GATA-4、NKx2-5转录因子的研究进展

转录因子GATA家族是能与核酸共同序列(A/T)GATA(A/G)结合的细胞核转录因子,包括6个成员,即GATA-1、-2、-3、-4、-5和-6。1995年Huang等[1]通过筛查人类心脏cDNA文库首次克隆出人类GATA-4 cDNA,以后相继在人类肺、肝脏和小肠等器官中检测到GATA-4 mRNA和蛋白的表达。人们应用果蝇同源结构域(homeodomain,HD)寡核苷酸探针筛查果蝇cDNA文库,克隆出NK型同源盒基因,随后分离出一种与果蝇背侧血管/心脏发育密切相关的果蝇NK-2型基因tinman基因。GATA-4和NKx2-5是目前研究较多的与心脏发育密切相关的转录因子。     

凝血IX因子复合物的研制

目的:提高IX因子复合物的活性收率和IX因子复合物的血栓安全性.方法:采用国产DEAE-sepharose fast flow胶离子交换层析及Ca3(PO4)2吸附法,从新鲜冰冻血浆中直接制备凝血Ⅸ因子复合物.结果:二步的收率分别为(76.42±4.48)%和(74.31±3.17)%,制品的FⅨ:C的比活比传统Ⅸ因子复合物提高了约20倍.结论:新的制备工艺可行.     

携带突变型人IκBαDN cDNA重组嵌合腺病毒Ad5F35的制备与表达

目的 制备携带突变型人核转录因子κB抑制蛋白α(IκBα)cDNA的重组5型和35型嵌合腺病毒(Ad5F35),并分析其表达.方法 应用DNA重组技术,从含有突变型人IκBα(IκBαDN)cDNA的重组逆转录病毒载体pCLX-IκBαDN克隆IκBαDN cDNA到pDC316载体以构建pDC-IκBαDN并随即制备携带IκBαDN cDNA的重组嵌合腺病毒Ad5F35.转染HL-60细胞后,通过实时定量PCR分析IκBα的表达.结果 通过DNA重组技术,将IκBαDN cDNA成功克隆到pDC316载体.DNA序列测定显示,重组pDC-IκBαDN载体内携带有无其它突变并具有正确阅读框架的人IκBαDN cDNA.转染HL-60细胞48h后,HL-60细胞IκBα mRNA表达增加.结论 成功制备到含有人IκBαDN cDNA的重组嵌合腺病毒Ad5F35,并能够在HL-60细胞有效表达IκBα.     

用ssRNA探针检测水中的甲型肝炎病毒和其他肠道病毒

检测饮用水和食物中的甲型肝炎病毒(HAV)和其他肠道病毒需要敏感而特异的方法。将编码HAV和柯萨奇病毒B3(CB3)基因组5′端1个Kb的cDNA克隆亚克隆到T7/SP6 RNA转录载体上,从T7启动子转录的     

用超滤法灭活病毒的因子IX浓制剂治疗的病人中很少出现抗细小病毒B19抗体[英]

人细小病毒B19(B19)是一种耐热的无脂质包膜病毒,可由经病毒灭活过的因子Ⅷ(FⅧ)或因子Ⅸ(FⅨ)浓制剂传播.因此,在输注FⅧ或FⅨ浓制剂的先天性出血性疾病     

抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α) 真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因。方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3．1(-) -IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析。结果:构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200-1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列。结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据。     

麻疹病毒核蛋白在大肠杆菌中的表达:用缺失突变株定位抗原性位点

麻疹病毒(MV)的核蛋白(NP)由525个氨基酸组成,作者克隆了其中502个氨基酸序列的cDNA.将得到的cDNA进行如下处理:先用核酸外切酶Ⅲ从3'端外切消化,然后用限制性内切酶去除内部片段(但保留解读框架),将经过删除的cDNA克隆到质粒pRIT上,在大肠杆菌中表达出A蛋白-MVNP融合蛋白.对表达的蛋白进行纯化后,用蛋白印迹法进行分析.     

骨质疏松骨组织差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的构建抑制差减文库,为克隆、筛选骨质疏松骨组织中失活或低表达的致骨质疏松相关基因奠定基础.方法分别从小鼠正常骨和骨质疏松骨组织分离mRNA,合成双链cDNA,酶切后骨质疏松cDNA分成两组,分别与不同的接头连接.应用抑制性削减杂交(SSH)技术,分别以正常骨组织与骨质疏松小鼠cDNA作为检测子(tester)与驱赶子(driver),在通过两轮差减杂交和两次抑制性PCR得到两者之间的差异表达的cDNA,将所获得差减cDNA片段克隆入质粒表达载体(PointTM Xa-1 T-Vector),转化大肠杆菌JM109,挑取克隆进行PCR扩增鉴定插入片段.结果成功地构建了骨质疏松相关的的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含576、322个重组子;插入片段的平均大小为5 30bp.结论该差减cDNA文库的建立为进一步筛选、鉴定骨质疏松发生过程中的相关调控基因奠定了基础.     

木榄甘油醛-3-磷酸脱氢酶全长cDNA的克隆及其序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是糖酵解过程和卡尔文循环中的关键酶,在糖代谢和能量代谢过程中起着重要的作用。为揭示GAPDH在植物耐盐过程中的作用,研究了从前期构建的盐胁迫下木榄幼叶cDNA文库中克隆到编码GAPDH的cDNA全序列,并对其编码蛋白的理化性质、结构特点和空间分布特点进行了分析。序列分析结果表明:木榄GAPDH的cDNA全长为1482bp,编码区为1218bp,编码一个由405个氨基酸残基组成蛋白质,理论Mr为43.4k,理论等电点(pI)为8.65。基于该蛋白的氨基酸序列分析基础上的系统发育分析表明木榄的进化地位与毛果杨较为接近。结构分析和预测结果显示:木榄的GAPDH为无信号肽和跨膜区的亲水性蛋白,含有GAPDH的保守结构域NADB-Rossmann(71-222aa)和Gp_dh_C(227-383aa)。同源模建分析结果表明:该蛋白与菠菜相比具有1个高度保守的活性区,该活性区由第70～405氨基酸残基组成。     

sTRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆TRAIL基因的95-281位(sTRAIL)，构建表达载体，建立原核表达体系，优化诱导表达的条件。分离人外周血淋巴细胞，提取总RNA，RT-PCR，克隆sTRAIL的cDNA，构建原核表达载体，优化IPIG诱导的条件。结果：(1)克隆了TRAIL基因95-281位的cDNA，DNA测序结果与报道的一致。(2)构建了sTRAIL基因的原核表达载体，酶切结果与预期的一致。(3)转化宿主菌，优化IPIG诱导条件，发现3mmol/L，诱导3～4h表达最好。sTRAIL基因的克隆及表达为下游中试发酵及纯化奠定了上游的基础，也为研究TRAIL抗肿瘤的机制提供了可能。     

大鼠脑源性神经营养因子基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达序列,构建大鼠BDNF基因真核表达载体.方法 以RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增BDNF cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-BN,以限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为783bp特异片段,重组质粒酶切后产生783bp和5.2 kb的片段,DNA测序证实783bp片段的碱基序列与大鼠BDNF基因序列完全一致.结论 成功克隆大鼠BDNF基因表达序列并构建了BDNF基因真核表达栽体pcDNA3-BN.     

碳酸酐酶Ⅸ和血管内皮生长因子在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

目的 探讨碳酸酐酶Ⅸ(CA Ⅸ)和血管内皮生长因子(VEGF)在膀胱移行上皮癌的表达和意义.方法 应用免疫组化技术,检测膀胱移行上皮癌和正常膀胱粘膜中CAⅨ和VEGF的表达,结合临床病理资料进行分析.结果 56例膀胱移行上皮癌标本中,CAⅨ阳性表达47例(8 3.9%),VEGF阳性表达49例(87.5%),主要位于膀胱腔面及坏死区周围癌细胞,10例正常膀胱粘膜中未见CAⅨ和VEGF表达.CAⅨ在G3级的阳性表达率高于G1、G2级(P＞0.05),在T2-4组高于Tis-1组(P＜0.05),VEGF在T2-4组高于Tis-1组(P＜0.05).CAⅨ和VEGF的表达存在正相关性(P＜0.05,r= 0.54 3).结论 CAⅨ和VEGF参与膀胱癌的发展过程,进展期的膀胱癌具有较高的CAⅨ和VEGF表达,二者存在正相关性,缺氧和血管再生是恶性肿瘤的重要标志.     

肿瘤化学治疗的研究 ⅩⅦ.5-烷氧基和5-取代苯氧基嘧啶化合物的合成

本文报导了一系列5-烷氧基和5-取代苯氧基硫氧嘧啶(Ⅳ,Ⅴ)、5-烷氧基和5-取代苯氧基尿嘧啶(Ⅵ,Ⅶ)、5-烷氧基-和5-取代苯氧基-4-徑基-2-羧甲硫基嘧啶(Ⅷ,Ⅸ)及5-取代苯氧基-2-氨基-4-羟基嘧啶(Ⅹ)等化合物的合成,以进行抗肿瘤試驗. 初步药理試驗結果显示:化合物(Ⅳ₁),(Ⅳ₄),(Ⅴ₄),(Ⅴ₆),(Ⅴ₇),(Ⅵ₃),(Ⅶ₈),(Ⅶ₁₅),(Ⅶ₁₆),(Ⅸ₇)和(Ⅹ₁)对肉瘤180有明显的抑制作用.     

hPARP-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆

目的 克隆及构建含限制性内切酶位点BamHⅠ、SacⅠ的人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(hPARP-1)基因cDNA翻译起始区域的pGEM-T-S载体，为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料。方法 采用RT-PCR方法，用正常人胚肺成纤维细胞(HLF)抽提的总RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增hPARP-1基因片段，并直接与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α，用蓝(白)斑试验筛选出阳性克隆，抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定，再行序列分析。结果 经RT-PCR获得507bp含限制性内切酶位点的阳性产物，T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实，克隆片段与Genbank中该基因的序列同源性为99．9％。结论 该实验成功地构建了含hPAR-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆，为亚克隆及缺陷细胞株的建立提供工具。     

重组人肿瘤坏死因子的抗肿瘤作用

1.在体外对癌细胞的细胞毒作用作者制备了一种重组人TNF(rHu-TNF)并研究了其在体外对癌细胞的细胞毒性。 rHu-TNF cDNA克隆编码与由人肺泡巨噬细胞分得的Poly(A)mRNA所制备的cDNA克隆编码完全吻合。rHu-TNF是由150个氨基酸残基组成的多肽。将rHu-TNTcDNA重组于质粒,在大肠杆菌中增殖。纯化后的rHu-TNF分子量约为17,700道尔顿(SDS-聚丙烯酰胺电泳测定),等电点5.9,抗     

在分子遗传学基础上研制新脊髓灰质炎病毒疫苗

本文报道用电子计算机分析3个型的脊髓灰质炎病毒(PV)Sabin疫苗株和Ⅰ型Mahoney株[PVI(M)]毒粒RNA全部核苷酸序列的结果,并讨论病毒的基因结构与其生物学性质之间的关系。病毒基因组序列分析方法:从纯化的PV毒粒RNA合成病毒基因组的双链cDNA,经HindⅢ酶处理,并嵌入到PBR322克隆载体的适宜位置,筛选克隆,用Maxam等法测定克隆cDNA核昔酸序列,对非克隆DNA基因组的5′末端序列也作了测定。结果:Ⅰ型脊髓灰质炎Sabin株[PV1(sab)]的毒粒RNA分子有7,441个核苷酸长度,PV2(sab)有7,439个,PV3(sab)有7,434     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBVe抗原结合蛋白1反式激活基因

目的：筛选与克隆HBe抗原(HBeAg)结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因。了解其可能存在的调节功能线索。方法：应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因．以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞。以空载体pcDN3．1(-)为平行对照。制备转染后的细胞裂解液。提取mRNA并逆转录为cDNA。经RasI酶切后。将实验组cDNA分成两组。分别与两种不同的接头衔接。再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)。将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增。随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析．结果：成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库．文库扩增后得到85个阳性克隆。进行菌落PCR分析。均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序。并通过生物信息学分析获得其全长基因序列。结果共获得14种编码基因。包括13种已知基因和1种未知基因．结论：筛选到的cDNA全长序列。包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。推测。HBEBP1可能存在的调控机制的线索。