,其周围可见IL-1β激活后的处于增殖分裂期的许旺细胞NGF表达强阳性,坐骨神经功能恢复时间提前.结论 经IL-1β激活后的许旺细胞与细胞外基质凝胶修饰的人发角蛋白复合培养构建成人工神经桥接体,具有修复神经缺损的同时还能够加速坐骨神经损伤后功能的恢复.     

人发角蛋白非神经移植材料的基础研究

①目的 研究人发角蛋白非神经移植材料的解剖学特点和组织相容性，及其对周围神经缺损的修复效果。②方法 Wistar大白鼠18只随机分成3组，将其坐骨神经切取10mm，分别用人发角蛋白非神经移植材料(实验组)、大白鼠自体骨骼肌(对照I组)和未经特殊处理的人发(对照Ⅱ组)连接神经两断端。术后不同时间进行组织形态及解剖学观察。③结果 术后第8周实验组坐骨神经两断端之间出现白色新生组织；第12周白色新生组织出现于移植材料腔隙；第24周移植材料腔隙被充满，人发被初步降解，光镜下可见人发周围有大量呈无序排列的再生神经纤维，透射电镜下可见人发周围雪旺细胞增殖并形成髓鞘。对照组未出现上述变化。④结论 人发角蛋白非神经移植材料的组织相容性好，并可诱导神经纤维再生，是用于修复神经缺损较为理想的材料。     

组织工程化神经的体外构建

目的:体外构建组织工程化神经,为周围神经缺损修复提供新的有效方法。方法:施万细胞与丝素蛋白神经移植物生物反应器中培养7d后,于丝素蛋白神经移植物两端各植入胚胎SD大鼠背根神经节(DRG),继续培养2w,3w和4w,采用免疫细胞化学方法、透射电镜和扫描电镜观察丝素蛋白神经移植物中神经细胞的生长状态。结果:施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共培养2w后,施万细胞和DRG发出的神经突起沿着丝素纤维,呈条带状纵向平行生长;3w后透射电镜观察到髓鞘形成;4w后扫描电镜显示梭形的施万细胞与DRG发出的神经突起呈纵向平行生长,并有类似基质样结构形成。结论:施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共同培养成功进行体外构建组织工程化神经。     

人发角蛋白人工神经的免疫学研究

目的探讨人发角蛋白（HHK）人工神经组织相容性,为周围神经（PN）缺损寻求理想的移植修复材料。方法54只健康成年SPF级雄性Wistar大白鼠随机分为A、B、C三组。A组为实验组,B、C组为对照组。将各组大白鼠右侧胫神经切除10mm,A组用人发角蛋白人工神经桥接;B组将切除神经倒转180°原位缝合;C组用A组大白鼠所切除的胫神经桥接。术后2、8、16周各组随机取6只大白鼠,采血检测免疫球蛋白IgA、IgM、IgG,补体C3、C4,T淋巴细胞亚群及T淋巴细胞转化率。结果术后2、8、16周各组血液免疫学指标比较,A、B两组之间均无显著性差别（F=17．56～571．34,q=0．00～2．09,P〉0．05）,C组与A、B两组比较均有显著性差别（q=7．04～41．47,P〈0．01）。结论人发角蛋白人工神经具有良好的组织相容性,是修复PN缺损较为理想的移植材料。     

人发角蛋白人工腱肌肉植入的组织相容性观察

为了研究人发角蛋白人工腱（human hair keratin artifical tendon,HHKAT）材料在体内的降解及其对周围组织的影响，将12只日本大耳白兔随机分组，在脊旁肌埋藏不同处理程度的人发角蛋白人工腱度件F及Z，用正常人发O做对照，分别在2，6，12，24周取材，观察人发角蛋白的降解及其周围的组织反应，结果：实验中发现不同程度处理的HHKAT其降解速度不同，其中降解最快的F组在24周时已完全吸收，而Z组在24周时只有部分降解，O组未见降解，HHKAT及人发在肌肉组织内无明显的炎症排斥反应，随着HHKAT材料的降解吸收，其周围的组织反应逐渐降低，研究表明人发角蛋白人腱材料具有良好的生物相容性，在体内能够被降解吸收，可根据不同的需要调节其降解速度，是良好肌腱替代材料。     

大鼠坐骨神经切除后人发角蛋白诱导的神经的再生机制

目的 观察人发角蛋白(HHK)诱导坐骨神经再生时的形态学变化,以揭示神经再生机制,方法制备坐骨神经损伤动物模型,植入HHK丝束桥接体,手术后2天、1、2、3、6、9、12周进行组织学观察.结果 术后第2天到2周,大量新生微血管长入HHK植入部位,切除后近远端的施万细胞发生去分化.去分化后的施万细胞沿着HHK丝束表面纵向分裂增殖.术后第3周人发开始降解,HHK周围可见很多巨噬细胞和多核巨细胞,大量增生的施万细胞有规则地排列于HHK丝间,有轴突和大量的微血管出现.术后第6周,在HHK丝周围可见大量新生的神经纤维,其间有微血管分布.术后第9周,人发角蛋白降解显著,再生神经纤维增多,有明显的神经外膜和束膜.术后第12周,实验组人发角蛋白基本完全降解,其部位被新的神经纤维所取代,并已贯通缺损部位,且外观形态接近正常神经.结论 1,HHK对缺损的坐骨神经修复具有良好的桥接作用.2、受损后高度分化的施万细胞通过去分化形成幼稚的施万细胞,其中胞质脱落起着关键作用.3、受损轴突立即发生保护性封闭、脱落.健康轴突形成膨大的带突起的生长锥,生长锥突起上伸出许多丝状生长芽.并与1到多个施万细胞嵌合,它们通过竞争性选择,最后只有一条生长芽可发育成完整的轴突.4、神经纤维屏障膜(神经外膜、束膜及内膜)是由最外侧的血管屏障膜中和束内的微血管间充质细胞演变而成的.总之,施万细胞、神经轴突、神经膜三者的再生模式是自身器官化过程所要求的,它们是同步进行的协调行为.     

人发角蛋白人工腱的临床应用

人发角蛋白人工腱的临床应用纪淑香１万德红１赵鹏２研究证明，人发角蛋白（ＣＱＤ）人工腱可完全替代传统的自体移植肌腱、同种异体移植肌腱和高分子化学合成的人工肌腱〔１，２〕。本文结合１５例病人临床应用体会，探讨ＣＱＤ人工腱的应用特点，使用方法和注意事项，旨...     

人发角蛋白桥接周围神经缺损的功能评价

目的 通过在神经再生室内植入人发角蛋白,观察神经的功能恢复情况,为桥接周围神经缺损寻求新的替代材料.方法 将18只新西兰兔的左侧坐骨神经切断,造成10mm缺损,实验组用人发角蛋白桥接,对照组用空硅胶管桥接,术后检测坐骨神经功能指数、电生理、腓肠肌湿重,观察神经功能的恢复情况.结果 8周时,试验组坐骨神经功能指数值优于对照组(P＜0.01);12周时,试验组坐骨神经功能指数、潜伏期和神经传导速度及波幅明显好于对照组(P＜0.01).结论 人发角蛋白能促进兔坐骨神经功能的恢复是桥接周围神经缺损的理想材料.     

成年兔坐骨神经雪旺细胞的分离纯化培养

目的：探讨从成年新西兰兔坐骨神经分离培养获得大量雪旺细胞的有效手段,方法：利用成年免发生Wallerian变性的坐骨神经用植块法进行培养,通过相差显微活细胞计数和S－100细胞化学标记相结合鉴定了雪旺细胞增值和纯化程度。结果：通过上述方法获得大量雪旺细胞纯度达95％,并绘制其生长曲线,体外培养的雪旺细胞倍增时间为8d。结论：本方法能获得大量高纯度的雪旺细胞,为组织工程修复周围神经缺损打下基础。     

直接植块法构建人胚雪旺细胞人工神经

目的 探索人组织工程神经的构造方法。方法 应用直接植块法将人胚雪旺细胞种植于鼠尾胶包埋的聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物支架上，观察细胞在支架上的吸附迁移和生长情况。结果 直接植块法能在较短时间内使人胚雪旺细胞长满支架表面，且保持良好的功能状态。结论 直接植块法是一种实用的构建人组织工程人工神经的方法。     

FK506对雪旺细胞体外增殖能力的影响

目的 研究普乐可夫(FK506)促进周围神经再生的作用和机制。方法 将纯化的兔雪旺细胞分3组:10μg/L FK506、100μg/L FK506和空白对照组,继续培养10 d,相差显微镜观察计数,绘制各自的增殖曲线。在24和72 h对各组细胞进行流式细胞分析。结果 FK506组雪旺细胞生长良好,而成纤维细胞可以发现细胞肿胀,胞质内出现空泡;活细胞计数对照组雪旺细胞的倍增时间为8d,10μg/L组和100μg/L组倍增时间6.2d。用FK506培养24、72 h后对雪旺细胞增殖的流式细胞分析处于S期的雪旺细胞较对照明显增高(P< 0.01)。结论 FK506有促进体外培养的雪旺细胞快速增殖和抑制成纤维细胞生长的作用。免疫抑制剂FK506的双重作用在神经再生治疗中具广阔的应用前景。     

新生大鼠雪旺细胞体外培养及纯化的方法比较

目的：比较体外培养及纯化雪旺细胞的两种方法。方法：用显微镜观察摄像及S－100免疫细胞化学染色的方法对Ara-c杀灭纯化培养法及分级沉淀培养法细胞的生长态势和纯化率作一比较，结果：分级沉淀培养及纯化SC细胞，生长态势良好且纯化率可达85％－90％，总体效果优于Ara-C杀灭纯化培养法。结论：分级沉淀培养SC可以达到SC体外扩增的目的且可达到一定的纯化率，如要提升纯化率，可再结合Ara-c 杀灭纯化方法或其它方法。     

聚乳酸管注入白芨胶和雪旺细胞修复周围神经缺损的实验研究

目的：研究聚乳酸管注入白芨胶和雪旺细胞对周围神经再生的影响。方法：30只Wister大鼠分为两组，分别在聚乳酸管（A组）注入或不注入（B组）白芨胶和雪旺细胞来桥接单侧坐骨神经10mm缺损。术后第8、12周进行显微解剖学、组织学等检查。结果：A组神经再生明显。结论：白芨胶载雪旺细胞在神经导管内明显地促进周围神经再生。     

人骨髓基质细胞软骨诱导分化及其与细胞载体体外复合

目的：观察出生后入骨髓基质细胞（hBMSCs）在体外培养条件下增殖与分化的特点，探讨其向成软骨方向分化及机制。研究诱导细胞体外与PDLLA/壳聚糖多孔材料复合。方法：密度梯度离心法进行hBMSCs体外培养。应用传五代细胞，经化学限定培养基诱导细胞，设实验对照组。采用倒置显微镜观察细胞增殖及形态变化，甲苯胺蓝染色观察诱导细胞合成细胞外基质中的蛋白多糖，RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA的表达。将诱导的细胞分别与多孔羟基磷灰石、PDLLA/壳聚糖多孔材料复合，应用扫描电镜观察其在细胞载体表面的生长情况。结果：传五代hBMSCs经化学限定培养基诱导后转化成圆形肥大细胞，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原mRNA表达与对照组比较有统计学意义。扫描电镜发现hBMSCs在PDLLA/壳聚糖多孔材料表面增殖良好并分泌大量细胞基质。结论：体外培养hBMSCs经化学限定培养基诱导后可向成软骨方向分化，可作为软骨组织工程种子细胞。PDLLA/壳聚糖多孔复合材料是组织工程良好的细胞载体，有利于细胞的黏附与增殖。     

培养Schwann细胞用于构建毛囊神经嵴干细胞定向分化饲养层

目的培养原代Schwann细胞,用于构建毛囊神经嵴干细胞饲养层构建。探索Schwann细胞（Schwanncells）对胎牛血清浓度的依耐性;检测Schwann细胞在不同血清浓度下的活性及分泌状态,并应用此饲养层定向诱导毛囊神经嵴干细胞分化。方法原代培养及纯化Schwann细胞;用不同血清浓度的胎牛血清（FBS）培养基培养Schwann细胞,测定并用四氮唑盐（MTT）比色法检测Schwann细胞生长及增殖情况;使用$100特异性标识抗体间接免疫荧光法与荧光染料Hoechst33342对Schwann细胞进行鉴定。用ELISA方法检测Schwann细胞的分泌因子。利用丝裂霉素C处理Schwann细胞建立饲养层,培养Schwann细胞和毛囊神经嵴干细胞。结果体外成功培养Schwann细胞,用S100间接免疫荧光法与核染料Hoechst33342鉴定Schwann细胞呈阳性表达,纯度约95％,成功培养毛囊神经嵴干细胞。无血清的培养基可使Schwann细胞生长状态良好。饲养层细胞能够稳定分泌神经生长因子（nerve growth factor,NGF）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）,可诱导毛囊神经嵴干细胞定向分化。结论无血清的培养基更利于毛囊神经嵴干细胞饲养层的构建。饲养层Schwann细胞可持续分泌NGF和BDNF等神经营养因子,可成为使毛囊神经嵴干细胞定向分化的稳定饲养层细胞。     

成年兔雪旺细胞体外培养增殖和纯化的实验研究

目的探讨从成年大白兔周围神经体外分离、纯化、培养的条件，观察雪旺细胞在体外存活、生长情况，目的在于改进雪旺细胞的体外培养条件，寻找一种较好的获取雪旺细胞的方法。方法利用成年兔发生Wallerian变性的双侧坐骨神经，剪碎至1mm的植块，经改良后反复差速贴附法进行培养，应用b-FGF刺激SC增殖；采用相差显微镜下观察雪旺细胞状态计数和S-100细胞免疫组化染色相结合鉴定；绘制生长曲线，按照细胞倍增时间公式计算其倍增时间。结果采用发生Wallerian变性后的兔双侧坐骨神经，经改良后差速贴壁培养方法能够明显抑制成纤维细胞的生长，但对雪旺细胞的生长影响较小，可获得大量高纯度的雪旺细胞，经S-100蛋白免疫组化鉴定，雪旺细胞纯度达94％以上，细胞数量达1×10^6／mL以上；绘制其生长曲线，并计算得出体外培养的第三代雪旺细胞体外倍增时间为3d；一定浓度的b-FGF和NGF可促进雪旺细胞的增殖。结论①联合采用发生Wallerian变性后的神经、改良差速贴壁培养、b-FGF和NGF促进雪旺细胞增殖是一种较经济、简便、实用的方法，可获得较高纯度的雪旺细胞。②本培养方法能够获得大量高纯度的雪旺细胞，可作为周围神经组织工程实验研究的细胞来源。