分子生物学技术在肝癌研究中应用

肝癌的发生是有其分子生物学基础的。自80年代以来许多技术相继开发应用到肿瘤的分子生物学研究,并取得了显著的成效。一类主要用于基因组DNA的检测,如肝癌基因和抑癌基因的定位克隆,比较基因组杂交,代表性差异分析;用于cD-NA或mRNA或mRNA水平的技术包括消减杂交、差异显示PCR、cDNA代表性差异分析、DNA芯片及探针微列阵等。这些技术的应用为肝癌的分子生物学研究开拓了一个崭新的领域。一、DNA水平的研究 1.定位克隆癌基因和抑癌基因:利用各种DNA多态性标记对癌基因或抑癌基因进行染色体定     

人肝细胞癌总基因组DNA与c-myc、c-N-ras基因甲基化的改变

分别用两种方法研究了人原发性肝细胞癌总基因组及特定癌基因片段的DNA甲基化情况，并进行对比研究。以3H－SAM掺入法研究总基因组DNA甲基化水平，以限制性内切酶酶切、South－ern吸印法对c－myc、c－N－ras两种癌基因状况进行分析。结果：发现人肝细胞癌区和癌旁区组织内c－myc、c－N－ras癌基因分别有不同程度的低甲基化，且有癌区总基因DNA甲基化水平明显下降。本文结果提示：两种方法检测均发现在人原发性肝癌中存在DNA低甲基化现象，联用两种方法效果优于单一检测者。     

肝癌分子遗传学研究进展

肝细胞的恶性转化涉及到肝细胞基因组内一系列基因的变异和积累。而且其发生与 HBV DNA、HCV RNA整合、癌基因及细胞凋亡基因的表达有关,本文就肝癌分子遗传学研究作一综述。一、乙型肝炎病毒与肝癌大多数与HBV有关的HCC包含有整合到肝细胞染色体中 HBV DNA序列。研究发现,HBV DNA整合在HBV感染的早期阶段发生。目前尚未发现HBV DNA整合到细胞基因组特定的部位。整合过程会引起细胞DNA缺失,某些整合似乎可引起染色体的重排。随机整合的靶序列和染色体部位发生     

鼻咽癌癌基因的分离及其属性的鉴定(简报)

近年来,人们从膀胱癌,肺癌、神经母细胞瘤、肝癌、骨癌等一系列细胞系或癌组织中提取DNA,转染小鼠NIH 3T3细胞,从转化灶中分离出上述肿瘤各自的癌基因。上海肿瘤所曾报告以鼻咽癌活检组织DNA转染NIH3T3小鼠细胞成功,但鼻咽癌癌基因属性迄今未见有报告. 我们用低分化鼻咽癌上皮细胞系CNE-2转染NIH3T3细胞,经二轮转染获得的转化细胞株在软琼     

Gankyrin在肝癌细胞系中的表达

目的检测肝癌细胞系中癌基因Gankyrin的表达。为在肝癌细胞中对Gankyrin基因进行RNA干涉研究的体外实验筛选靶细胞。方法对肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、HHCC进行逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及Western blotting检测。结果Gankyrin基因在3种肝癌细胞系中均有表达。结论多种肝癌细胞系中均有Gankyrin基因的表达，HepG2、SMMC-7721、HHCC均可作为阳性靶细胞，进行Gankyrin基因的RNA干涉研究。     

试析原发性肝癌的生物学基础

从生物学方面研究肝癌的病因和发生机制,可为肝癌的临床治疗及健康预防,找寻确切生物学依据和开辟新的治疗方法。DNA多倍体肝癌的恶性程度高于DNA二倍体肝癌,相应的预后差于DNA二倍体肝癌。肝癌的发生与癌基因、抑癌基因的表达及HBV感染均有关系,癌基因的异常表达及HBV感染促成癌细胞的生成和生长。基于以上认识,在试行产生了免疫治疗、肿瘤基因治疗和RNA干扰技术等新的肝癌生物治疗方法。     

原发性肝癌转化基因的RFLPs研究(Ⅰ) 中国汉族人基因组癌基因N-ras对限制酶Eco RI的RFLPs

用原发性肝癌患者手术切除的肝癌组织的 DNA 和肝癌患者、肝癌患者一级亲属与对照组个体白血细胞的 DNA 以及人工流产胎儿绒毛的 DNA 分别经限制性核酸内切酶 Eco RI 酶解、琼脂糖凝胶电泳分离、Southern 转移、并用~(32)P-标记的癌基因 N-ras 探针作分子杂交,以观察其 RFLPs。结果在中国汉族人基因组癌基因 N-ras 的左段意外地发现4.0kbp,7.8kbp,12.0kbp 等3个未见报告的特异等位片段,而未发现已见报告的8.8kbp,9.0kbp 或9.2kbp 的片段;在该基因的右段则除已见报告的7.0kbp 片段外还获得1个未见报告的12.8kbp 的等位片段。未探查出这些 RFLPs 与肝癌易感性的相关性。     

BGC-ras~H癌基因的转化活性及其与v-myc癌基因的协同作用

BGC-ras~H是从胃癌细胞系BGC-823中分离出的一个癌基因.DNA序列分析证明这一癌基因发生了第12位密码子的点突变.在DNA转染试验中,BGC-ras~H可以高效率地转化NIH3T3细胞,并且可与v-myc癌基因协同转化大鼠初代胚胎成纤维细胞(REFs).转化了的REF细胞具有上皮样形态,接种裸鼠可引起进行性增大直至动物被杀死的肿瘤.这两个癌基因的转染使REFs发生了完全恶性转化.这些结果表明,由胃癌细胞系BGC-823克隆出来的癌基因BGC-ras~H具有很强的转化活性.     

人宫颈癌DNA转化活性及转化基因属性

DNA转化诱导NIH3T3细胞发生转化,是癌基因分离的重要手段。目前已从人的肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤细胞DNA中分离出具有转化活性的癌基因。近年来,我们建立了利用DNA诱导细胞转化和分离癌基因的实验方法,并得到了人宫颈癌DNA诱导的转化细胞,获得人宫颈癌细胞株,为人宫颈癌癌基因     

梯度密度离心法分离肝癌细胞及其转移性细胞株的建立

 【目的】建立新的肝细胞癌细胞系，为肝癌实验研究提供更多纯化癌细胞。【方法】从肝细胞癌患者原发灶和门脉癌栓中获取癌组织，采用Percoll浓度梯度分离癌细胞进行培养，用微环境消化法获取癌细胞克隆并建立细胞系，对培养成功的细胞系进行生长曲线测定、染色体G带核型分析、对比基因组杂交和裸鼠接种成瘤实验。【结果】对20例肝癌组织进行癌细胞分离培养和克隆，成功建立2例细胞系H2M和H4M，这2株细胞均来自门脉癌栓，它们的染色体数目测定均为超3倍体（71．78条）。CGH检测显示H2M主要的细胞遗传学改变为染色体4q、13q、16q、17p和19p缺失和1q、3q、5p、6p、7q和8q扩增，其中有一条标记染色体含有1q和6p[t（1；6）染色体]；而H4M染色体8p，9，13q，16q缺失和6p，7p,11p，11q13扩增，其中有一条标记染色体含有一长的均染区（hsr）。H2M细胞接种裸鼠1个月，产生典型的人肝细胞癌，但H4M接种尚未能成瘤。【结论】Percoll浓度梯度分离癌细胞和微环境消化法取得癌细胞克隆是建立原代细胞系的有效方法。2例肝癌细胞系的建立为以后肝癌研究提供了实验材料，所测出的肝癌细胞系的细胞遗传学改变及在裸鼠接种成瘤．为肝癌细胞癌基因和抑癌基因筛选提供了研究线索和实验模型。     

赶黄草木脂素及黄酮类成分抑制肝癌细胞增殖的作用

目的:研究赶黄草中木脂素类及黄酮类成分体外抑制肝癌细胞增殖的作用。方法:采用MTT法评价赶黄草中8个木脂素(1~8)和5个黄酮(9~13)体外抗人肝癌细胞SMMC-7721和Hep G2增殖的活性以及对正常肝细胞LO_2活力的影响。运用Image-i T DEAD Green/Hoechst 33342荧光双染和高内涵成像分析化合物1对SMMC-7721细胞的影响。结果:化合物1、6、8~11可抑制SMMC-7721的增殖,6、9、11、13可抑制Hep G2的增殖。除化合物11以外,以上化合物对正常肝细胞LO_2均无明显细胞毒作用,且化合物3、4、5、13还可促进LO_2增殖。结论:赶黄草中部分木脂素及黄酮类成分不仅具有抑制肝癌细胞增殖的作用,而且对正常肝细胞无毒作用,甚至可保护正常肝细胞,表现出较好的选择性。     

原发性肺癌染色体比较基因组杂交研究

目的分析原发性肺癌不同病理分类(鳞癌、腺癌和其他类型原发性肺癌)的遗传物质不平衡特征,为寻找肺癌发生发展相关基因、揭示肺癌发病机制提供线索。方法应用比较基因组杂交技术分析55例原发性肺癌患者肿瘤细胞染色体,按病理分类分为鳞状细胞癌组24例(鳞癌组),腺癌13例(腺癌组),其他组18例(腺鳞癌5例、细支气管肺泡癌8例、小细胞癌4例及非典型类癌1例),正常外周血淋巴细胞染色体DNA标本由20名健康男性志愿者提供。结果原发性肺癌鳞癌组常见染色体扩增区是2Q、5P、11Q、22Q,常见缺失区是1P、4Q、5Q、6Q、8P、9P、10Q、11P、13Q、18Q、21Q。腺癌组常见扩增区是5P、8Q、11Q,常见缺失区是10P、19。其他组中,腺鳞癌、肺泡细胞癌、小细胞癌等各有不同。结论原发性肺癌不同病理分型存在广泛的遗传物质不平衡现象,染色体基因扩增和缺失可能是不同类型肺癌发生发展的基础。     

鼻咽癌细胞染色体与自体脆性部位的关系

本实验对12例鼻咽癌实体瘤细胞染色体畸变及同一患者外周淋巴细胞的染色体断裂点与已知的脆性部位作了对比分析,在3例中发现有4个肿瘤细胞染色体断裂点,3p24、3p14、5q31和11ql3与其自体脆性部位重合或相邻。而3p24、3P14和5q31属常见脆性部位,11q13既是常见脆性部位,也与叶酸敏感型罕见脆性部位(11q13.3)相邻。3p24位于癌基因ERBA2区域内,且与癌基因RAF1相邻,11q13与癌基因INT2和SEA的位点重合。     

宫颈癌组织和Siha细胞株HPV16病毒整合位点的检测与分析

目的 利用DIPS-PCR方法建立宫颈癌组织HPV16病毒整合位点图谱,并利用软件分析存在的优势整合位点及整合位点处启动子序列。 方法 细胞培养Siha细胞株,PCR扩增并筛选出单一 HPV16 感染的临床标本,利用DIPS-PCR方法检测Siha 细胞株和单一HPV16 感染的临床宫颈癌标本中病毒整合位点。结果 发现 Siha 细胞株 HPV16 整合位点13q22;宫颈癌组织整合位点在1、3、5、6、8、10、11、13、14、15、17、19及X染色体上,整合位点在染色体的分布是随机的,但其多集中于染色体脆性部位及其附近区域。整合位点多见于1p35.1、5p15.3、10q24、13q21~q22、Xp11.4。利用 CBS prediction servers 和 BDGP Neural Network Promoter prediction软件分析发现整合位点存在高度疑似启动子序列。结论 DIPS-PCR 在 DNA 水平可有效检测宫颈癌组织和Siha细胞株 HPV16 整合位点,整合位点多出现在染色体的脆性位点处,且该脆性部位可能存在某些使病毒癌基因过度表达的启动子序列。     

Chromosomal imbalances revealed in primary rhabdomyo- sarcomas by comparative genomic hybridization

Background Previous cytogenetic studies revealed rhabdomyosarcoma. We profiled chromosomal imbalances aberrations varied among the three subtypes of n the different subtypes and investigated the relationships between clinical parameters and genomic aberrations. Methods Comparative genomic hybridization was used to investigate genomic imbalances in 25 cases of primary rhabdomyosarcomas and two rhabdomyosarcoma cell lines. Specimens were reviewed to determine histological type, pathological grading and clinical staging. Results Changes involving one or more regions of the genome were seen in all rhabdomyosarcomal patients. For rhabdomyosarcoma, DNA sequence gains were most frequently （〉30%） seen in chromosomes 2p, 12q, 6p, 9q, 10q, lp, 2q, 6q, 8q, 15q and 18q; losses from 3p, 11p and 6p. In aggressive alveolar rhabdomyosarcoma, frequent gains were seen on chromosomes 12q, 2p, 6p, 2q, 4q, 10q and 15q; losses from 3p, 6p, lq and 5q. For embryonic rhabdomyosarcoma, frequent gains were on 7p, 9q, 2p, 18q, lp and 8q; losses only from 11p. Frequently gained chromosome arms of translocation associated with rhabdomyosarcoma were 12q, 2, 6, 10q, 4q and 15q; losses from 3p, 6p and 5q. The frequently gained chromosome arms of nontranslocation associated with rhabdomyosarcoma were 2p, 9q and 18q, while 11p and 14q were the frequently lost chromosome arms. Gains on chromosome 12q were significantly correlated with translocation type. Gains on chromosome 9q were significantly correlated with clinical staging. Conclusions Gains on chromosomes 2p, 12q, 6p, 9q, 10q, lp, 2q, 6q, 8q, 15q and 18q and losses on chromosomes 3p, 11p and 6p may be related to rhabdomyosarcomal carcinogenesis. Furthermore, gains on chromosome 12q may be correlated with translocation and gains on chromosome 9q with the early stages of rhabdomyosarcoma.     

乳腺癌病人不同染色体位点上杂合缺失的研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，并配合限制片段长短的多态现象（ＲＦＬＰ）及ＣＡ重复顺序多态性分析，对１５例乳腺癌病人３号染色体短臂３ｐ２４，７号染色体长臂７ｑ３１，１６号染色体长臂１６ｑ２４，３和１７号染色体短臂１７ｐ１３．１杂合缺失（ＬＯＨ）进行了测定。在上述位点分别发现３６％、３６％、２／４和５／９的信息个体呈现ＬＯＨ。其中３ｐ２４和７ｑ３１位点的ＬＯＨ大多发生在临床ＩＩ、ＩＩＩ期、淋巴转移阳性和雌激素受体阴性的肿瘤中。提示３ｐ２４和７ｑ３１位点ＬＯＨ的测定有可能成为乳腺癌病人预后评价的指标。此外，上述四个位点所呈现的较高的ＬＯＨ阳性率也提示乳腺癌抑癌基因在这些位点存在的可能性。     

高加索人和日本人胰腺癌基因组杂合性缺失比较

目的研究胰腺癌细胞基因组范围内的杂合性缺失(LOH),比较高加索人和日本人的异同。方法应用高密度单核苷酸多态性芯片和分析软件,研究12种高加索人和8种日本人胰腺癌细胞株基因组范围内的LOH。结果每一种胰腺癌细胞基因组中都有不同程度的LOH,其中T3M-4细胞频率最高(54.5%);高加索人和日本人胰腺癌细胞株不同染色体臂出现LOH频率不同,高加索人中最常见的LOH是9p(12/12,100.0%),而日本人出现频率最高的是13q(7/8,87.5%)。高频率的(50%以上)共同的LOH出现在染色体臂3p,8p,9p,13q,17p,18q和22q。结论胰腺癌全基因组范围内出现多处LOH。不同种族LOH出现可能频率不同,高频率的杂合性缺失区域可能含有新抑癌基因,为今后胰腺癌的研究提供了新的线索和方向。     

100对自然流产夫妇的染色体分析

本文对100对自然流产夫妇进行外周血淋巴细胞培养、染色体检查、G带核型分析,发现6例异常,占受检人数的3％,包括平衡易位5例,占受检人数的2.6％,常染色体长臂部分缺失1例,占受检人数的0.6％。查阅资料,t(6;8)(q25;q22),t(58)(P15;P21)和t(12;13)(q24;q22)未见报道。对t(13;14),t(6;8)和t(5;8)三例进行家系调查,发现t(13;14)染色体在其家系中至少传递了两代,t(5;8)染色体至少传递了三代。