靶向MICA基因对胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用

目的探讨通过小干扰RNA(siRNA)抑制MICA基因表达对胃癌SGC-7901细胞生长的抑制作用。方法将靶向MICA的siRNA(MICA siRNA)通过脂质体转染法瞬时转染胃癌SGC-7901细胞48 h;Western blot检测siRNA转染前后SCG-7901细胞内MICA蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测MICA siRNA转染对细胞增殖的影响,TUNEL检测siRNA转染对细胞凋亡的影响。结果 MICA siRNA转染干扰SCG-7901细胞内MICA表达,并诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。细胞转染后,MICA蛋白表达降低70%~85%,明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);转染组细胞存活率明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);转染组细胞凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论靶向MICA抑制胃癌SGC-7901细胞增殖并促进细胞凋亡,MICA可用于胃癌基因治疗的靶点。     

靶向GCSsi RNA表达载体与胃癌细胞耐药性

目的构建葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）小干扰RNA（SiRNA）表达载体,观察其对胃癌耐药细胞（SGC7901/VCR）GCS基因表达和耐药性的影响。方法根据siRNA的设计原则,针对人GCS的mRNA序列设计并合成编码siRNA的寡核苷酸序列,并将其克隆入SiRNA的表达载体,构建重组质粒,将重组质粒转染胃癌长春新碱（VCR）耐药细胞SGC7901/VCR,通过蛋白印迹实验（WB）等方法检测转染细胞GCS的表达水平,采用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法检测细胞耐药情况。结果构建的GCS siRNA表达载体经限制性酶切分析,证实释放出的片段大小与预期结果一致;转染SGC7901/VCR细胞后,可使细胞中GCS的表达受抑制,并使细胞对VCR的敏感性增加。结论GCS siRNA表达载体的成功构建及其对GCS表达的抑制和细胞耐药的逆转,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新手段。     

RNAi沉默HIF-1α对人宫颈癌细胞株辐射敏感性的影响

[目的]探讨在乏氧条件下,应用RNA干扰技术沉默HIF-1α基因表达对人宫颈癌细胞株U14辐射敏感性的影响。[方法]构建针对HIF-1α基因的siRNA,将其结合到pSilencer2.1-U6-neo质粒表达载体上,脂质体转染法转入宫颈癌细胞U14,低氧培养后RT-PCR检测HIF-1αmRNA的表达;成克隆实验检测HIF-1α沉默后对细胞辐射敏感性的影响。[结果]成功构建HIF-1α的siRNA真核表达载体,转染宫颈癌细胞后低氧条件下RT-PCR显示HIF-1αmRNA表达明显下调,同时细胞形成的克隆数明显减少。[结论]HIF-1α的siRNA真核表达载体能够抑制低氧条件下HIF-1α基因的表达并提高宫颈癌细胞对γ射线的辐射敏感性。     

psiRNA—hHDEK的构建及其对CasKi细胞生物学特性影响的研究

目的观察DEK基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖、细胞周期及凋亡、衰老的影响,为探索防治人类宫颈癌的新方法提供依据。方法根据siRNA设计原则和Genebank中DEK核苷酸序列,利用软件设计出针对DEK位点的特异性小干扰RNA,克隆至siRNA真核表达载体psiRNA-hHlneo中,应用脂质体介导重组质粒转染宫颈癌CaSki细胞株,用RT-PCR和Western blot检测转染后DEKmRNA和蛋白表达,转染后48hMTr法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期改变、SA-β-半乳糖苷酶细胞化学染色鉴定细胞衰老。结果转染质粒psiRNA—hHDEK组DEKm RNA及蛋白的表达明显减少（0．28±0．02）,DEK基因沉默后CaSki细胞增殖能力下降,细胞周期阻抑,细胞凋亡率增加,衰老细胞增多。结论成功构建表达DEK siRNA的真核表达质粒psiRNA-hHDEK,并能够有效沉默CaSki细胞中DEK基因表达。DEK基因沉默后能够诱导CaSki细胞凋亡和细胞衰老。DEK基因在宫颈癌发生和演变中发挥重要作用,其既是衰老抑制基因,又是凋亡抑制基因。     

Survivin siRNA、HSP70双基因转染对乳腺癌细胞株MCF7 survivin及HSP70表达的影响

目的探讨survivin siRNA、HSP70双基因转染对乳腺癌细胞株MCF7survivin、HSP70表达的影响。方法常规培养乳腺癌细胞株MCF7,将已构建的真核表达载体(pIRES2-EGFP-survivin siRNA、pIRES2-EGFP-HSP70)用脂质体介导转染MCF7细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞,通过western-blot、RT-PCR检测转染后细胞中HSP70蛋白、survivin蛋白及survivinmRNA表达的变化。结果转染空载体与转染真核表达载体的乳腺癌细胞株MCF7于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,证实转染成功。转染真核表达载体的MCF7细胞与转染空载体的MCF7细胞和未转染的MCF7细胞相比,survivin mRNA和survivin蛋白表达水平降低,而HSP70蛋白表达升高。结论 survivin siRNA能有效抑制MCF7细胞内源survivin基因的表达,HSP70能上调MCF7细胞HSP70蛋白的表达,为进一步深入研究survivin siRNA、HSP70双基因对乳腺癌细胞株MCF7生物学特性的影响奠定实验基础。     

RNA干扰hTERT基因对人乳腺癌细胞株MCF-7周期及凋亡影响的研究

目的 观察载体介导的RNA干扰技术能否有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的hTERT的表达及其对细胞周期及凋亡的影响.方法 构建2个针对hTERT基因表达短发夹状siRNA的真核表达载体（pshRNA-hTERT）并转染人乳腺癌细胞株MCF-7,通过RT-PCR检测该基因mRNA,Western blot蛋白质检测,端粒酶活性检测,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡等方法检测RNAi效果,从中筛选出基因沉默效果好的靶位点.结果 转染乳腺癌细胞后,pshRNA - hTERT1,2质粒均能抑制hTERT基因表达,mRNA表达分别下调了54.6%,55.2% 蛋白表达分别下调46.6%,47.8%.端粒酶活性均明显下降.对乳腺癌细胞周期中S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加.结论 RNAi在体外明显抑制乳腺癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖.     

新靶点CyclinE干扰RNA对人脑胶质瘤增殖的影响

目的构建人CyclinE建新靶点的干扰RNA真核表达载体,转染人脑胶质细胞瘤U251细胞,观察CyclinE表达受抑制后的人脑胶质瘤细胞的增殖能力的变化,为进一步研究CyclinE表达受抑制后对人脑胶质瘤细胞质和细胞核蛋白组学的影响及人脑胶质瘤发生、发展、诊断与治疗提供有价值的资料。方法①构建4个新靶点Cyclin E干扰RNA的真核表达载体后,用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定载体构建成功与否。②用Lipofectamine 2000转染4个成功构建的载体到胶质瘤U251细胞株,通过RT-PCR的结果检测转染后CyclinEmRNA表达量,选出干扰效果最好的1个。③用塞唑蓝（MTT）法检测CyclinE沉默后细胞增殖能力的变化。结果①成功构建了4个新靶点的CyclinE干扰RNA真核表达载体,即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4。②CyclinE mRNA表达明显受到抑制,并获得效果最好的CyclinE干扰RNA真核表达载体。③PCyclinE-1-U251组细胞与两对照组相比增殖能力减弱。结论成功构建了新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体,与对照组比增殖能力削弱。     

siRNA抑制IKCa1基因表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的:研究siRNA(small interfering RNA)抑制钙激活性中电导钾离子通道(intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels,IKCa1)表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法:构建含有IKCa1基因的siRNA表达载体,脂质体法转染HeLa细胞,通过RT-PCR和Western Blot检测HeLa细胞IKCa1 mRNA和蛋白表达变化;WST-1检测细胞增殖能力;流式细胞仪分析HeLa细胞周期变化。结果:成功构建针对IKCa1基因的真核表达载体,所获表达载体转染HeLa细胞可使IKCa1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),并能有效抑制HeLa细胞增殖(P<0.05),使细胞周期停留在G0～G1期,S期细胞明显减少。结论:应用siRNA干扰技术能有效抑制IKCa1基因的表达,同时也可有效抑制宫颈癌HeLa细胞体外增殖活性。     

RNA干扰对子宫内膜癌HEC-1A细胞PTTG影响的研究

目的 建立靶向垂体瘤转化基因(PTTG)干扰RNA质粒表达载体,观察对子宫内膜癌HEC-1A细胞PTTG的影响.方法 根据PTTG基因设计3对干扰序列,合成特异性干扰PTTG的siRNA片段,并与pSilencer3.0-Hl载体连接,构建3个PTTG干扰载体(pSilencer3.0-Hl-PTTG-siRNA),分别命名为PTTG siRNA-1、PTTG siRNA-2、PTTG siRNA-3.利用脂质体将其转染子宫内膜癌系HEC-1A细胞,以带有绿色荧光蛋白的真核表达质粒pSilencer3.0-Hl作为转染效率测定组,免疫荧光技术检测转染效率;应用RT-PCR 及Western blot分别检测PTTG mRNA和蛋白表达水平.结果 序列分析法证明构建pSilencer3.0-Hl-PTTG-siRNA质粒成功;RT-PCR和Western-blot分析表明PTTG siRNA-2在mRNA水平和蛋白水平特异性抑制PTTG基因的表达最强.结果 显示HEC-1A细胞阴性对照组荧光表达百分率约为5.3%,转染组荧光表达百分率为74.9%,瞬时转染效率约为69.6%,已经可以满足实验需要.结论 成功构建了靶向抑制PTTG基因的siRNA干扰载体,筛选了干扰效果最强的序列,为进一步实验打下了基础.     

莱菔硫烷抑制人胃癌SGC7901细胞增殖及其诱导凋亡分子流行病学研究

目的研究莱菔硫烷（sulforaphane,SFN）在体外对人胃癌细胞SGC7901的增殖抑制作用,探讨SFN诱导细胞凋亡的分子机理。方法以SFN和人胃癌细胞SGC7901为研究对象。采用四甲基偶氮唑盐比色法观察不同浓度SFN对细胞增殖的抑制影响,AO/EB双重染色法与透射电镜进行形态学变化观察,琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡状态下的DNA变化,RT-PCR检测细胞p21基因mRNA表达。结果 50～150μmol/L浓度范围的SFN对SGC7901细胞的增殖有明显的抑制作用。AO/EB染色结果显示SFN诱导SGC7901细胞凋亡发生形态学上改变。DNA琼脂糖凝胶电泳显示细胞经SFN（100μmol/L、150μmol/L）处理24 h后可见＂梯形＂DNA碎片条带。RT-PCR结果显示50μmol/L SFN能够诱导p21基因mRNA的表达增强。透射电镜观察到SFN作用SGC7901细胞48 h后出现核固缩等早期凋亡镜下改变。结论 SFN能抑制SGC7901细胞的增殖并诱导SGC7901细胞凋亡,可在翻译和转录水平上调p21的表达,其分子机理可能与调控p21基因存在关系。     

miR-24对胃癌细胞株BGC-803及SGC-7901凋亡和增殖的影响

目的 探讨在两株胃癌细胞株BGC-823及SGC-7901中抑制内源性miR-24的表达后对细胞凋亡和增殖的作用.方法 使用INTERFERin转染试剂将锁核苷酸标记的反义核酸miR-24-ASO转染进入胃癌细胞株,使用倒置荧光显微镜观察细胞生长变化,流式细胞计检测细胞凋亡的比例,然后使用CCK-8试剂盒对细胞增殖情况进行检测.结果 转染miR-24-ASO的BGC-803细胞和SGC-7901细胞相对于转染内参的凋亡水平分别增加了约25倍和21倍左右.转染了miR-24-ASO抑制内源性miR-24的表达之后细胞的增殖能力相对于转染阴性对照的细胞株的增殖能力均明显降低.结论 抑制内源性miR-24的表达可以诱导胃癌细胞的凋亡并导致胃癌细胞增殖能力的降低.miR-24调控了胃癌细胞的增殖和凋亡过程.揭示了miRNA在胃癌发生过程中的调控机制,并为胃癌的治疗提供了良好的应用前景.     

构建siRNA慢病毒载体抑制A549细胞株VEGF受体KDR基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR基因的siRNA慢病毒载体,鉴定其对肺癌细胞株A549基因干扰效果。方法设计合成针对KDR编码区的三条siRNA序列及阴性对照序列,克隆到PGCL-GFP载体,构建重组质粒,行PCR鉴定、DNA测序分析;转染人肺癌细胞株A549,Real-Time PCR及Western blot分别检测KDR mRNA、蛋白水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建pGCL/KDR-siRNA重组质粒。A549干扰组KDR mRNA表达率下降,KDR蛋白表达量明显减少,细胞周期改变。结论构建的pGCL/KDR-siRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制A549细胞株KDR基因的表达。     

THY1基因影响上皮性卵巢癌SKOV3细胞株生长的体内和体外实验研究

目的构建THY1基因真核表达载体，并转染卵巢癌细胞株SKOV3，观察重组载体在体内和体外对SKOV3生长的影响。方法本研究于2005年3月至2007年3月通过目的基因克隆、载体构建技术构建重组载体pcDNA3．1（＋）-THY1，转染SKOV3（SKOV3-THY1组），同时设空载体转染组（SKOV3-Null组）和空白对照组（SKOV3组），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）测定法及流式细胞术检测细胞生长及细胞周期变化；并建立雌性裸鼠异体移植卵巢癌模型，观察瘤体生长速率。结果PCR、酶切及DNA测序证实，THY1基因正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），RT—PCR和蛋白质斑迹法（Westernblot）证实重组载体已整合于SKOV3；SKOV3-THY1组细胞抑制率明显高于SKOV3-Null组（P〈0．05）；建立裸鼠致瘤模型4周后，SKOV3-THY1组瘤体体积较SKOV3-Null组和SKOV3组显著降低（P〈0．05）。结论THY1真核表达载体能抑制SKOV3的恶性增殖，THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生发展中起重要作用。     

脂多糖经MyD88／NF-KB信号途径抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒复制

目的探讨Toll样受体4（TLR4）配体脂多糖（LPS）抑制人滋养层细胞Bewo中乙型肝炎病毒（rtBv）复制的作用机制,为防治HBV宫内感染提供依据。方法首先将2txg1．3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3．1（＋）-HBV1．3转染Bewo细胞12h后,以TLR4配体LPS处理3d。尔后用LPS处理Bewo细胞,观察IFN—β、TNF-a表达的动力学、NF—KB拮抗剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）对LPS诱导Bewo细胞产生细胞因子的作用。采用微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测HBsAg、HBeAg和HBVDNA水平,并以ELISA和RT—PCR分别检测IFN-β、TNF—a水平及TIR结构域的转接蛋白（TRIF）、髓样分化蛋白（MyD88）表达。结果与对照组比较,LPS可显著抑制Bewo细胞中HBV复制（P〈0．01）,且LPS可显著诱导Bewo细胞产生TNF-a（P〈0．05）,呈时间和剂量依赖性。PDTC可抑制LPS诱导细胞产生TNF-a,显著低于对照组（P〈0．01）,但对IFN—β无显著作用（P〉0．05）。与对照组比较,LPS可诱导HBV重组质粒转染的Bewo细胞表达MyD88（P〈0．01）。结论通过MyD88／NF—KB信号途径诱导Bewo细胞产生TNF—a,TLR4配体LPS可显著抑制HBV复制。     

Livin在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨Livin在乳腺癌组织中的表达及与临床病理参数的关系。方法 2011年7月—2012年8月收集45例乳腺癌和40例正常乳腺组织标本,应用RT-PCR和免疫组化SP法检测45例乳腺癌及40例正常乳腺组织中Livin mRNA和蛋白表达情况,分析Livin表达与临床病理参数的关系。计数资料采用χ2检验,对Livin表达与临床病理参数间的关系采用Spearman分析,P0.05为差异有统计学意义。结果 Livin mRNA和蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率分别为80.00%和75.56%,明显高于正常组织(7.69%),差异均有统计学意义(均P0.05)。Livin在乳腺癌中的阳性表达与年龄、肿瘤大小、组织类型、临床分级及淋巴结转移无关(P0.05)。结论 Livin在乳腺癌组织中表达上调,其过表达可能与乳腺癌的发生发展有关。     

TGF-βⅡR单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白携带miR-29b抗肝纤维化的研究

目的 观察TGF-βⅡR单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白(简称新型载体)携带miR-29b对体外培养肝星状细胞(HSC)的转染效率和治疗效果,为今后肝纤维化基因治疗提供新载体.方法 脂质体、新型载体和慢病毒携带miR-29b治疗体外培养的HSC,荧光显微镜和流式细胞术观察转染效率,实时荧光定量RT-PCR和Western Blot技术分析collagen α(1) (Ⅰ) mRNA和蛋白表达水平.结果 与对照组比较,慢病毒组的转染效率最高,为70％;其次为新型载体组,为58％;最后为脂质体组,为29％.各载体组collagen α1(Ⅰ) mRNA表现出不同的下降,与对照组比较,慢病毒组下降70％(t=6.316,P＜0.01),新型载体组为50％(t=4.082,P＜0.01),脂质体组为38％(t =3.014,P＜0.05).各载体组collagen α1 (Ⅰ)蛋白也表现出不同的下降,慢病毒组下降为59％(t=4.209,P＜0.01);新型载体组为41％(t =4.033,P＜0.01;);脂质体组为27％(f=2.842,P＜0.05).结论 笔者构建的新型载体具有较高的转染效率,并且携带miR-29b具有较好的抗肝纤维化效果.     

Livin和Survivin在尖锐湿疣组织中的表达和意义

目的：探讨凋亡抑制蛋白Livin和Survivin在尖锐湿疣（CA）组织中的表达及意义。方法：采用免疫组化SP法分别检测Livin和Survivin蛋白在56例CA组织和18例正常上皮组织中的表达。结果：尖锐湿疣组织中Livin和Survivin蛋白阳性表达率分别为82.14%（46/56）、85.71%（48/56）,正常人对照组分别为22.22%（4/18）、38.89%（7/18）;尖锐湿疣组织中Livin和Survivin蛋白阳性表达强度多为（＋＋）-（＋＋＋）,正常对照组多为（-）-（＋＋）。两组Livin和Survivin阳性表达率及表达强度差异均具有统计学意义（P〈0.05）。尖锐湿疣组织中Livin和Survivin表达呈负相关（r=-0.634,P〈0.01）。结论：尖锐湿疣组织中存在Livin和Survivin过表达,Livin和Survivin的过表达可能对尖锐湿疣的发生发展有一定作用。