ltB-TpN47融合基因原核表达系统的构建

目的分别从梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）临床菌株和大肠杆菌DNA中扩增ltB和TpN47基因,构建ltB-TpN47融合基因及其原核表达系统。方法采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增TpN47基因和ltB基因片段、构建ltB-TpN47融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。采用质粒pET32和宿主菌E.coliBL21DE3构建ltB-TpN47融合基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达。结果所构建的ltB-TpN47融合基因核苷酸序列与从GeneBank中查询并处理得出的数据基本一致。所构建的表达系统pET32-ltB-TpN47的目的重组蛋白（rltB-TpN47）表达量高达细菌总蛋白的1/3左右。结论本文成功地构建了ltB-TpN47融合基因高效原核表达系统。     

ltB-TpN47融合基因原核表达系统的构建

目的分别从梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）临床菌株和大肠杆菌DNA中扩增ltB和TpN47基因,构建ltB-TpN47融合基因及其原核表达系统。方法采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增TpN47基因和ltB基因片段、构建ltB-TpN47融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。采用质粒pET32和宿主菌E.coliBL21DE3构建ltB-TpN47融合基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达。结果所构建的ltB-TpN47融合基因核苷酸序列与从GeneBank中查询并处理得出的数据基本一致。所构建的表达系统pET32-ltB-TpN47的目的重组蛋白（rltB-TpN47）表达量高达细菌总蛋白的1/3左右。结论本文成功地构建了ltB-TpN47融合基因高效原核表达系统。     

梅毒螺旋体TpN15重组抗原的克隆与表达

目的：用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN15重组抗原,为进一步研制梅毒螺旋体疫苗和ELISA诊断试剂盒奠定基础。方法：采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN15基因,进行T-A克隆及测序,然后亚克隆到原核表达载体中,以亲和层析法纯化重组蛋白。结果：成功地构建了pET32-TpN15重组表达载体,TpN15重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达。结论：梅毒螺旋体TpN15基因在大肠杆菌中的成功表达为临床检测梅毒感染的新方法和梅毒螺旋体疫苗的研制奠定了基础。     

免疫PCR技术检测梅毒螺旋体特异性蛋白的意义

目的探讨免疫PCR技术检测梅毒螺旋体特异性蛋白TpN47的意义。方法应用PCR法、甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）法和酶素螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）法进行检测,比较三者的敏感性和特异性。分别用棉拭子取患者泌尿道处渗出液或血清为标本,所有操作严格按照试剂使用说明书进行,PCR方法用细菌基因组DNA提取试剂盒提取TP基因组DNA,设计TpN47基因的引物,取PCR扩增产物进行电泳检测,然后进行T-A克隆、亚克隆及测序,进行提纯、分析,TRUST法和TPPA法按常规进行。结果单用三种检测方法 ,检出率无显著差异（P〉0.05）,三种方法的灵敏度、特异性不同,PCR法优于TRUST法和TPPA法（P〈0.05）。结论免疫PCR技术检测TpN47抗原具有较高的敏感性和特异性,值得临床重视,对有效控制梅毒的蔓延和胎传梅毒的发生具有重要意义。     

梅毒螺旋体嵌合抗原的重组克隆与表达

目的 连接梅毒螺旋体特异抗原TpN17和TpN15的基因，克隆并表达此嵌合抗原。方法 PCR分别克隆TpN17和TpN15的基因，利用T4 DNA连接酶将二者连接在一起并插入到pRSET B质粒中，在BL21(DE3)菌株中用IPTG诱导表达。结果 连接的TpN17—15基因，测序结果与GenBank数据吻合。结论 SDS—PAGE电泳中显示表达的目的蛋白与预期的蛋白分子量一致。     

梅毒螺旋体特异性表面抗原的克隆表达与血清鉴定

梅毒病原体为苍白密螺旋体 (Ｔｐ) ,俗称梅毒螺旋体。对Ｔｐ的诊断目前主要依据病史与临床检查 ,辅助以一些血清学方法 ,如血球凝集试验 (ＴＰＨＡ)和荧光抗体吸收试验 (ＦＴＡ ＡＢＳ) [1] 。蛋白分子量 170 0 0与 4 70 0 0是Ｔｐ特异性表面抗原[2 ,3 ] ,患者感染Ｔｐ后能够产生相应的特异性抗体。我们利用基因工程的方法 ,通过大肠埃希菌表达Ｔｐ的 170 0 0与 4 70 0 0特异性抗原 ,以建立一种Ｔｐ血清学诊断方法。一、材料和方法1 分子量 170 0 0与 4 70 0 0基因的扩增 :用蛋白酶Ｋ消化的方法纯化ＴｐＤＮＡ。通过聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩…     

梅毒螺旋体基因分型及临床相关性研究进展

正梅毒是一种典型的性传播疾病,别名杨梅疮,其病原体为苍白密螺旋体,现习惯称梅毒螺旋体(TP)。TP可侵袭宿主全身各个系统和器官,可引起孕妇流产,还可通过胎盘导致死胎和胎传先天梅毒。TP侵袭力极强,可破坏患者表皮或黏膜屏障的完整性,使人类免疫缺陷病毒(HIV)更易进入和排出宿主,从而致使梅毒患者感染或传播HIV的风险增加4~5倍,促进HIV的感染和传播。世界卫生组织2010年统计资料显     

梅毒螺旋体基因重组抗原及其血清学诊断研究进展

梅毒是由梅毒螺旋体也称苍白密螺旋体（Treponemapallidum,Tp）感染引起的传染性强、危害较大的人类性传播疾病。长期以来由于Tp人工培养困难,致使以Tp抗原为基础的血清学研究受到严重制约。随着Tp全基因序列的解释,为基因工程制备Tp抗原开辟了广阔的空间。当前,Tp重组抗原的基因研究已由单基因发展到多表位嵌合基因,部分基因已通过原核生物成功表达,解决了Tp血清学研究的抗原瓶颈问题,使之在血清学检测中得到广泛应用。我们就与血清学诊断相关的Tp基因重组抗原的特性及其临床运用作一综述。     

珠海口岸地区孕妇人群梅毒螺旋体基因分型的初步研究

目的分析珠海口岸地区孕妇人群的梅毒螺旋体感染情况及基因分型,探讨先天性梅毒与梅毒基因分型的关系。方法统计2016―2017年该院建档孕妇的梅毒检测例数为4 414例,其中42例被确诊为现状梅毒,其新生儿有9例患有先天性梅毒。对梅毒阳性患者血液进行巢式PCR检测arp、tpr基因并进行分型。结果 42例现状梅毒孕妇有25例检测出polA基因阳性,9例先天性梅毒患儿检测出7例polA基因阳性;最后综合基因分型14a型2例(6%,2/32),13d型5例(16%,5/32),14d型25例(78%,25/32),其中7例polA基因阳性的先天性患儿和母亲的型别全为14d型。结论珠海口岸地区梅毒流行基因型主要为14d型,同样在先天性梅毒中基因型也是14d型。     

梅毒螺旋体低分子量多肽基因的克隆表达及临床应用

梅毒是由苍白螺旋体(Ｔ)感染引起的一种严重危害人类健康的性传染性疾病。血清学非特异性试验是目前诊断梅毒的主要方法,例如快速血浆反应素试验(ＲＰＲ)、不加热血清反应素试验(ＵＳＲ);应用梅毒螺旋体抗原检测梅毒患者体内的特异性抗体,已被用于确诊梅毒感染,例如荧光螺旋体抗体吸收试验(ＦＡＴＡＢＳ)、梅毒螺旋体血凝试验(ＴＰＨＡ)等,但使用的均为全抗原,由于可能存在的非特异性交叉反应,使上述方法受到一定的限制。因此,研制一种先进且实用的梅毒诊断及普查的方法已成为当务之急。近年来,由于分子生物学技术的普及,几种梅毒螺旋体的主…     

人IL-15成熟肽的原核表达

目的构建人白细胞介素-15(interleukin 15,IL-15)原核表达克隆并在大肠杆菌中表达。方法从经脂多糖刺激的外周血单核细胞中提出mRNA,RT-PCR扩增出IL-15成熟肽前体蛋白基因,构建原核表达克隆(PGEX-4T-2/IL-15)。IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白图谱。Western blot鉴定表达蛋白。结果经酶切和测序分析,表明成功构建了pGEX-4T-2/IL-15原核表达克隆;经IPTG诱导,转化的大肠杆菌表达出相对分子质量(Mr)为42×103Daltons的融合蛋白,且该蛋白能与抗IL-15抗体发生特异性结合反应。结论人白介素-15原核表达克隆的成功构建,并在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用奠定了基础。     

CDCP1胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体。方法以 A549的 mRNA 为模板,应用所设计的引物通过 RT-PCR 法扩增 CDCP1胞外段基因;将 PCR 产物与 pGEX-KG 载体连接,获得重组质粒 pGEX-KG/CDCP1;经双酶切、PCR 及 DNA 序列测定进行鉴定;IPTG 诱导表达。结果①RT-PCR 扩增得到约270 bp 大小的 CDCP1胞外段基因目的片段;②目的片段正确插入到 pGEX-KG 中;③经 IPTG 诱导表达,可见在相对分子质量约35kD 处出现明显的诱导蛋白条带,与预期一致。结论成功构建了携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中获得大量表达。     

bcr／abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建bcr／abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr／abl mRNA和P210蛋白的影响。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列,按照Tusch 1设计原则,选择设计双链小干扰RNA（siRNA）,再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅱ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT—PCR分析bcr／abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果：构建bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117使bcr／abl mRNA的相对水平下降50％,使P210蛋白下降47％。结论：bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr／abl的表达。     

rhTpo／GM-CSF融合蛋白的构建、表达及活性测定

本研究的目的是找出一个治疗由于放化疗等原因造成的造血组织损伤导致的贫血、感染和出血的有效方法。通过RT-PCR的方法从人胎肝中克隆了重组人血小板生成素(rhTpo)的基因,利用基因工程的手段将其与重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的基因相融合,并在原核细胞中表达。研究结果表明,大肠杆菌JM101表达的融合蛋白rhTpo/GM-CSF在体外小鼠骨髓造血祖细胞的培养中保留了Tpo对巨核细胞系和红细胞系的刺激作用,并增加了GM-CSF对粒细胞系的刺激活性。结论提示,原核细胞表达的融合蛋白rhTpo/GM-CSF具有刺激骨髓红细胞系、粒细胞系及巨核细胞系造血的活性。     

Stathmin基因毕赤酵母表达体系的构建及鉴定

目的构建Stathmin基因毕赤酵母表达体系,并对表达产物进行纯化和鉴定,为Stathmin相互作用蛋白的进一步研究提供实验基础。方法通过PCR方法从SKBR3乳腺癌细胞中扩增出人Stathmin基因片段,克隆入毕赤酵母表达载体pPIC3.5K,构建重组载体pPIC3.5K-Stathmin,转化GS115工程菌,经含基因素(G418)的酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基筛选出阳性克隆。用0.5%甲醇诱导表达,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western Blotting鉴定表达产物。结果 DNA测序结果表明,所获基因片段与Stathmin基因序列一致。在含有G418 600μg/mL的YPD培养基上筛选出的pPIC3.5K-Stathmin转化子,经PCR鉴定为阳性克隆。SDS-PAGE可见约37×103处有目的条带表达,经Western Blotting鉴定,此条带为Stathmin蛋白。结论成功构建了Stathmin酵母表达载体,并在毕赤酵母中表达成功,为Stathmin相互作用蛋白研究以及生物治疗药物的制备奠定了基础。